3种基础培养液对昆明小鼠ESC生长的影响

以昆明小鼠的囊胚及胚胎干细胞为材料,用组成成份清楚的培养体系,研究不同的基础培养液(h-DMEM,DMEM/F12,Knockout DMEM)对昆明小鼠胚胎干细胞生长的影响。分别将小鼠囊胚置于以上3种培养液为基础的培养液(M1、M2、M3)中,4 d后观察原代集落形成率;取正常培养较小的胚胎干细胞集落,分别接种在上述培养液中培养观察;单细胞传代并观察结果;以碱性磷酸酶染色及OCT-4免疫荧光染色鉴定。3种基础培养基中原代集落形成率分别为100%,100%,96.3%;Knockout DMEM与DMEM/F12中的胚胎干细胞增殖的速度远快于h-DMEM中的增殖速度;单细胞传代的昆明小鼠胚胎干细胞都能形成集落;经AKP染色和OCT-4免疫荧光染色,证明3种培养体系中的胚胎干细胞均符合胚胎干细胞的特性。Knockout DMEM与DMEM/F12较DMEM更有利于胚胎干细胞的生长。     

山羊诱导性多能干细胞培养体系的筛选

[目的]使用多种培养成分组合,筛选出一个适合山羊诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)的培养体系。[方法]采用慢病毒作为载体,携带多能因子,采用多种培养成分(培养基、血清和细胞因子)的组合培养山羊i PSCs,优化其培养体系。[结果]用FBS代替KSR可以提高克隆的形成效率以及克隆的质量,而用DMEM/F12代替KNOCKOUT-DMEM,i PSCs克隆的形成效率和克隆质量没有明显的改善。带有β-FGF的培养体系可以保持i PSCs未分化的状态,而培养体系中只加LIF不能维持i PSCs未分化的状态。[结论]该研究成功诱导出山羊i PSCs,且能在体外传代培养。     

转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞的体外诱导表达

[目的]为了探索山羊乳腺上皮细胞体外诱导表达的技术体系,评价乳腺特异性载体效率及外源蛋白在细胞水平的表达情况。[方法]用含5mg/L胰岛素、5mg/L催乳素、1mg/L氢化可的松的DMEM/F12培养液对转染人乳铁蛋白基因的山羊乳腺上皮细胞进行体外诱导培养,每6h收集1次上清液。上清液浓缩后分别用SDS-PAGE和Westernblot检测外源蛋白的表达情况。[结果]诱导培养液中有目的蛋白表达,分子量约为42kD。[结论]该研究所用的山羊乳腺细胞诱导表达方法能够诱导山羊乳腺上皮细胞表达外源基因,这为人乳铁蛋白基因的异源表达与乳腺生物反应器的研究奠定了基础。     

精原干细胞体外培养体系的建立

精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是雄性哺乳动物精子发生及具有生育能力的保障。精原干细胞的体外培养不仅为精子发生的研究提供材料,还有助于开发新的家畜保种方法和动物遗传修饰。为了探索猪精原干细胞体外培养体系的建立方法,本研究采用胶原酶Ⅳ-胰酶两步酶法对3~7日龄大白仔猪睾丸进行消化得到单细胞悬液,利用不同时间程序的差速贴壁对精原干细胞进行纯化,选择大白仔猪睾丸支持细胞作为饲养层,添加不同细胞因子研究精原干细胞的增殖情况以期得到最佳的培养体系。结果显示,通过差速贴壁得到的UCHL-1阳性生殖细胞比例最高为18.59%±0.94%;不同细胞因子组合添加试验发现精原干细胞添加20 ng·mL^-1 GDNF、10 ng·mL^-1 IGF和20 ng·mL^-1 bFGF的增殖效果最佳;以支持细胞作为饲养层、在DMEM/F12中添加1%FBS以及上述细胞因子组合对精原干细胞进行培养15 d后可见大量的精原干细胞集落,通过免疫荧光、AKP染色、荧光定量PCR等试验证明精原干细胞进行了大量增殖。本研究初步建立了猪精原干细胞的体外培养体系,可通过体外培养大量增殖精原干细胞,为后续精原干细胞的研究奠定基础。     

山羊卵母细胞体外成熟因素的研究

建立和优化山羊卵母细胞体外成熟的培养体系,对山羊卵母细胞的采集方法、割卵液种类、培养液添加血清种类等因素进行了研究.结果显示切剖法与抽吸法对山羊卵母细胞的成熟有显著差异(P<0.05);割卵液DMEM/F-12与PBS+BSA对山羊卵母细胞的成熟有极显著差异(P<0.01);添加EGS(自然发情)、EGS(PG诱导发情)、FBS对山羊卵母细胞的成熟有极显著差异(P<0.01).结论:切剖法能更好地支持卵母细胞的成熟;DMEM/F-12作为割卵液,能显著提高卵母细胞的成熟率;自然发情的山羊血清对卵母细胞的成熟效果最好,同种血清对卵母细胞的成熟效果要好于异种血清.     

