副溶血弧菌和霍乱弧菌双重荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

建立一种基于TaqMan探针法同步定量检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的双重荧光定量PCR方法。根据副溶血弧菌toxR基因和霍乱弧菌ompW基因设计特异性引物与TaqMan探针。toxR和ompW探针5'端分别标记FAM、CY5荧光报告基团,3'端均标记BHQ1荧光淬灭基团。结果显示:该方法的副溶血弧菌和霍乱弧菌最低检测限均达到10 CFU/m L,灵敏度高;特异性试验表明这两种细菌与其他病原菌(大肠杆菌O157、沙门氏菌、拟态弧菌、创伤弧菌)无交叉反应;批间和批内重复性实验表明变异系数均小于1.5%,说明重复性好。采用人工染菌虾肉样品,副溶血弧菌和霍乱弧菌的最低检测限分别为100 CFU/m L和50 CFU/m L,人工染菌贝类样品的最低检测限分别为50 CFU/m L和50 CFU/m L。两种细菌在虾肉中富集2 h后的最低检出限均为1 CFU/m L。结论:本研究所建立的双重荧光PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的特点,包括DNA提取的整个检测过程可在1至3 h内完成,是同时快速检测副溶血弧菌和霍乱弧菌的有效手段。     

致病性副溶血弧菌三重PCR检测方法的建立和评价

根据副溶血弧菌种特异性基因(tox R)、耐热直接溶血素基因(tdh)和相对耐热直接溶血素基因(trh)为靶基因分别设计引物,进行PCR扩增及反应条件的优化,建立了检测含有溶血素毒力基因的致病性副溶血弧菌的多重PCR方法。3对引物能分别特异性地扩增出368、269、486 bp的目的片段。副溶血弧菌均能扩增出tox R基因,不含溶血素基因的菌株(tdh-/trh-)仅扩增出1条目的片段,而含不同溶血素基因的致病性副溶血弧菌则分别扩增出2条(tdh+/trh-或tdh-/trh+)和3条(tdh+/trh+)特异性条带。检测其他非副溶血弧菌的供试菌,则不出现任何扩增条带。人工模拟样品检测结果显示对致病性副溶血弧菌的最低检测浓度为103CFU/m L。结果表明该多重PCR检测方法具有较好的特异性和灵敏性,对检测致病性副溶血弧菌有重要意义。     

基于tlh基因病原副溶血弧菌LAMP检测方法的建立

为了研究副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)的快速分子生物学检测方法,试验以副溶血弧菌特异性tlh基因为分子靶标设计引物,利用环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立病原副溶血弧菌的快速检测方法。结果表明:特异性检测仅副溶血弧菌基因组DNA可扩增出阶梯状条带,且反应产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ后呈现明显的绿色阳性反应;而鳗弧菌、河口弧菌、美人鱼弧菌、霍乱弧菌、哈氏弧菌、鱼肠道弧菌这6种对照病原菌均未出现任何扩增条带,且反应产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ后呈现橙色阴性反应;灵敏度检测的最低检测限为42 cfu/mL;对人工染菌的9种水产品检测均可获得阳性扩增结果;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需1 h左右,较传统方法操作简单、耗时短、不需昂贵仪器。说明该方法可用于针对副溶血弧菌的进出口检验检疫、食品安全检测及由该菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。     

副溶血弧菌现场快速检测方法的建立及初步应用

为了实现副溶血弧菌的现场快速筛查,降低副溶血弧菌引起的食品安全问题,保障食品安全,试验利用副溶血弧菌tdh基因建立了可以快速检测水产品中副溶血弧菌的恒温环介导扩增(LAMP)方法,并通过添加钙黄绿素实现现场快速判定水产品中是否存在副溶血弧菌,同时利用建立的方法对螃蟹及贝类共40份水产品进行检测。结果表明:试验建立的方法具有良好的特异性,灵敏度可达7.92×10~(-3) ng/μL,实时浊度仪观察只有副溶血弧菌扩增出曲线,采用钙黄绿素法观察只有副溶血弧菌的扩增体系见到黄绿色。检测方法初步应用结果显示,从1例板蟹和1例蛤蜊中检测到副溶血弧菌核酸,证实2例水产品中存在副溶血弧菌。说明试验建立的方法可用于水产品中副溶血弧菌的现场检测。     

