流感病毒M1与NA蛋白的相互作用及其在病毒出芽中的作用

流感病毒是一种囊膜病毒,各组分在细胞质膜组装并以出芽形式释放病毒。其中基质蛋白1,即M1蛋白,对病毒的致病性和病毒粒子形态的稳定起重要作用。NA蛋白是流感病毒的表面蛋白之一,可启动病毒的出芽。M1蛋白和NA蛋白间是否存在相互作用,以及这种相互作用对病毒出芽的影响还存在未知。本研究利用双分子荧光互补实验证明M1蛋白与NA蛋白存在相互作用。利用体外出芽试验发现单独表达的M1蛋白不能出芽,而单独表达的NA蛋白可以完成出芽;共表达NA与M1蛋白时,M1蛋白可以出芽,表明NA蛋白可以与M1蛋白发生互作并协助M1出芽。本研究探明了M1蛋白和NA蛋白的互作并揭示了这种互作在病毒出芽中的作用。     

A型流感病毒及其M1蛋白概述

A型流感病毒是一种流行广泛且死亡率很高的病毒,对人类及动物都造成了极大的影响。M1蛋白作为维持A型流感病毒基本形态的蛋白,在其生命周期中起着重要作用,但其具体结构和功能仍有待探讨。对A型流感病毒的基本分子生物学特性进行了综述,并对其基质蛋白M1的生物学特性、功能和结构做了阐述。     

新城疫病毒M蛋白与宿主蛋白相互作用的研究进展

新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)是单股负链不分节段的RNA病毒,其基因组大小约为15.2 kb,编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白.由于NDV基因组较小,不能编码病毒复制需要的所有蛋白,因此必须借助宿主蛋白来完成NDV的生活周期.M蛋白是一种非糖基化膜相关蛋白,在抑制宿主细胞基因转录、...     

流感病毒NS1蛋白在细胞凋亡中的作用

NS1蛋白是在细胞凋亡中发挥重要作用的流感病毒蛋白之一。流感病毒NS1是的颉颃剂,押制干扰素诱导的抗凋亡效应,同时也与病毒的致病力有直接的关系。详尽论述了NS1蛋白在细胞凋亡中的作用及其抗凋亡的作用机制,流感病毒的免疫预防和delNS1病毒作为特异性肿瘤杀手在临床上应用的前景与近年来的研究进展。     

禽流感病毒NS1蛋白与ANXA2蛋白相互作用的研究

为鉴定与禽流感病毒(AIV)NS1蛋白相互作用的宿主蛋白,本研究以AIV GD1322株感染人肺泡上皮细胞(A549),利用NS1蛋白的单克隆抗体(MAb)进行免疫沉淀反应(IP)筛选与其结合的宿细胞蛋白,并经质谱鉴定确认膜联蛋白A2(ANXA2)与NS1蛋白之间可能存在相互作用关系。免疫共沉淀(Co-IP)试验结果显示ANXA2与NS1蛋白之间具有稳定的相互作用关系;而且,Pull-down试验证明ANXA2与NS1蛋白之间为直接的相互作用。此外,激光共聚焦试验表明NS1和ANXA2共定位于胞浆中。本研究首次鉴定AIV NS1蛋白与宿主蛋白ANXA2间存在相互作用,为进一步研究AIV NS1蛋白的功能奠定了基础。     

宿主蛋白TRIB2与流感病毒NP蛋白相互作用的研究

流感病毒的核衣壳蛋白(NP)是病毒粒子中重要的结构蛋白,参与流感病毒生命周期的多个过程。为筛选与流感病毒NP相互作用的宿主蛋白,本研究应用酵母双杂交技术(Y2H)技术从A549细胞cDNA文库中筛选到与其相互作用的宿主蛋白Tribble 2(TRIB2),并通过免疫共沉淀技术(Co-IP)试验和GST pull down试验进一步证实NP与TRIB2之间存在特异性的直接相互作用。此外,利用激光共聚焦试验证实NP与TRIB2共定位于A549细胞的细胞质内。在A549细胞中过表达TRIB2蛋白后,能够降低流感病毒的滴度,表明TRIB2具有抑制流感病毒的复制功能。本实验为研究流感病毒的复制机理奠定了基础,完善了病毒与宿主相互作用网络。     

