柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA表达文库的构建

在无RNase污染的环境下,提取柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)子孢子RNA,进而纯化mRNA,采用Oligo(dT)引物反转录合成cDNA第一链和第二链,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ黏性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用Phage Maker extract对以上连接产物进行体外包装,形成完整的噬菌体,并用该噬菌体转染大肠杆菌ER1647,进行文库容量测定和扩增。以扩增文库的DNA为模板,利用已知基因引物克隆E. tenella3-1E基因,并进行测序。结果表明,成功构建了E. tenella孢子化卵囊子孢子的cDNA文库,文库原始库容量约为4×106pfu/mL,插入片段约100~3000 bp,扩增得到特定的E. tenella3-1E基因,说明文库质量高、代表性强,为进一步从文库中筛选相关基因提供了有效的工具。     

柔嫩艾美耳球虫子孢子的变化

纯化的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊，经消毒，水洗处理后放入玛瑙乳钵内研磨。研磨后的卵下混入适量消化液，在４０℃恒温水浴消化３０分钟即成为球虫子孢子粗提液。此粗提液经ＤＥ５２纤维素层析柱过滤，用甘氨酸洗脱液冲洗，收集滤液经离心沉淀即得纯化的柔嫩艾美耳球虫子孢子。     

柔嫩艾美耳球虫cDNA文库的构建

用异硫氰酸胍法从孢子化7h的卵囊中提取总RNA，链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA与E再用oligo(dT)n-纤维素从总RNA中分离mRNA。mRNA以Not Iolig(dT)15作第一链合成引物用置换合成法合成总cDNA，cDNA用Ecor I Aaptors的连接后，经Not I酶切，再与EcoR I和Not I预切好的λ载体连拉，构建成鸡球虫cDNA文库。     

密度梯度离心法纯化柔嫩艾美耳球虫子孢子

本文以蔗糖为介质,经密度梯度离心后旨在获得一种简便、经济和高效的纯化球虫子孢子的方法。1材料与方法1.1实验动物AA肉鸡购自北京华都肉鸡公司,未落地前放在专用鸡盒中运回;饲料为全价育雏料,购自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,不含任何药物添加剂。并且在饲喂前用烘箱75     

大量柔嫩艾美耳球虫子孢子快速纯化方法的建立

试验在传统DEAE-52纤维素层析法的基础上,通过采取缩短层析柱直径,降低层析柱高度,优化层析环境温度等措施,对柔嫩艾美耳球虫子孢子的纯化程序进行改进,旨在获得一种可操作性强、经济和高效的纯化方法。结果表明,选择一次性注射器作为简易层析管,填充2~3 cm的层析柱高度,控制层析环境温度在40℃左右,可快速纯化大量子孢子。     

宿主GAPDH对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响

目前,关于宿主细胞应对球虫感染机制的研究极其有限。在前期研究中,我们利用相对和绝对定量同位素标记技术结合液相色谱串联质谱技术分析了感染柔嫩艾美耳球虫子孢子72 h后鸡胚成纤维(CEF)细胞的蛋白质组表达变化,作者拟进一步研究其中一个上调蛋白——甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。克隆鸡GAPDH基因并构建原核重组质粒pGEX-4T-1-GAPDH,表达重组GAPDH蛋白,用Western blot对表达进行验证。使用q-PCR、Western blot和免疫组织化学的方法检测感染柔嫩艾美耳球虫子孢子后DF-1细胞中GAPDH的表达量,并使用抗体抑制试验检测GAPDH多克隆抗体对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的影响。结果显示:成功克隆1 123 bp的GAPDH基因,并获得61.7 ku的重组GAPDH蛋白。q-PCR和免疫组织化学检测均显示,GAPDH在柔嫩艾美耳球虫子孢子感染的DF-1细胞中的表达显著升高。抗体抑制试验表明,与相同浓度的正常兔IgG相比,50、100、200、300和400μg·mL~(-1)的抗GAPDH抗体均能明显抑制子孢子的入侵。以上结果表明,子孢子感染会引起宿主细胞GAPDH蛋白的上调,并且宿主GAPDH蛋白在子孢子入侵过程中起正调控作用。     

斯氏艾美耳球虫子孢子的超微结构

斯氏艾美耳球虫子孢子呈香蕉形,外被三层膜组成的表膜,有前后极环;顶复合器具典型结构,棒状体为８根;核一个,位于虫体前半部,含一个偏心核仁;相当于核中部水平位置的表膜上,见有一微孔;折光体在核后,呈球形,约占子孢子纵长的２／５;尾部常见一兔尾巴式的结构,构成方式类似阿米巴的伪足,是由被表膜的胞质向外突出形成的;胞质中见有许多管泡状线粒体和一些电子致密体。     

莫能菌素对柔嫩艾美耳球虫子孢子膜ATP酶的作用

目前控制鸡球虫病最有效的方法仍然是药物防治.长期的药物压力不可避免地导致了球虫抗药性的产生.迄今为止,生产中所有使用过的抗球虫药均可以从野外分离出相应的抗药性虫株[1].     

