犬细小病毒VP2抗体竞争ELISA检测方法的初步建立

本研究旨在制备犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2抗体,并建立竞争ELISA检测方法,从而为CPV疫苗免疫效果的检测及血清学调查提供技术支持。参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计1对添加EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的引物,PCR扩增VP2基因全长序列,将其克隆到pET28a(＋)载体中,构建原核表达载体pET28a-VP2,转化大肠杆菌Rosetta,表达并纯化了重组蛋白。SDS-PAGE及Western blotting分析表明,目的蛋白分子质量大小为67 ku,可被CPV抗血清识别,证明其能与特异性抗体结合,有良好的抗原性。以纯化的重组蛋白免疫家兔制备VP2多抗,采用辣根过氧化物酶进行标记,初步建立了竞争ELISA方法。结果显示,VP2重组蛋白的最佳包被浓度为5 μg/mL,酶标多抗的最佳稀释度为1∶3200,封闭条件为4 ℃过夜,最适的封闭液为10%小牛血清,山羊抗兔IgG-HRP的最佳工作浓度为1∶5000,显色时间为25 min。竞争ELISA试验结果表明,该方法具有较强的稳定性,有望为CPV疫苗免疫效果的判定及血清学调查提供技术手段。     

犬细小病毒VP2基因的原核表达及纯化

参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计了一对添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,对CPVVP2基因进行PCR扩增,克隆至pGM—T载体,获得重组质粒pGM—T—VP2,将重组质粒亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a—VP2,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化至E．coli Rosetta（DE3）中,获得了基因工程菌株E．coli Rosetta（CVP2）,并对重组菌进行了诱导表达,鉴定及纯化。结果表明纯化样品中含有87kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带。E．coli Rosetta（CVP2）以包涵体形式表达出了CPV—YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础。     

犬细小病毒NY株VP2蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

试验旨在制备犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）VP2蛋白多克隆抗体。构建pET28a-CPV-VP2重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化目的蛋白与佐剂混合、乳化制备后作为免疫原,免疫家兔制备VP2蛋白多克隆抗体;采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）检测抗体的免疫活性、抗体滴度、病毒滴度及中和活性。结果表明,重组VP2蛋白（rVP2）以包涵体形式存在,分子质量约为72 ku;所制备的多克隆抗体滴度为1 600倍,病毒滴度为10⁷ TCID₅₀ /mL,中和效价为1∶2 884,该抗体与体外培养的CPV呈特异性反应,CPV VP2蛋白的多克隆抗体免疫活性和特异性良好,且中和活性高,为CPV基因工程疫苗的研究和临床治疗奠定了基础。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的衣壳蛋白VP2,并制备其多克隆抗体。以SVA GD01/2017分离株RNA为模板,RT-PCR扩增VP2基因序列,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET-30a-SVA-VP2。经测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化重组SVA VP2蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用Protein A Sepharose CL-4B树脂从兔血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对其进行间接免疫荧光分析。结果显示,重组SVA VP2蛋白以可溶性和包涵体两种形式在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞内进行表达,分子质量约为47ku;制备的兔抗VP2蛋白多克隆抗体效价高达1∶64 000,该多克隆抗体仅识别SVA,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒等常见猪病原无交叉反应,表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性。重组SVA VP2蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在表达A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)的衣壳蛋白VP2,并制备其多克隆抗体。以SVA GD01/2017分离株RNA为模板,RT-PCR扩增VP2基因序列,并克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET-30a-SVA-VP2。经测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,利用IPTG进行诱导表达。在非变性条件下,利用Ni-NTA琼脂糖树脂从菌体裂解液上清中纯化重组SVA VP2蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用Protein A Sepharose CL-4B树脂从兔血清中亲和层析纯化多克隆抗体,并对其进行间接免疫荧光分析。结果显示,重组SVA VP2蛋白以可溶性和包涵体两种形式在大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞内进行表达,分子质量约为47ku;制备的兔抗VP2蛋白多克隆抗体效价高达1∶64 000,该多克隆抗体仅识别SVA,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、脑心肌炎病毒、猪瘟病毒和猪伪狂犬病病毒等常见猪病原无交叉反应,表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性。重组SVA VP2蛋白及其多克隆抗体的成功制备为猪塞内卡病毒病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。     

犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒（canine parovirus,CPV）VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPV VP2基因插入原核表达载体pET-32a（+）中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 755 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导5 h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64 ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。     

犬细小病毒北京分离株VP2基因的表达与抗原性分析

本研究基于犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2基因序列设计引物,利用PCR技术扩增该基因。扩增的VP2基因连入表达载体pET-32a(+),经PCR及双酶切鉴定基因连入正确。重组表达载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导,SDS-PAGE及Western blotting分析表明有特异蛋白的表达,分子质量大小为87 ku。将表达的蛋白包被酶标板后用抗犬细小病毒单抗与其反应,表明表达的VP2蛋白可以与相应抗体特异结合。     