猪脑心肌炎病毒2B蛋白与RACK1蛋白相互作用的鉴定

为筛选与猪脑心肌炎病毒(EMCV)2B蛋白相互作用的宿主蛋白,本实验利用酵母双杂交方法筛选BHK-21细胞表达文库制备与EMCV 2B蛋白相互作用的宿主蛋白RACK1蛋白。酵母共转化试验和免疫共沉淀试验表明两者可以特异性结合,激光共聚焦试验表明两者共定位于细胞质中。为定位RACK1与2B蛋白相互作用区域,本研究构建了RACK1截短表达重组质粒,并将其与pCAGGS-Flag-2B共转染HEK293细胞,利用免疫共沉淀试验验证其相互作用区域。结果显示2B蛋白与宿主细胞RACK1蛋白存在相互作用,并且证明相互作用区域位于RACK1蛋白的N端。     

甲型流感病毒M1、M2和M42蛋白研究进展

甲型流感病毒基因组由8个分节段的基因组成,最初认为流感病毒的每个基因只能编码1个病毒蛋白,但随后发现M基因编码2种蛋白,即M1基质蛋白和M2离子通道蛋白。近年来的研究表明PB1基因编码PB1、PB1-F2和PB1-N40 3种蛋白,而PA基因则能编码PA、PA-X、PA-N155及PA-N182 4种蛋白。到目前为止,流感病毒的4个基因都已被证明能编码两种或两种以上的蛋白,说明流感病毒可以利用感染细胞的mRNA选择性剪接及蛋白翻译的不同机制实现其相关基因节段编码更多蛋白的能力。2012年发现流感病毒M基因可以编码一种新的蛋白,即M42蛋白。论文将对甲型流感病毒M基因所编码的M1、M2及M42这3种病毒蛋白的研究概况进行综述。     

蝙蝠流感病毒与H9N2亚型禽流感病毒M蛋白的免疫原性比较研究

为比较新发蝙蝠流感病毒H17N10亚型与禽流感病毒H9N2亚型的M蛋白(包括M1和M2蛋白)的免疫原性,分别构建两种亚型流感病毒M1、M2的原核表达载体和真核表达载体,利用前期反向遗传学技术拯救获得两种重组病毒感染MDCK细胞,并分别与相应的单抗或多抗进行免疫印迹和免疫荧光鉴定。结果显示,两种亚型病毒的M1蛋白的原核表达产物均与M1多抗反应,均不与2株M1单抗反应;拯救的两种重组病毒感染细胞后及其M1蛋白的真核表达产物均与M1的单抗5F2反应,不与单抗3G8及M1的多抗反应,两种亚型的结果一致;而两种亚型的M2蛋白通过与单抗和多抗反应,出现了不一致的结果,M2的单抗仅与蝙蝠流感病毒M2的原核表达产物反应,不与H9N2禽流感病毒M2的原核表达产物反应,M2的多抗则反之;且M2的多抗仅与H9N2禽流感M2的真核表达产物以及拯救病毒反应,均不与蝙蝠流感病毒M2的真核表达产物及拯救病毒反应。本研究证实这两种亚型流感病毒的M2蛋白之间确实存在免疫原性的差异,并且筛选到了可以区分蝙蝠流感病毒和禽流感病毒的M2抗体,为进一步研究流感病毒M蛋白相关的生物学机制提供了基础。     

应用酵母双杂交系统筛选与流感病毒PB2蛋白相互作用的宿主蛋白

流感病毒PB2蛋白可以作用于病毒mRNA转录起始阶段,辅助病毒mRNA引物的合成,并能够影响病毒的宿主范围,参与禽流感病毒在哺乳动物宿主体内的适应过程。本研究利用2009甲型H1N1流感病毒PB2蛋白作为诱饵蛋白,通过经典酵母双杂交系统筛选由Calu-3、A549、THP-1和U251 4种细胞构建的cDNA文库,筛选到多个与PB2蛋白相互作用的宿主蛋白。针对其中筛选到的一种宿主蛋白FHL2,进行免疫共沉淀(Co-IP)和激光共聚焦(Confocal)试验,证实了PB2蛋白和FHL2蛋白二者之间存在相互作用,并且转染瞬时过表达FHL2发现该蛋白可以负调控流感病毒复制,为进一步研究PB2蛋白与FHL2蛋白互作及影响病毒复制的分子机制奠定了基础。     