柔嫩艾美耳球虫裂殖子全长cDNA文库的构建及应用

为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用SMART技术,采用Clontech公司的Creator TMSMARTTMcDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库。用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA。连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到E.coli DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内;最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列(EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT)及Sanger的部分EST序列(Contig1218)设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性。经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×107个重组子,插入的片段多在1kb～3kb之间,平均插入片段长度约1.8kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×104 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列(EtSAG2、EtMIC-2),并成功获得EtMCAT和EST序列(Contig1218)的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin B)。结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础。     

斯氏艾美耳球虫子孢子的移行途径

关于斯氏艾美耳球虫Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｔｉｄｅａｉ子孢子的移行途径争议尚大。作者借光镜和电镜互补的手段研究了子孢子从肠腔到肝内胆管上皮细胞的移行。所取材料为人工感染５－５０万卵囊的１月龄幼兔的血液，肠道，淋巴结，脾和肝，取材料时间为感染后２－７２ｈ至４－６ｄ。依据子孢子大量出现于肠系膜淋巴结和小量出现于脾脏而未见于其它部位淋巴结，以及肝内胆管周围营养血管中有大量子孢子出现等观察结果，提出了子孢子移行     

猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建

猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IECs)是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)在宿主体内感染的靶细胞,为了研究PEDV在体内与宿主细胞蛋白之间的互作关系以便于揭示其致病机理,本研究以IECs为研究对象,提取了IECs的总RNA,利用SMART技术经过反转录、扩增和纯化获得双链cDNAs后,将其与pGADT7-Rec和carrier DNA共同转化至酵母Y187菌株,进行选择性培养基(SD/-Leu)筛选以及文库容量及质量的鉴定。结果显示,本研究构建的IECs-cDNA文库其库容量为1.3×10~8 pfu/mL,插入cDNA片段长度为250～2500 bp,文库阳性率达100%。本研究结果表明构建的IECs-cDNA文库具有较好的多态性,为后续研究PEDV与宿主细胞蛋白之间的互作关系提供了有力支持。     

梨酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

酵母双杂交是检测蛋白质之间相互作用的有效手段。构建梨酵母双杂交cDNA文库,能为利用酵母双杂交技术探究梨基因功能的互作机制提供技术支撑。本研究以沙梨主栽品种‘圆黄’梨的叶片和果肉为材料,采用Trizol法提取其RNA,利用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,通过同源重组法与pGADT7载体连接,再电转化至大肠杆菌菌株。经检测,构建的cDNA文库滴度为1.76×108 cfu/mL,文库片段插入阳性率为100%,片段长度主要分布在600~1500 bp。该研究结果表明,构建的cDNA文库质量较高,完整性较好,能为后续利用酵母双杂交技术鉴定基因的互作蛋白奠定基础。     

柔嫩艾美耳球虫子孢子高表达新基因的克隆、表达及分析

为克隆和研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)新基因,本研究在所获得的ESTs序列的基础上,应用RACE技术克隆获得了1个在子孢子阶段高表达新基因的全长cDNA序列(GU553107),命名为ZB7-C11,该基因全长1439bp,ORF为525bp,编码174个氨基酸,预测表达蛋白的分子量约为18.7ku。Real-timePCR对E.tenella不同发育阶段(未孢子化卵囊、孢子化卵囊、子孢子和裂殖子)表达量进行分析显示,该基因在子孢子阶段的表达高于其它阶段。另外,将ZB7-C11克隆于pGEX-4T中构建重组质粒pGEX-4T-C11,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达6h后其表达量最高,并且重组蛋白分子量约44.7ku大部分以可溶性存在。Westernblot分析显示该重组蛋白可被抗E.tenella的多克隆抗血清识别,表明该蛋白具有较好的反应原性。该结果为进一步研究该基因的生物学功能奠定了基础。     