不同浓度的EGF对山羊毛囊干细胞体外培养的影响

采用2.4 U/mL Dispase酶消化和机械切割法分离毛囊隆突部,经胰酶(0.5 mg/mL胰酶+0.2 mg/mL EDTA)消化从山羊耳部皮肤分离得到毛囊干细胞,并检测4种不同浓度(0、10、15和20 ng/mL)的EGF对山羊毛囊干细胞体外培养的作用.结果表明,EGF对毛囊干细胞体外培养效果明显,最适EGF浓度为15 ng/mL.     

家兔原始卵泡卵母细胞体外发育的培养体系研究

本研究根据家兔卵巢的发育特征初步探讨了家兔卵巢卵母细胞体外发育的培养体系。采集新生或30日龄家兔卵巢在不同培养液中培养,并分析家兔卵母细胞的体外发生与成熟情况与体内正常发育的兔卵巢卵母细胞之间的差异,来筛选和优化家兔卵巢卵母细胞的体外培养体系。本试验从高糖DMEM、FSH浓度、BSA/血清等3个方面来筛选较好的培养条件,结果表明:①不添加高糖DMEM的M199培养液与添加的相比,卵巢上卵母细胞数量要多,但随着培养时间的延长,组织块上卵母细胞的形态会变得不清楚;②家兔卵巢组织在FSH浓度为50和100m IU/m l、添加血清的DMEM/F12培养液中生长较好,体外培养24d后,卵母细胞数量多,直径增加到65μm;③与添加BSA的培养液相比,添加血清的培养液中的卵巢卵母细胞生长状态较好,体外培养28d后,卵母细胞数量多,并且直径可达65μm。     

胎鼠额叶皮质神经干细胞的分离培养与分化

目的:探索从胚胎小鼠额叶皮质分离培养神经干细胞的方法。方法:无菌条件下分离孕13～15d小鼠胚胎额叶皮质脑组织,经消化及机械吹打成单细胞后接种于含有B27、bFGF的DMEM/F12培养基,培养扩增;倒置显微镜观察比较生长状况;机械分离法传代;10%血清接种分化;免疫细胞化学方法染色鉴定神经干细胞及其子代细胞的分化方向,结果:培养的部分细胞体外分裂增殖,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并向神经细胞和胶质细胞分化。结论:小鼠胚脑存在具有多分化潜能的神经干细胞,它们能在体外稳定培养、传代和分化,为细胞替代治疗提供了理想的细胞来源。     

神经干细胞定向诱导分化条件研究

通过模拟体内分化诱导条件,在体外对神经干细胞(NSCs)进行定向诱导.结果表明,由添加2% B27 100 pg·mL-1 IL-1 0.05 g·L-1 Vc 5 u·mL-1 EPO的DMEM/F12的诱导液A和1份含2% B27的DMEM/F12 1份纹状体提取液混合组成的诱导液B均可以将中脑和大脑皮质的NSCs诱导分化为多巴胺能神经元,TH阳性细胞表达率随诱导时间的增加而提高,中脑来源的NSCs的TH阳性细胞诱导率极显著地高于大脑皮质来源的NSCs,诱导液A的诱导效果优于诱导液B.     

大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织原代培养的研究

应用组织块培养法,研究了大泷六线鱼Hexagrammos otakii鳍、吻端和肾脏细胞在含有体积分数为20％胎牛血清(FBS)的L-15、DMEM和DMEM/F12 3种培养基中的生长情况,以及人碱性成纤维细胞(bFGF)、硫酸软骨素、Ⅰ型胰岛素样(IGF-Ⅰ)3种生长因子对细胞贴壁率和迁出率的影响.结果表明:大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏细胞适宜的体外培养体系为DMEM/F12培养基+20％ FBS,pH为7.2,温度为25℃;在最适培养基中分别添加5.0 ng/mL bFGF、20 μg/mL硫酸软骨素、40 ng/mL IGF-Ⅰ时,3种组织的贴壁率和细胞迁出率均最高;鳍、吻端和肾脏组织分别经培养21、15、18 d后长满单层,主要为成纤维样细胞;采用低渗滴片法制备染色体,3种组织原代细胞的染色体数目为48条.本研究为大泷六线鱼鳍、吻端和肾脏组织细胞系的构建和生物学特性的研究奠定了基础.     

