牛分枝杆菌融合基因hsp65-esat6的原核表达及产物的纯化

以牛分枝杆菌ValleeⅢ株基因组DNA为模板扩增hsp65和esat6基因。采用重叠延伸剪接技术（SOE）获得了融合基因hsp65-esat6，将hsp65-esat6连接到原核表达载体pET32a（＋）上，构建重组质粒pET65-E6，将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，以IPTG诱导（终浓度为1mmol／L），表达产物进行SDS—PAGE分析。以Ni^2＋亲和层析柱纯化表达的融合蛋白和Western—blot分析该融合蛋白的免疫活性。结果表明：Hsp65-ESAT6融合蛋白以包涵体形式表达。表达的融合蛋白裂解为两部分，即58ku和30ku，二者相加与预测大小88ku相符。纯化的融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应。     

牛分枝杆菌融合基因ESAT6-MPB63-HSP65的原核表达及鉴定

以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板,PCR扩增ESAT6、MPB63和HSP65基因,将其依次定向克隆入原核表达载体pET-32a (+),构建重组质粒pET-E6-M63-H65,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞,1 mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,以Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting 分析。结果表明,rESAT6-MPB63-HSP65融合蛋白为可溶性表达,且大小与理论值相符,纯化的融合蛋白能够与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应,为进一步的诊断学研究奠定了基础。     

布鲁氏菌外膜蛋白16基因的克隆及原核表达

为了成功克隆外膜蛋白16(outer membrane proteins 16, Omp16)基因并对其进行原核表达,试验根据GenBank中羊布鲁氏菌M5-90株外膜蛋白Omp16基因序列(登录号:JF918760.1)设计1对引物,从布鲁氏菌基因组中扩增出大小约为507 bp的目的基因片段,凝胶回收纯化目的片段,连接入pMD20-T质粒,转化E.coli DH5α并测序,测序正确后再亚克隆入pET-28a(+)表达载体,构建重组质粒pET-Omp16,转化入E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导其表达,最后用Western blotting分析方法鉴定诱导得到的蛋白。结果表明,成功构建了pET-Omp16原核表达载体,并在E.coli BL21中表达了Omp16基因,诱导得到的蛋白经鉴定与目的蛋白大小一致,证明成功表达了目的基因。     

牛分枝杆菌溶血磷脂酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

为研究牛分枝杆菌(M.bovis)溶血磷脂酶基因在致病机理中的作用,本研究构建了表达M.bovis的溶血酶(LIP)基因的重组质粒pET30a-LIP,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白表达量占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达95%以上;免疫印迹实验表明,原核表达的蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,具特异的免疫反应性。     

犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因的原核表达

克隆了犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31基因并构建原核表达系统,并对表达产物进行了初步的血清学鉴定。利用PCR技术扩增犬布氏杆菌RM6/66参考株Omp31基因,然后将其克隆到pGEMT-easy载体上进行测序。测序正确后,将该基因插入到pET-32a载体中构建原核表达载体,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,诱导表达融合蛋白,Western blot分析融合蛋白的免疫反应性。结果构建了犬布氏杆菌Omp31基因的原核表达载体pET-Omp31,并且在大肠杆菌中成功表达融合蛋白,经Western Blot鉴定该蛋白能被犬布氏杆菌阳性血清所识别。犬布氏杆菌外膜蛋白Omp31的表达成功,为犬布氏杆菌病血清学诊断方法的建立提供了基础资料。     

牛分枝杆菌Mb1230基因的表达纯化及其活性评价

为了探究牛分枝杆菌Mb1230蛋白在牛结核病诊断中的应用价值,本试验利用PCR方法扩增出Mb1230基因,构建重组质粒pET-22b-Mb1230,经IPTG诱导表达后用亲和层析纯化重组蛋白,通过结核菌素皮内变态反应试验(TST试验)、IFN-γ释放试验(IGRA试验)和间接ELISA对重组蛋白的活性进行评价。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,重组蛋白大小与理论值相符,且能与鼠抗His的抗体反应有特异性条带;在TST试验、IGRA试验和间接ELISA中也表现出抗原活性。结果表明,重组Mb1230蛋白具有良好的B细胞活性和T细胞活性,在牛结核病诊断中具有应用潜力。     