ST细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了筛选与猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）结构蛋白VP2相互作用的宿主蛋白,深入研究病毒入侵及致病的分子机制,本试验建立了ST细胞酵母双杂交cDNA文库。采用RNeasy Min Kit提取ST细胞的总RNA,反转录合成cDNA第一链之后,通过SMART技术合成了双链cDNA,并利用同源重组的方法,构建了ST细胞的酵母cDNA文库。结果显示,文库滴度为8.1×10⁸ CFU/mL,插入的双链cDNA片段大小为250~1 000 bp,平均大小约为500 bp,文库的重组率为96%。此文库可用于筛选与病毒相互作用的ST细胞宿主蛋白,为进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础。     

柔嫩艾美尔球虫子孢子的提纯

自 Long,P.M.(1965)首次完成用脱囊的柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella)子孢子感染鸡胚成功后,国内外的许多学者相继用他的方法或略加改进,成功地进行了多种鸡艾美尔球虫的鸡胚感染,但用此种方法获得的子孢子悬液中粪渣和杂质较多,虽对鸡胚的感染影响不大,但不适于球虫免疫学、组织培养和生化分析等方面的研究。纯化的、活的具有感染力的球虫子孢子制备物是     

活化蛋白激酶C受体1影响柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞的初步研究

在前期实验中,本实验室利用i TRAQ技术研究了柔嫩艾美耳球虫子孢子感染宿主细胞后蛋白质组学的变化,获得了一批与子孢子入侵相关的宿主蛋白。本研究以鸡肌肉的c DNA为模板,对其中活化蛋白激酶C受体1(receptor for activated C kinase1,RACK1)进行克隆、表达及纯化,结果显示,成功获得RACK1-GST融合蛋白,并作为免疫原制备兔抗RACK1-GST多克隆抗体;利用RT-q PCR和Western blot检测子孢子感染DF-1细胞过程中RACK1的m RNA转录水平和蛋白表达水平。结果显示,子孢子感染细胞24~72 h时,细胞RACK1的转录水平和蛋白表达水平均明显提高;利用抗体抑制入侵试验检测RACK1多抗对子孢子入侵细胞的影响,结果显示,100μg/m L和200μg/m L RACK1-GST抗体作用细胞后对子孢子的入侵影响不大,而300μg/m L和400μg/m L作用细胞后能明显促进子孢子的入侵。以上结果表明,宿主RACK1对球虫子孢子入侵细胞起负调控的作用,但具体机制尚需深入研究。     

猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了更系统的研究病毒在猪肠道内侵入及致病的分子机制,本试验以猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)为模型,应用RNeasy Min Kit从猪IEC中提取细胞总RNA,反转录后,利用SMART技术合成双链cDNA(ds-cDNA),通过同源重组的方法构建猪IEC酵母双杂交cDNA文库。结果显示,文库的滴度为8.4×10⁸ CFU/mL,插入的ds-cDNA片段大小为0.5~2.0 kb,平均长度约为1.1 kb,文库重组率为100%。此文库为筛选与猪腹泻病毒相互作用的宿主蛋白及进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础,为研制有效的药物或疫苗提供了依据。     

抗堆型艾美耳球虫子孢子表膜单链抗体基因的构建

应用RT-PCR技术,从稳定分泌抗堆型艾美耳球虫子孢子表膜抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞Easp-3G3中扩增出抗体VH和VL基因,再通过重叠延伸拼接（Splice overlap extension）PCR方法在VH和VL可变区基因之间引入连接肽（Gly4Ser）3,体外构建抗堆型艾美耳球虫的单链抗体基因,并将其克隆至pMD18-T载体中进行测序。经测序,基因全长为744bp,编码248个氨基酸残基;经计算机分析,VH和VL基因均为新发现的基因序列,符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。结果表明,成功构建了抗堆型艾美耳球虫子孢子表面蛋白抗体的ScFv基因。     

绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

试验旨在构建绵羊卵巢组织细胞的cDNA文库,为进一步研究绵羊卵巢中蛋白互作机制提供工具。本研究以不同发情周期的绵羊卵巢组织为材料,利用TRIzol试剂提取绵羊卵巢组织细胞总RNA,应用SMART技术经过长链PCR(LD-PCR)合成双链cDNA(ds cDNA),通过CHROMA SPIN~(TM)+TE-400柱纯化得到ds cDNA,并与线性pGADT7-Rec共转化酵母Y187感受态细胞。用同源重组的方式,在酵母细胞内构建绵羊卵巢组织细胞酵母双杂交cDNA表达文库。结果构建了含有3×10~8个重组子的绵羊卵巢组织cDNA文库,插入片段长度多数为500～2 000 bp,重组率达96%,重组子中平均插入的片段长度为1 000 bp,文库滴度为2×10~7cfu/mL,符合建库标准。