贝类中副溶血弧菌和沙门氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立

为适应进口鲜活水产品的快速检验,有必要建立快速检测多种病原生物的方法。本文针对鲜活水产品中常见的副溶血弧菌和沙门氏菌,设计了特异的荧光引物,建立了检测贝类中这两种细菌的荧光定量PCR体系,并进行了特异性与重复性试验。结果表明,在相同的反应条件下,副溶血弧菌和沙门氏菌均得到了特异性扩增,而阴性对照菌株均未见扩增。副溶血弧菌标准曲线在1.53×105~1.53×109拷贝/μL之间、沙门氏菌标准曲线在4.89×106~4.89×1010拷贝/μL之间有较好的线性关系。与传统的检测方法相比较,该荧光定量PCR方法检测贝类中的副溶血弧菌和沙门氏菌更为快速准确,结果直观,可以满足口岸进口水产品快速检测的需要。     

基于tlh和toxR基因的副溶血弧菌双重PCR检测方法

为了研究副溶血弧菌双重PCR检测方法,试验采用tlh和toxR基因序列设计2对特异性引物进行双重PCR检测,扩增出450 bp和368 bp目的片段。结果表明:在同一PCR反应体系中仅副溶血弧菌可同时扩增出2种基因片段,4株对照菌无任何扩增条带;该双重PCR检测方法最低能检测1.660 7×103cfu/mL菌体浓度的副溶血弧菌。说明试验所建立的双重PCR检测方法特异性强、敏感性高、方法简单、用时短,可用于副溶血弧菌引起的水产动物疾病的诊断与分子流行病学调查。     

基于toxR基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测病原副溶血弧菌方法的建立

基于副溶血弧菌toxR基因保守序列设计1对特异性引物,建立了SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测副溶血弧菌的方法。常规PCR检测,副溶血弧菌扩增出大小为368bp的目的片段,其他4种病原细菌均为阴性;SYBRGreenⅠ实时定量PCR扩增曲线反映了PCR的指数增长阶段和平台阶段;在Tm为85℃,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体;所制作的标准曲线在2.7×108～2.7×102拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.998,能对副溶血弧菌进行准确的定量分析;该方法检测时间从核酸抽提到结果分析仅需4～5h,较传统方法敏感、操作简单,耗时短,是副溶血弧菌引起的水产动物疾病的快速诊断及食品中针对副溶血弧菌安全检测的有效手段。     

创伤弧菌和副溶血弧菌双重LAMP检测方法的建立及初步应用

为建立创伤弧菌和副溶血弧菌的双重环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,本试验以创伤弧菌metalloprotease基因和副溶血弧菌ompA基因为靶点设计LAMP扩增引物,并在内引物间添加不同的酶切位点,通过对反应时间和温度的优化及酶切反应,成功建立了双重LAMP检测方法,并对其检测特异性、灵敏度和实际应用性进行了研究。结果显示,62℃反应45min时可同时检测到2种弧菌的存在,通过限制性内切酶酶切,可准确区分2种弧菌。该方法比普通PCR检测方法灵敏度高102~103倍。选择17株细菌菌株作为检测模板,发现除创伤弧菌和副溶血弧菌反应结果呈阳性外,其他均为阴性。以大菱鲆作为实验动物,检测双重LAMP技术的实际应用可能,该方法可准确检测并鉴定出组织和血液中感染的细菌种类,其灵敏度可达374~410CFU/g(mL)。SYBR GreenⅠ是一种结合于DNA双链小沟中的荧光染料,反应产物加入该染料后,极易用肉眼判别。本试验成功建立了创伤弧菌和副溶血弧菌的双重LAMP检测方法,该方法可用于水产养殖中病原菌的早期诊断。     

依赖于核酸序列恒温扩增技术快速检测副溶血性弧菌方法的建立

为建立副溶血性弧菌的快速检测方法,本研究采用依赖于核酸序列恒温扩增(NASBA)技术,以副溶血性弧菌的tlh基因为扩增的靶基因设计特异性引物和探针,建立可快速扩增副溶血性弧菌的NASBA方法.特异性和灵敏度试验结果表明:该NASBA方法对副溶血性弧菌的最小检出量为5.1×102 cfu/mL,高于普通PCR方法,而且与其他种属的菌无任何交叉反应.此外,本研究将副溶血弧菌扩增产物采用通用型核酸扩增物快速检测板进行检测,实现了特异性强的快速副溶血弧菌的检测.该方法对仪器要求低,具有良好的应用前景.     