应用酵母双杂交系统筛选与流感病毒NS2蛋白相互作用的宿主蛋白

流感病毒的NS2蛋白能够介导病毒核糖核蛋白复合体(v RNP)的核输出过程,而且可以调控病毒聚合酶的活性,参与禽流感病毒在哺乳动物宿主体内的适应过程。为鉴定与NS2相互作用的宿主蛋白,本研究利用流感病毒NS2蛋白作为诱饵蛋白,通过经典酵母双杂交系统筛选与其相互作用的宿主蛋白,并利用免疫共沉淀(Co-IP)和GST pull-down方法进一步验证其相互作用关系。结果表明,通过酵母双杂交系统筛选含有Calu-3、A549、THP-1和U251 4种细胞的c DNA文库,共筛选到7种蛋白,分别为HGS、EXOSC4、ZWINT、PRDX3、IRF3、NDUFB9和RMND5B,根据Gene Ontology分析结果表明,这些蛋白分别参与细胞生长发育、细胞代谢和细胞定位等过程。其中对过氧化物氧还酶3(PRDX3)进行了Co-IP和GST pull-down试验证实重组表达的NS2蛋白和PRDX3蛋白在293T细胞中存在特异性的相互作用。本研究为进一步研究两者之间相互作用如何影响NS2蛋白功能以及病毒的复制周期奠定了基础。     

流感病毒NP蛋白与宿主蛋白SNRPA的相互作用研究

流感病毒核蛋白(NP)是由病毒RNA节段5编码的主要结构蛋白,与病毒基因组RNA及聚合酶(PB1、PB2、PA)构成核糖核蛋白(vRNP)复合体,是病毒基因组的转录和复制的基本功能单位。本实验室采用酵母双杂交技术从人细胞系cDNA文库中筛选与流感病毒NP蛋白相互作用的宿主蛋白U1 small nuclear ribonucleoprotein A(SNRPA)。本研究通过酵母回交验证、免疫共沉淀(Co-IP)和GST pull down试验进一步证实NP与SNRPA之间存在直接相互作用。利用siRNA干扰基因的表达后,流感病毒的复制滴度在24 h和48 h分别下降2.7倍和1.75倍,表明SNRPA蛋白表达对流感病毒的复制发挥正调控作用。本研究丰富了流感病毒蛋白与宿主蛋白之间的蛋白质调控网络,为进一步研究流感病毒复制调控的机制奠定了基础。     

金刚烷胺在禽流感病毒M2基因原核表达中的作用

禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)为正粘病毒科A型流感病毒，其基因组是由8个分节段的单股负链RNA组成，分别编码8个不同功能的蛋白，PB1、PB2、PA、HA、NP、NA、M1和M2及非结构蛋白NSl1和NS2。M2基因位于AIV基因组的第7个节段上，包含14～39和728～995两个部分，其初始转录产物在剪切40～727位的内含子后，拼接成成熟的mRNA后翻译成M2蛋白。M2蛋白是禽流感病毒的跨膜蛋白，具有H^ 离子通道的功能，     

流感病毒NP蛋白与宿主蛋白CAP1相互作用的研究

流感病毒核衣壳蛋白(NP)是病毒核糖核蛋白复合体(v RNP)的主要组成部分,主要调控病毒基因组的转录和复制。为筛选与流感病毒NP相互作用的宿主蛋白,本研究采用酵母双杂交技术(Y2H)在A549细胞c DNA文库中筛选到与其相互作用的宿主蛋白Adenylate cyclase-associated protein 1(CAP1),并通过酵母回交验证、免疫共沉淀技术(Co-IP)和GST pull down试验进一步证实NP与CAP1之间存在特异性的直接相互作用。此外,利用激光共聚焦试验证实NP与CAP1共定位于A549细胞的细胞质内。在HEK293T细胞中过表达CAP1蛋白后,流感病毒的复制能力下降,表明CAP1对流感病毒复制具有抑制作用。本研究对该蛋白的鉴定为流感病毒的复制机理研究奠定了基础。     

H3N2犬流感病毒M1蛋白的原核表达及鉴定

为制备犬流感病毒(H3N2) M1蛋白纯品,针对M1基因序列设计引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的基因片段,扩增产物克隆至表达载体pET-SUMO中并转化至宿主菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白,探索纯化工艺,制备目的蛋白,并用Western blot检测纯化的M1目的蛋白。通过PCR成功扩增出大小为771 bp的M1基因,成功构建p ET-SUMO-M1表达载体,表达的融合蛋白相对分子量为41 kD,主要以可溶形式表达,纯化后获得蛋白纯品,Western blot检测显示用M1蛋白(28 k D)免疫小鼠制备的多抗能与制备的蛋白纯品发生特异性反应,从而证明蛋白纯品为M1目的蛋白。试验制备出的M1蛋白纯品可为进一步制备通用型抗犬流感病毒抗体提供纯品抗原。     