结核分枝杆菌ACR蛋白的原核表达及纯化

为获得区别结核感染状态的血清学鉴别诊断试剂的抗原,根据GenBank中登录的结核杆菌H37Rv的ACR基因序列设计1对引物,以热灭活的结核杆菌H37Rv菌悬液为模板,PCR扩增得到ACR基因DNA片段.将扩增片段克隆于pGM-T载体中,得到载体pGM-T-ACR.分别将pET32a质粒和pGM-T-ACR质粒用限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切,并将纯化的ACR基因亚克隆至pET32a中,获得重组表达质粒pET32a-ACR.将其转化E.coli BL21 IPTG诱导后,经SDS-PAGE、western blot分析鉴定,可见约34 ku的外源蛋白带.表明ACR基因在大肠杆菌中得到了表达.用Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的ACR融合蛋白.     

牛分枝杆菌mpb64和Ag85B融合基因在大肠埃希氏菌中的原核表达

以牛分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR扩增获得mpb64和Ag85B两个目的基因片段,采用重叠延伸剪接技术（SOE）剪接mpb64和Ag85B,得到融合基因mpb64-Ag85B;将融合基因片段先克隆于pMD 18-T载体,再亚克隆到表达载体pET32a（＋）中,得到重组质粒pET64-85.该重组质粒经核苷酸序列测定,显示其中的外源片段与期望的序列一致;其BL21（DE3）转化菌经IPTG诱导表达带有6个组氨酸标签的融合蛋白;用Ni2＋螯合层析方法纯化融合蛋白,Western-blotting分析结果显示,该融合蛋白能与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应.     

牛分枝杆菌MPB70基因的克隆表达

以牛分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增其特异性蛋白(MPB70)基因,获得约600 bp的DNA片段,并将其克隆入pGEX-6P-1质粒,构建出原核表达载体pGEX-6P-1-MPB70。将质粒转化至感受态BL21中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析可见相应蛋白带。Western blot分析证实,该蛋白具有牛分枝杆菌抗原性,从而为进一步研究牛结核诊断方法奠定基础。     

牛结核分枝杆菌MPB70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

以牛分枝杆菌DNA为模板,克隆了牛分枝杆菌MPB70基因,构建了克隆载体pGEM-MPB70和表达载体pET30a-MPB70,经IPTG诱导在大肠杆菌BL-21中表达,用SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物并进行蛋白纯化。试验结果表明,牛分枝杆菌MPB70基因体外扩增产物与预期值相符,约582 bp;所构建表达质粒pET30a-MPB70经测序,结果与预期一致;SDS-PAGE分析表明,该融合蛋白以包涵体的形式表达,其分子质量约为29 kD,蛋白表达量约占菌体总蛋白的20%;该蛋白经电洗脱纯化后,纯度达85%以上;免疫印迹分析表明,原核表达的融合蛋白可与兔抗牛分枝杆菌多克隆抗体结合,并且具特异的免疫反应性。     

羊流产衣原体主要外膜蛋白基因的克隆与序列分析

将自行分离、传代培养的内蒙古地区山羊流产衣原体按常规方法分离纯化，提取衣原体基因组DNA作为模板，按照国外发表的衣原体主要外膜蛋白（MOMP）基因两端序列设计合成一对引物，用PCR方法扩增出－1.17Kb的DNA片段。利用引物上预先设计的限制性内切酶位点，将扩增片段经限制性内切酶切割后连接到pUC19质粒相应位点上，转化大肠杆菌DH5α，筛选重组子。经PCR检测和内切酶分析鉴定含MOMP基因的重组子质粒。对克隆处段进行全序列分析，结果证明得到MOMP全编码序列的基因克隆。本株衣原体MOMP编码区由1170个核苷酸组成。序列比较发现本株衣原体的MOMP基因与国外的羊流产衣原体S26／3株的MOMP基因完全相同，与B577株的MOMP基因仅有一个核苷酸的同义变异。     