副溶血弧菌和溶藻弧菌双重PCR检测方法的建立与初步应用

为建立同时快速检测海产品中的副溶血弧菌(VP)和溶藻弧菌(VA)的双重PCR方法,本研究根据VP和VA的toxR基因序列设计针对这两种细菌的两对特异性引物,建立能够快速同时检测这两种细菌的双重PCR方法,并对该反应体系的特异性和灵敏度进行检测。结果显示纯培养细菌VP和VA的检测灵敏度分别为2.32×103cfu/mL和2.56×103cfu/mL,临床病料检测灵敏度分别为2 cfu和3 cfu;与枸橼酸杆菌、沙门氏菌、美人鱼弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌无交叉反应。研究表明本实验方法操作简便快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好,并且经济实惠,值得推广应用。     

纳米金PCR技术检测副溶血弧菌方法的建立与初步应用

纳米金PCR是在普通PCR基础上发展起来的新技术,它能够明显提高普通PCR的灵敏度和特异性。根据副溶血弧菌(VP)的toxR基因序列,应用primer6.0设计一对特异性引物,建立了纳米金PCR方法,并对该方法的最佳反应条件、循环数、特异性和灵敏度进行测定。采用2.0%琼脂糖电泳进行检测,结果表明能扩增得到与试验设计相符的208bp(VP)的特异性条带;与溶藻弧菌、霍乱弧菌、麦氏弧菌、沙门氏菌、枸橼酸杆菌没有交叉反应;纯培养细菌检测灵敏度为3cfu/反应体系。与普通PCR法进行比较,该方法检测灵敏度比普通PCR高10倍。经临床检测,从150份带鱼、鱿鱼和鱼粉中检出5份阳性样品,与常规细菌分离鉴定方法符合率100%。该试验方法的建立对于加强进出口水产品中VP的检验检疫具有十分重要的意义。     

水产动物主要致病弧菌多重PCR检测方法的建立与应用

通过优化PCR反应体系和反应条件,从目前检测弧菌的9对特异性引物中筛选出分别以溶藻弧菌胶原酶基因、副溶血弧菌fla E基因和创伤弧菌vvh基因为目的基因设计的3对引物,建立多重PCR检测方法,并准确应用到人工感染的大菱鲆(Psetta maxima)的肝脏和肾脏组织的检测。试验结果表明,该多重PCR检测法方便快捷,与其他细菌无交叉反应,对上述3种弧菌的灵敏度分别为10~2、10~2和10~3 CFU/m L,对水产动物病原弧菌的检测具有重要意义。     

副溶血弧菌主要毒力因子三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立快捷、准确、高效检测副溶血弧菌的方法,以副溶血弧菌种属特异性基因toxR和毒力因子tdh、trh基因序列,分别设计3对特异性引物及相应TaqMan探针,并在toxR、tdh和trh基因的3个探针的5'端分别标记FAM、HEX、CY5荧光报告基团,3'端标记BHQ1淬灭荧光基团,通过优化反应体系和反应参数,确定最佳反应体系,建立一种基于Taq Man探针定量检测副溶血弧菌的三重荧光定量PCR方法。结果:本试验所建立三重荧光定量PCR方法与其他菌株无交叉反应,其最低检出限达到了10 CFU/m L,重复性试验中每组变异系数均小于1%;检测人工染菌的虾肉和贝类样品时,最低检出限亦达到10 CFU/m L,且整个检测扩增时间大约为1 h。结果表明,本研究建立的三重荧光PCR检测方法,特异性强、敏感性高、重复性好且耗时短,是高通量检测致病性副溶血弧菌的有效手段。     

副溶血弧菌SHJLA株的分离鉴定及致病性分析

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是海洋环境中常见的食源性致病茵。本研究从对虾中分离出1株细菌SHJLA,在TCBS和弧菌显色培养基上分别显示典型的蓝绿色和紫红色的菌落,且其生理生化特性具有典型副溶血弧菌的特性。以SHJLA菌株的基因组为模板。检测副溶血弧菌种特异性基因（tlh、toxR、groEL）均为阳性,gyrB基因序列分析表明SHJLA与副溶血弧茵的亲缘关系最近,同源性达98％～100％;检测副溶血弧菌主要毒力相关基因tdh和T3SS2（VopC2和vcrD2）均为阳性。该菌的神奈川溶血实验为阳性,对小鼠的半数致死量（LD50）为4．8×10^8 cfu／mL。结合SHJLA菌株的形态、生理生化、种特异性基因的检测、gyrB基因序列分析、毒力相关基因的检测以及小鼠半数致死量的测定结果,确定SHJLA是一株携带毒力基因的副溶血弧菌。     