犬细小病毒北京分离株VP2基因的表达与抗原性分析

本研究基于犬细小病毒(canine parvovirus, CPV) VP2基因序列设计引物,利用PCR技术扩增该基因。扩增的VP2基因连入表达载体pET-32a(＋),经PCR及双酶切鉴定基因连入正确。重组表达载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导,SDS-PAGE及Western blotting分析表明有特异蛋白的表达,分子质量大小为87 ku。将表达的蛋白包被酶标板后用抗犬细小病毒单抗与其反应,表明表达的VP2蛋白可以与相应抗体特异结合。     

犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒(canine parovirus,CPV)VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPVVP2基因插入原核表达载体pET-32a(+)中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900bp左右的载体条带和1 755bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0mmol/L IPTG、诱导5h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。     

猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。     

鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的融合表达及兔抗血清的制备

以鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)Gt株基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增VP2基因,经EcoR Ⅰ/Sal Ⅰ酶双酶切处理后与经相同酶切处理的pET30a原核表达载体连接,将酶切、PCR及序列鉴定正确的阳性重组子转化E. coli DE3菌,经IPTG诱导,表达的VP2蛋白通过Ni-NTA树脂纯化后,免疫新西兰白兔,制备兔抗血清,并对其进行间接ELISA、IFA和Western blot分析.SDS-PAGE分析表明,在IVFG诱导下成功表达了约为50 kDa的His-VP2融合蛋白;间接ELISA检测制备的兔抗血清效价在1:25 600以上;IFA及Western-blot分析结果表明,其可特异性结合真核表达的VP2蛋白以及IBDV全病毒.研究结果提示,免抗VP2血清可用于VP2蛋白及病毒的检测,为进一步研究IBDV分子生物学功能提供了物质基础.     

犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank上发表的犬细小病毒（CPV）VP2蛋白基因序列，设计并合成1对引物，通过PCR扩增VP2基因全长。将其克隆到pET一30a载体中，构建了原核表达载体pET—VP2，转化大肠杆菌Rosetta，表达并纯化了重组蛋白，Western—blotting证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为抗原，通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为15．8ng／孔，血清的最佳稀释倍数为1：100，建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。     

布鲁氏菌野毒株A544和疫苗株104M差异蛋白的表达及抗体制备

选取布鲁氏菌差异蛋白部分基因序列,将其克隆到表达载体p GEX-6p-1中;经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定,得到重组质粒p GEX-6p-1-bru;将重组质粒转化到Rosetta(DE3)感受态细胞中,用1 mmol/L异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)对转化菌进行诱导表达,并用表达蛋白制备多克隆抗体。结果:差异蛋白在体外获得了高效表达,表达融合蛋白分子量约为35 k D;诱导5 h后表达量最高,占菌体总蛋白的30%左右;表达蛋白能与多克隆抗体发生免疫印迹反应,证明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。该研究结果为免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

鸡贫血病病毒VP_2基因在大肠杆菌中的表达及其特性

将鸡贫血病病毒 (chicken anaem ia virus,CAV) VP2 基因克隆入表达性载体 p GEX- 5 X- 3,在大肠杆菌以谷胱甘肽转移酶 (GST)融合蛋白的形式获得了表达。以此表达产物免疫小鼠 ,制备抗 CAV VP2 的多克隆抗体。通过对 CAV感染的 MSB1细胞作间接免疫荧光试验 (IFA)检测 ,结果为阳性 ,这表明表达产物保留了 CAV相关的抗原特性。本研究为进一步探索 CAV VP2 的生物学特性奠定了基础。     

流行性出血病病毒VP7蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备

研究旨在表达流行性出血病病毒（EHDV） VP7蛋白并制备其多克隆抗体，为EHDV检测方法的建立提供材料。试验通过大肠杆菌进行VP7重组蛋白的诱导表达，通过镍离子亲和层析与透析进行重组蛋白的纯化与复性并免疫家兔制备多克隆抗体，通过间接ELISA、Western blotting与间接免疫荧光试验（IFA）分析多克隆抗体的效价与反应原性。结果显示，在37℃与IPTG （0.1 mmol/L）的诱导下，VP7重组蛋白（分子质量46 ku）以包涵体形式高效表达，纯化与复性处理后的重组蛋白纯度达94.52%，可与不同血清型的EHDV阳性血清特异性结合。制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体效价达1∶24 000；以制备的多克隆抗体为一抗，通过IFA与Western blotting检测到EHDV感染细胞中VP7蛋白的表达。本研究在大肠杆菌中实现了EHDV VP7蛋白的高效表达，制备的兔抗VP7蛋白多克隆抗体具有良好的反应原性与特异性，为EHDV诊断抗原的制备与血清学检测方法的建立提供了试验材料。     