副结核分枝杆菌MAP1588C蛋白的原核表达与抗原性分析

从副结核分支杆菌K-10菌株基因组中扩增出516 bp的MAP1588C基因片段,插入原核表达载体pET-28b(+),转化至大肠杆菌BL21(DE3),在0.5 mmol/L的IPTG诱导下进行表达;利用融合蛋白的组氨酸标签进行亲和层析纯化重组蛋白;通过抗6 His标签抗体的Western blot验证了纯化蛋白产物;另外,副结核阳性牛血清可检测到该蛋白条带。结果表明,表达的重组蛋白MAP1588C的蛋白分子量为21 kDa,具有良好抗原性,有望将此抗原用于建立副结核的ELISA诊断方法。     

蚕丝和蜘蛛丝蛋白基因结构及其表达

综述了家蚕丝和蜘蛛丝基因结构及其表达调控的研究概况,并介绍了应用基因工程生产丝蛋白的现状。     

牛支原体临洮分离株NOX-1的克隆表达、酶学活性及其亚细胞定位研究

为研究牛支原体(M. bovis)临洮分离株(LT strain)NOX-1基因特征表达产物的酶活性,及其在细胞中的具体存在部位,参照GenBank中M. bovis NOX-1HuBei株NOX-1基因序列(GenBank登录号:NC015725.1)设计引物,应用PCR扩增M.bovis临洮株的NOX-1基因,在完成测序后构建NOX-1基因原核表达载体pET-NOX-1,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后表达。表达产物纯化后进行酶活测定并免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,继而应用Western blot及间接ELISA对NOX-1在M. bovis内的分布进行初步定位。结果显示,M. bovis临洮株NOX-1基因全长1365 bp,重组质粒经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,重组蛋白His-NOX-1的分子量约为50 kDa;重组蛋白酶促反应最适酶促温度为30℃、pH为7.5,双倒数法求得重组蛋白Km和Vmax分别为256.41μmol/L、34.25μmol/(L·min);Western blot及间接ELISA结果表明His-NOX-1在M. bovis细胞膜上和细胞浆中均有分布且胞浆含量较高。本研究结果为进一步研究M. bovisNOX-1的生物学功能奠定了一定的基础。     

犬圆环病毒Cap蛋白的生物信息学分析及原核表达

犬圆环病毒(CanineCV)是近年被发现的圆环病毒属新成员,获取CaineCV Cap蛋白,为研究Cap蛋白的功能以及抗原表位奠定了基础。本研究以CaineCV GX2017株基因组作为模板,使用PCR方法扩增出Cap蛋白的基因序列,对其进行生物信息学分析,并克隆至pET-28a原,进行原核表达。结果表明:GX2017的N端2~26位氨基酸存在一个核定位信号,同时含有3个B细胞表位(aa7~aa14;aa150~aa174;aa233~aa253);第134位氨基酸为N-糖基化位点,第169和第238位氨基酸为O-型糖基化位点;进化分析表明,本研究的CanineCV Cap蛋白基因序列与欧美株同源性较低,且处在不同的分支;SDS-PAGE结果显示,重组Cap蛋白在E.coli BL21(DE3)中不能正确表达,切除了NLS的d(1-26)Cap蛋白能在E.coli BL21(DE3)中大量表达;Western blot 分析表明,该重组蛋白能与Anti-His 标签抗体发生特异性反应。本研究成功构建了pET-d(1-26)Cap重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中获得高水平表达,为进一步制备Cap蛋白的抗体奠定了基础。     