纳米PCR技术检测溶藻弧菌的建立与初步应用

本研究根据溶藻弧茵（VA）的特异性基因toxR基因序列,应用primer6．0设计了1对特异性引物,并建立了纳金米金PCR方法,并对该方法的最佳反应条件、特异性和灵敏度进行了测定,采用2．0％琼脂糖电泳进行检测,结果表明本实验能扩增得到与实验设计相符的159bp（VA）的特异性条带;与副溶血弧菌、霍乱弧茵、麦氏弧菌、沙门氏菌、枸橼酸杆菌无交叉反应;纯培养细菌检测灵敏度可达22cfu／反应体系,同条件下比普通PCR的灵敏度高10倍。经临床检测,从120份带鱼、鱿鱼和鱼粉中检出8份阳性样品,与常规细菌分离鉴定方法符合率100％。本试验方法的建立对于加强进出口水产品中VA的检验检疫具有十分重要的意义。     

副溶血性弧菌PCR检测方法的建立

为了建立适于基层单位应用的针对副溶血性弧菌检测的特异PCR方法,检测副溶血性弧菌的基因序列.针对该菌的属特异性基因t1基因进行引物设计,扩增片段大小为449 bp.运用该PCR法可特异性的从副溶血性弧菌ATCC17802标准株中扩增出目的基因片段,与GenBank上发表的序列同源性为100%.而经常污染海产品的溶藻弧菌,嗜水气单胞茵标准株J-1,铜绿假单胞茵标准株ATCC27853结果均为阴性.该PCR法最低检出菌体DNA量为10-2ng以及最低检出菌数为5.7 × 103 CFU/mL.对临床上送检的35份样品进行菌体DNA PCR方法检测并同时与国标GB/T4789.7-2003中使用的检测方法进行比对,两种检测方法的结果完全符合,与国标中使用的检测方法相比可大大缩短鉴定时间.因此该PCR法能快速鉴定当前副溶血性弧菌流行群,有利于流行病学溯源等研究.     

副溶血弧菌重组酶聚合酶扩增快速检测方法的建立及初步应用

为建立副溶血弧菌快速检测方法,本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素(tlh)基因作为靶序列设计特异性引物,经反应条件优化建立了检测副溶血弧菌的重组酶聚合酶扩增(RPA)方法.优化试验结果显示该方法在37℃和35 min条件下检测效果最佳;特异性试验结果显示,该方法除对副溶血弧菌的检测结果为阳性外,对其余8种常见的弧菌检测结果...     

锦州市售鲜活海产品中3种病原性弧菌感染的调查

<正>弧菌属(Vibrio)是水产动物性食品中普遍存在且对人类的危害较大的一类细菌。副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、创伤弧菌(V.vulnificus)和拟态弧菌(V.minicus)是弧菌属常见的病原菌,这3种病原性弧菌引起的食物污染日益受到国内外学者的重视。由于水产品易受多种致病性弧菌的污染,单纯检测某一种弧菌难以全面反映水产品中致病性弧菌的实际污染状况。但是,食品卫生检验监督中弧菌的传     

食品中金黄色葡萄球菌单增李斯特氏菌和副溶血性弧菌的MPCR法检测

为快速检测食品中的金黄色葡萄球菌(SA)、单增李斯特氏菌(LM)和副溶血性弧菌(VP),根据各菌的相关基因设计引物,分别扩增金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因-nuc、单增李斯特氏菌溶血素O上的hlyA基因和副溶血性弧菌的热稳定直接溶血素基因-tdh,建立一种MPCR快速检测食品中致病菌的方法,结果表明,三条特异性扩增片段分别为279bp、243bp和202bp,经DNA测序证明其序列与模板被扩增片段一致。该方法具有良好的灵敏性和特异性。     

副溶血弧菌与嗜水气单胞菌双重PCR检测方法的建立

为建立一种可精准、快捷鉴别检测副溶血弧菌(VP)及嗜水气单胞菌(AH)的方法，根据GenBank公布的VP Tlh基因及AH aerA基因保守区序列，设计合成两对特异性引物，通过优化反应体系及反应程序，成功建立了一种可同时检测VP与AH的双重PCR方法，并开展了特异性及敏感性试验。结果显示：VP Tlh和AH aerA基因扩增条带大小分别为500、760 bp；反应体系中Tlh与aerA基因引物最优浓度分别为7.5、10.0nmol/L，反应程序中最佳退火温度为56.8℃；该方法对VP、AH的最低可检出细菌浓度均为1.2×10³ CFU/mL；对地衣芽孢杆菌、微小杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡阳芽孢杆菌、普通变形杆菌、维氏气单胞菌、布氏柠檬酸杆菌、豚鼠气单胞菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、简氏气单胞菌等其他非目标菌均无交叉反应，仅对VP和AH呈特异性阳性扩增。综上，本研究建立了一种可快速鉴别诊断VP、AH的双重PCR检测方法，其特异性强、灵敏度高，可为VP、AH等细菌性病原引发的水生动物疫病的快速诊断、监测及有效防控提供技术支持。