非洲猪瘟K205R蛋白的原核表达及多抗的制备

为了表达非洲猪瘟K205R蛋白,进而制备其多克隆抗体,为非洲猪瘟血清学检测方法的建立奠定基础。以合成的K205R基因为模板,PCR扩增该基因序列,并将其克隆至原核表达载体p ET-21a中,得到重组质粒p ET-21a-ASFV-K205R。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达His-ASFV-K205R融合蛋白,通过亲和层析的方法纯化His-ASFV-K205R融合蛋白。通过Western Blot方法鉴定融合蛋白的抗原性,以此融合蛋白为抗原免疫兔制备多克隆抗体,通过ELISA的方法测定多抗效价。结果表明,原核表达的K205R蛋白具有很好的抗原性,制备的兔多克隆抗体效价为1∶128 000,为建立非洲猪瘟的血清学检测方法提供生物材料。     

犬细小病毒VP2基因乳酸菌表达载体的构建及蛋白检测

本研究旨在克隆犬细小病毒VP2(CPV-VP2)基因,构建乳酸菌重组表达载体,以乳酸菌表达CPV-VP2目的蛋白,通过重组目的蛋白检测及分析,为CPV乳酸菌口服疫苗研究提供支撑。以PCR方法扩增CPV-VP2编码目的基因,纯化后连接表达载体pMG36e,构建重组乳酸菌表达载体p MG36e-VP2,电转至乳酸球菌MG1363感受态,经PCR鉴定、双酶切鉴定及测序分析,挑选阳性重组菌株,命名为:pMG36e-VP2-MG1363。使用诱导剂Nisin诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting鉴定重组蛋白。结果显示,成功构建重组表达载体pMG36e-VP2,SDS-PAGE,结果表明,重组目的蛋白分子大小约65 kD,与理论值相符; Western Blotting结果表明,重组目的蛋白可被犬源CPV阳性血清所识别,具有良好免疫反应性。本研究用乳酸菌成功表达犬细小病毒蛋白,为该病新型疫苗的研究提供基础。     

A型塞内卡病毒VP2蛋白多克隆抗体的制备及间接ELISA检测方法的建立

【目的】制备A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)VP2蛋白多克隆抗体,建立检测SVA抗体的间接ELISA方法,以期为SVA致病机制及诊断提供研究基础。【方法】利用同源重组技术将VP2基因克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-VP2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行IPTG诱导表达,表达产物经纯化后皮下多点注射新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光试验(IFA)、Western blotting和中和试验鉴定多克隆抗体的特异性、反应性和中和活性。以VP2为抗原包被酶标板,通过矩阵优化、临界值确定、特异性鉴定及敏感性和重复性分析建立检测SVA抗体的间接ELISA方法。采集50份临床血清样品,分别用间接ELISA与IFA方法进行检测,分析间接ELISA方法的符合率。【结果】重组VP2蛋白以包涵体形式表达,大小为40 ku。制备的多克隆抗体能与重组VP2蛋白和SVA特异性结合,与其他病毒无交叉反应,且具有较高的中和活性。经对间接ELISA条件的优化,确定VP2包被浓度为4μg/mL,阳性血清稀释浓度为1∶250,封闭液为5%脱脂...     

非洲猪瘟病毒p54抗原C端的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

利用大肠埃希菌表达非洲猪瘟病毒核心抗原p54蛋白C末端55个氨基酸的肽段(命名为p54-2),制备了多克隆抗体并进行了纯化,以进一步用于非洲猪瘟ELISA试剂盒的研发。将PCR扩增获得的p54-2目的片段与表达载体pGEX6p-1质粒均经过限制性内切BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,构建pGEX6p-1-ASFV-P54-2原核表达质粒。将该质粒转化到大肠埃希菌BL21中,诱导蛋白大量表达,并纯化获得高纯度的蛋白。将纯化的p54-2蛋白免疫小鼠,获得p54-2多克隆抗体并进一步纯化多抗。用ELISA、Westernblot对纯化的多克隆抗体进行效价滴定及特异性鉴定。结果显示,成功构建了pGEX6p-1-ASFV-P54-2重组质粒,在大肠埃希菌中IPTG诱导下,能够高效表达重组p54-2蛋白。用p54-2蛋白免疫Balb/c小鼠获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1∶128000,说明该蛋白有很好的免疫原性。Westernblot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别非洲猪瘟病毒p54胞内区,具有较高反应性和特异性,可以用于ELISA检测方法研究和p54抗原表位的鉴定。     

犬瘟热病毒N基因原核表达及多克隆抗体的制备

采用PCR方法扩增犬瘟热病毒N基因,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建犬瘟热N基因原核表达重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达重组N蛋白。从包涵体中纯化重组蛋白,制备多克隆抗体,采用Western blot检测其特异性。结果显示PCR扩增得到犬瘟热N基因,重组N蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中得到表达,制备的多克隆抗体能与N蛋白特异性反应。