小鼠胚胎中脑神经干细胞分离、培养及分化

目的:探讨小鼠胚胎中脑分离神经干细胞的体外培养方法,以获取高纯度的神经干细胞,为神经干细胞的深入研究提供试验材料。方法:无菌条件下分离孕12~13 d小鼠胚胎中脑曲,制成单细胞悬液,碱性成纤维生长因子(bFGF)和B27存在的培养基中培养扩增,通过免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞及子代细胞的分化方向,流式细胞术检测TH阳性神经元比例。结果:培养的部分细胞体外分裂增殖,同时表达神经干细胞特异性抗原nestin,并向神经细胞和胶质细胞分化并经流式细胞仪检测自然分化为多巴胺能神经元的比例为3.25%。结论:小鼠胚脑中脑存在具有多分化潜能的神经干细胞,它们能在体外稳定培养、传代和分化。     

山羊胎儿肌肉干细胞的分离培养与成肌诱导分化

【目的】通过体外建立安淮山羊胎儿肌肉干细胞分离培养及成肌诱导分化的方法,为进一步研究调控山羊肌肉干细胞增殖与分化的分子机制提供实验材料。【方法】本试验选取山羊胎儿背最长肌肌肉组织,用眼科剪剪成肉糜后,用0.1%的Ⅰ型胶原酶消化40 min,然后利用0.25%的胰酶消化15 min。分离得到的细胞用生长培养基（20%FBS+80%DMEM/F12+青链霉素）培养于37℃、5% CO2培养箱内。培养2h后采用差速贴壁技术对细胞进行纯化,又2h后,重复纯化一次。待细胞生长至70%左右密度时可进行传代培养。每次传代培养均采用差速贴壁30min的方法进一步纯化肌肉干细胞,共纯化至第6代。利用免疫荧光技术检测第6代细胞中肌肉干细胞标记基因Pax7、MyoD1的蛋白表达情况,从而对分离得到的细胞进行鉴定。当肌肉干细胞生长至70%左右密度时,将生长培养基更换为分化培养基（2%FBS+98%DMEM/F12+青链霉素）,诱导细胞向成肌方向分化并观察细胞的形态学变化。细胞诱导分化1d后,采用免疫荧光技术检测肌肉干细胞的分化标记基因Myog的蛋白表达情况。另外,分别提取诱导0、1、3、5、7d后的细胞的总RNA,通过反转录试剂盒反转成cDNA后,利用qPCR测定MyoD1和Myog的相对表达量。【结果】 分离得到的细胞呈贴壁生长,其形态趋于稳定后主要呈长梭形或纺锤形。免疫荧光技术检测的第6代细胞中Pax7和MyoD1蛋白均为阳性表达。采用分化培养基诱导细胞分化后,在显微镜下可观察到随着诱导天数的增加,细胞开始分化、相互融合成肌管且具有一定的方向性。免疫荧光检测结果表明Myog蛋白呈明显的阳性表达。另外,qPCR结果显示,标志基因MyoD1和Myog均有表达,且MyoD1的相对表达量在分化的第1天相比于0天显著升高并维持到第3天,第5、7天开始显著下降但仍显著高于增殖期。Myog在分化不同天数的细胞中的相对表达量具有类似的趋向。【结论】分离得到了纯度较高的安淮山羊胎儿肌肉干细胞,且诱导后展现出较好的成肌潜力。研究结果可为进一步开展肌肉干细胞成肌分化的分子机制研究提供材料来源。     