禽分枝杆菌副结核亚种重组蛋白r22-ag85B的表达及纯化

为表达并纯化禽分枝杆菌副结核亚种主要抗原基因的串联重组蛋白r22-ag85B,期望研制出一种新型副结核病疫苗,以禽分枝杆菌副结核亚种参考株P18的基因组DNA为模板,扩增了22KD基因和ag85B基因。采用重叠延伸剪接PCR技术（SOE-PCR）获得了融合基因22-agS5B,将基因连接于表达载体pET32a（＋）,构建了重组质粒pET22-ag85B。将其转化到大肠杆菌感受态细胞BL21（DE3）中,以IPTG（终浓度1mmol／L）诱导后对表达产物进行Western blot检测。检测结果显示,成功表达并纯化了重组蛋白r22-ag85B,其分子质量约为65ku。Western blot检测表明此蛋白具有良好的免疫学活性。禽分枝杆菌副结核亚种22-ag85B重组蛋白的成功表达及纯化为副结核病疫苗的研究工作奠定了基础。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒膜蛋白和核衣壳蛋白基因序列分析

猪繁殖和呼吸综合征病毒弱毒疫苗株基质膜蛋白和核衣壳蛋白基因克隆于ｐＢＶ２２０载体,然后将ＭＮ基因亚克隆于ｐＳＫ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐＴⅡＳＫ＾＋）载体,构建成重组质粒ＰＢＳＭＮ进行序列测定,共测得９５８ｂｐ,Ｍ和Ｎ基因分别位于ＯＲＦ６和ＯＲＦ７。     

柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2基因真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

为构建柔嫩艾美耳球虫棒状体颈部蛋白2(Eimeria tenella rhoptry neck protein 2,EtRON2)基因的重组质粒pCAGGS-EtRON2,并转染293T细胞进行表达,以柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA为模板,经PCR扩增其核心编码区的一部分,将其克隆至pGEM-Teasy载体,构建pGEM-Teasy-EtRON2质粒,双酶切出目的片段后与相应酶切的真核表达载体pCAGGS连接,构建真核表达质粒pCAGGS-EtRON2。该重组质粒经酶切和测序鉴定后转染293T细胞进行表达,分别用免疫印迹和间接免疫荧光鉴定EtRON2基因的表达情况。所构建的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2经过双酶切鉴定,可见一条大小约为1172 bp的目的条带,测序结果与GenBank所登录序列完全一致;免疫印迹实验可见大小约为43 kDa的目的蛋白条带,间接免疫荧光实验可以检测到特异性红色荧光。研究结果表明已成功构建了EtRON2的真核表达质粒pCAGGS-EtRON2,并在真核细胞中获得表达,为深入研究EtRON2的生物学功能奠定了基础。     

犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因在昆虫细胞中的表达及其抗原性分析

将非典型犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV）的核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,N）基因克隆到杆状病毒表达系统供体质粒pFastBacHTA中,构建含N基因的重组供体质粒pFastBac-N,转化E.coli DH10Bac感受态细胞,经筛选获得含N基因的重组Bacmid DNA（rBacmid-N）,脂质体法转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒vBacmid-N。用vBacmid-N感染昆虫细胞Sf9,免疫印迹（Western blot）分析,在62kDa处出现一条特异蛋白条带,与重组N蛋白的理论值相符合;间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescent assay,IFA）检测,vBacmid-N感染的昆虫细胞sf9出现特异绿色荧光。以纯化的重组N蛋白为抗原建立CDV抗体间接ELISA检测方法,犬CDV阳性血清A450大于0.40,而犬CDV阴性血清A450小于0.05,显示了良好的抗原特异性与稳定性。     

六个品系白壳蛋鸡血型及血浆蛋白质（酶）多态分析

用中国科学院遗传研究所研制的１０个抗鸡红细胞抗原单价血清（３个位点１０个等位基因），以平板凝集法以及用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳方法，对济宁北郊种鸡场白壳蛋鸡祖代或父母代Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ６个品系共３１２羽成年个体分别进行血型和血浆蛋白质（酶）多态（２个位点６个等位基因）测定，结果表明，各品系的群体遗传结构各有差异，试验结果可为杂交亲本选配提供信息。