A型流感病毒PB1-F2蛋白与蛋白激酶R相互作用研究

为研究A型流感病毒的重要毒力因子PB1-F2对蛋白激酶R(PKR)的调控机制,通过纯化GST-PB1-F2融合蛋白,利用GST pull-down试验证实了PB1-F2与PKR发生相互作用;采用免疫荧光试验进一步验证了二者的相互关系;实时荧光定量PCR表明PB1-F2能负调控PKR及IL-6的mRNA水平;采用siRNA干扰PKR基因的表达后,PB1-F2抑制IL-6的mRNA转录作用更显著。进一步运用蛋白免疫印迹方法检测了PB1-F2对PKR及其底物eIF-2α蛋白磷酸化水平的影响,显示过表达PB1-F2后,PKR及eIF-2α的磷酸化表达水平明显下调。本研究表明PB1-F2与PKR相互作用而抑制PKR磷酸化活化,并通过PKR调控IL-6的表达,为探索PB1-F2的未知生物学功能提供了重要信息。     

AP2M1在狂犬病病毒侵入中的作用研究

本研究前期利用RNA干扰技术在人类全基因组水平上筛选到了与狂犬病病毒(RABV)生命周期有关的宿主基因AP2M1。为进一步研究AP2M1影响RABV感染的机制,本实验在人胚胎肾细胞(HEK-293)中沉默或过表达AP2M1,采用高内涵筛选、病毒滴度检测等方法分析AP2M1对RABV感染率的影响。结果显示:敲低AP2M1,RABV感染率显著下降;过表达AP2M1,RABV感染率上升。酸绕过实验显示AP2M1在RABV感染过程中发挥作用。激光共聚焦观察显示RABV G蛋白与AP2M1无共定位。免疫共沉淀实验显示AP2M1与RABV G蛋白无直接相互作用。本研究结果表明,AP2M1基因在RABV感染过程中发挥作用,但不是通过与RABV G蛋白的直接作用影响病毒的感染。本研究为阐明AP2M1在RABV生命周期中具体作用奠定了基础。     

A型流感病毒M2蛋白研究进展

M2蛋白是A型流感病毒所特有的一种结构保守的非糖基化的跨膜蛋白,主要在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境,在表面血凝素糖蛋白合成过程中作为质子通道调节高尔基体跨膜转移通道的pH.其核苷酸序列高度保守,几乎不发生变异.其25位～43位氨基酸多肽是金刚烷胺类抗流感病毒药物的作用靶位,氨基酸极小变异都可能导致流感病毒抗药性的产生.M2蛋白胞外区域的氨基酸残基多肽(M2e)的特异性抗体可以在感染流感病毒的动物血清中检测出来,将M2e与相关佐剂联合使用可极太的提高机体对流感病毒的免疫力,在病毒感染中起重要作用,是一种潜在的交叉保护性抗原,常被用来探索具有广谱性和持久性的流感"通用疫苗".     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白在重组牛痘病毒中的表达与鉴定

为重组表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)M蛋白,本研究将RT-PCR获得的PRRSV CH-1a株M蛋白基因,克隆于pMD18-T载体中,经测序鉴定正确后,亚克隆至牛痘病毒重组转移质粒pSC11中,构建了转移重组质粒pSC11-PRRSV-M。将pSC11-PRRSV-M在脂质体的介导下转染WR株牛痘病毒感染的TK-143细胞,在含有X-gal的琼脂培养基上通过蓝斑筛选含有PRRSV M基因的重组病毒rWR-PRRSV-M。Western blot与IFA检测表明,重组病毒成功表达了PRRSV M蛋白,而且所表达的蛋白保持了良好的免疫原性。动物实验表明,rWR-PRRSV-M所表达的PRRSV M蛋白在免疫小鼠体内诱生了抗PRRSV的抗体。rWR-PRRSV-M的构建,为进一步探讨PRRSV M蛋白免疫原性提供了基础数据,也为PRRS重组活载体疫苗的研究奠定了基础。