山羊转t-PA突变体基因的体细胞核移植研究

比较了用转t-PA突变体基因的胎儿成纤维细胞和卵丘细胞作供体时核移胚的发育情况。结果表明:卵丘细胞作供体时,核移胚的卵裂率(82.9%)和桑葚胚率(55.9%)均高于胎儿成纤维细胞卵裂率(75.7%)和桑葚胚率(48.7%),但差异不显著(P>0.05);卵丘细胞作供体时的囊胚率(19.7%)则高于胎儿成纤维细胞(11.0%),差异显著。(P<0.05)。比较了饥饿处理与否对胎儿成纤维细胞作供体时转基因核移胚的发育情况。结果表明:供体细胞饥饿后,其核移胚的卵裂率(75.6%)与供体不饥饿的卵裂率(75.8%)差异不显著;供体细胞饥饿后,其核移胚的桑葚胚率(46.5%)和囊胚率(11.0%)高于供体不饥饿的桑葚胚率(39.3%)和囊胚率(9.0%),但差异不显著。比较了SOFaa和CR1aa分别添加10?S和bFF后,转基因核移胚的发育情况。结果表明:用CR1aa液培养时,添加10?F,其囊胚率(9.1%)高于添加10?S(4.2%)(P>0.05);用SOF液培养时,添加10?F,其囊胚率(11.2%)高于添加10?S(5.5%)(P>0.05)。说明用SOF液优于CR1aa液。     

GDNF和LIF对小鼠精原干细胞体外增殖的影响

【目的】探讨胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和白血病抑制因子（LIF）对小鼠精原干细胞（SSCs）体外增殖的影响,为后续SSCs的诱导分化、转基因动物生产、基因治疗等研究奠定基础。【方法】收集6～8日龄小鼠睾丸,采用机械法和2步酶消化法获得细胞悬液。通过多次差异贴壁法分离纯化SSCs和支持细胞,采用碱性磷酸酶（AP）染色和RTPCR检测Ngn3和Oct4基因2种方法对SSCs进行鉴定。采用单独添加GDNF（添加量为0,10,20,40 ng/mL）或LIF（添加量为0,500,1 000,1 500 U/mL）的无血清DMEM/F12培养基培养SSCs,于培养第3,5,7天取样,同时用添加GDNF和LIF（各因子单独添加量两两组合）的无血清DMEM/F12培养基培养SSCs,于培养第3,4,5天取样,采用甲基噻唑基四唑（MTT）法检测GDNF、LIF对SSCs体外增殖的单因子效应和配伍效应。【结果】与对照组相比,不论培养时间如何,单独添加20和40 ng/mL的GDNF可以显著促进SSCs增殖(P＜0.05),而单独添加不同量LIF对SSCs增殖的影响不显著(P＞0.05);同时添加20 ng/mL GDNF和1 000 U/mL LIF可以显著促进SSCs的增殖,在该条件下当精原干细胞接种密度为(6×10⁴)～(10×10⁴) mL^-1,共培养5 d时,其OD₄₉₀值为0.696。【结论】DMEM/F12培养基中单独添加20 ng/mL GDNF或同时添加20 ng/mL GDNF 和 1 000 U/mL LIF可以显著促进小鼠SSCs的体外增殖。     

红细胞裂解法及不同培养条件对兔骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

研究采用红细胞裂解液法从兔骨髓中分离BMSCs,相差显微镜观察其形态,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)筛选基础培养液和血清浓度,绘制生长曲线,用流式细胞仪检测细胞周期,免疫细胞化学鉴定表面抗原。分离的细胞在形态学观察与生长动力学上均符合BMSCs特征;在实验范围内DMEM/F12+20%FBS是体外培养兔BMSCs的最佳体系;细胞周期结果显示,BMSCs平均82%处于G0/G1期,18%处于S+G2期;免疫细胞化学结果显示所分离的BMSCsCD90、CD44阳性表达,CD34阴性表达。本研究结果表明,通过红细胞裂解液法分离的兔BMSCs,其具有体外增殖和多向分化的潜能,可以作为组织工程的种子细胞。     

新生牛雄性生殖干细胞的分离纯化与培养

为建立新生牛雄性生殖干细胞的体外增殖与分化体系,将新生牛睾丸消化成单细胞悬液,分别进行差速贴壁、不连续密度梯度Percoll分选雄性生殖干细胞和支持细胞,对分选生殖干细胞进行体外培养。结果表明,差速贴壁法能有效分选雄性生殖干细胞与支持细胞,2%血清浓度的培养液即可用于雄性生殖干细胞的体外培养,添加100 ng·mL-1的GDNF能显著促进雄性生殖干细胞的增殖,增殖形成的雄性生殖干细胞集落具有一定多能性。