曼陀罗毛状根的诱导及其悬浮培养合成天麻素初探*

 利用A₄和R₁₆₀₁两种发根农杆菌菌株分别感染曼陀罗的嫩叶及嫩茎诱导产生毛状根。探讨了不同菌株、不同外植体、蔗糖预处理、外植体预培养与染菌时间以及外植体二次染菌等条件对转化频率的影响,并建立毛状根悬浮培养体系及转化外源底物对羟基苯甲醇合成天麻素。结果表明:A₄转化频率高于R₁₆₀₁;嫩叶转化频率最高;嫩叶最佳预培养时间为4 d;最佳染菌时间为5 min。HPLC法分析表明,悬浮培养毛状根能转化外源底物对羟基苯甲醇合成天麻素。     

罗勒毛状根的诱导及培养

[目的]利用4种发根农杆菌R1,R1601,1025,1000诱导药用植物罗勒产生毛状根,建立毛状根培养体系。[方法]利用共培养法研究不同外植体、菌株、预培养时间、感染时间以及外源激素等对罗勒毛状根诱导率的影响。[结果]利用发根农杆菌1025,预培养2d的叶片为转化材料,感染6～8min,加入0.1mg/LNAA的诱导率最高。经过基本培养基的筛选和毛状根生长动力学的考察,确立罗勒毛状根在1/2MS培养基中的最佳继代时间为21d。[结论]罗勒毛状根离体培养的建立,为进一步进行药用活性成分的工业化生产奠定了基础。     

苦荞麦毛状根的诱导研究

利用发根农杆菌Ri1601浸染苦荞植物预培养2d的叶片外植体,经不同时间的共培养和除菌培养后获得毛状根。经硅胶薄层色谱板检测表明,发根农杆菌Ri1601和苦荞叶片上未经转化产生的不定根都不含有冠瘿碱;而经发根农杆菌Ri1601遗传转化后所产生的毛状根有冠瘿碱的存在。因此,可确定苦荞叶片上产生的毛状根为发根农杆菌Ri1601转化所得。建立了用发根农杆菌Ri1601诱导苦荞植物叶片产生毛状根的有效方法。     

乌克兰龙葵毛状根诱导条件优化

[目的]利用3种发根农杆菌A4、C58C1、A1476诱导乌克兰龙葵产生毛状根,探究乌克兰龙葵毛状根诱导的最佳条件。[方法]利用植物组织培养技术,研究不同外植体、菌株、侵染时间、预培养天数、菌液浓度和共培养天数等对乌克兰龙葵毛状根诱导率的影响。[结果]叶片为最佳外植体材料;3种菌株均能诱导出毛状根,但A4诱导率最高;最佳菌液浓度为OD600=0.6;最佳侵染时间为5 min;预培养和共培养均为2 d时诱导率最高。[结论]乌克兰龙葵毛状根诱导条件的优化,为其他植物毛状根诱导提供参考,同时为进一步利用植物毛状根生产药用成分提供试验基础。     

苦参毛状根诱导及其培养条件的研究

[目的]为药用成分苦参碱及氧化苦参碱的来源提供新途径。[方法]考察了R1601菌株对苦参不同外植体在不同浓度乙酰丁香酮和侵染时间影响下苦参毛状根的诱导率;研究了培养基中的组分和浓度对苦参毛状根继代生长的影响。[结果]以苦参幼芽为外植体,在R1601菌液中添加100μmol/L乙酰丁香酮,侵染20 min,(25±1)℃,MS共培养基上暗培养2 d,苦参毛状根的诱导效果较好,诱导率28.6%,存活率46.7%;苦参毛状根在改良的继代培养基上生长良好。[结论]苦参毛状根的最佳诱导条件:以生长1周的苦参幼芽为外植体,R1601为菌株,添加100μmol/L的乙酰丁香酮,侵染20 min,(25±1)℃暗处诱导。     

农杆菌Ri诱导丹参毛状根培养体系的优化

采用发根农杆菌R1601菌株浸染丹参叶片、茎段、叶柄、带节茎段等外植体.结果表明,相比茎和叶柄,丹参叶片更适宜诱导毛状根;带节茎段经发根农杆菌R1601侵染后,幼苗根系较为发达,粗壮.而由其他3种丹参外植体诱导产生的毛状根生长相对较慢,形成的根较细而弱.     

发根农杆菌转染纹党产生毛状根试验

试验采用正交试验法探究不同OD值、侵染时间及外植体类型对诱导纹党产生毛状根的最佳条件,结果表明,采用OD值0.8A、侵染时间10min与纹党幼嫩叶片作为外植体的试验组处理效果最好,毛状根诱导率可达55.6%。纹党幼嫩叶片作为外植体诱导毛状根处理效果最好,纹党根、纹党茎段及无菌苗皆不适宜作为诱导材料。经形态学观察,诱导出的根基本符合毛状根的特征,PCR扩增得到865bp的DNA目的条带,证明试验得到的根为发根农杆菌R1601侵染诱导得到的毛状根。     

发根农杆菌介导的花生遗传转化体系的建立

[目的]为花生的转基因研究和白芦藜醇的生物技术生产奠定基础。[方法]利用发根农杆菌R1601分别侵染花生的子叶、叶片和茎段,诱导毛状根;利用PCR技术检测毛状根。[结果]叶片和茎段在发根农杆菌R1601侵染后产生毛状根,但叶片诱导率较高,其诱导率达65.6%,更适合作为转化外植体。毛状根除菌后,能在MS培养基上自主生长。PCR扩增表明,T-DNA序列整合进花生的基因组中。[结论]建立了发根农杆菌介导的花生遗传转化体系。     

对羟基苯甲醇对小白菜天麻素积累和生长的影响

利用植物水培法,探讨营养液中添加对羟基苯甲醇,小白菜能否产生和积累天麻素,并进一步研究对羟基苯甲醇对小白菜生长的影响。结果显示,小白菜能以浓度依赖的方式将对羟基苯甲醇转化为天麻素,并在水培第6天达到最高值,但随着时间的推移,天麻素积累量逐渐降低。说明小白菜体内存在识别对羟基苯甲醇的糖基转移酶,由其催化生成的天麻素因进一步代谢而很难在小白菜中长期积累。水培营养液中添加对羟基苯甲醇,会抑制小白菜根的生长并延缓或阻滞株高的增大,但小白菜能在较短时间和一定浓度范围内抵抗对羟基苯甲醇的危害,而且这种抵抗能力与对羟基苯甲醇浓度和施加时间呈负相关。以上研究结果为以后大规模利用小白菜既经济又高效地水培生成天麻素,并进一步将其开发成为一种保健蔬菜奠定了基础。     

山豆根毛状根培养体系的建立与优化

为探索定向培养山豆根植物细胞及器官获取有效药用成分的新途径,为山豆根有效药用成分的大规模生产奠定基础,采用共培养法研究发根农杆菌R1601感染诱导山豆根无菌苗子叶产生毛状根,并在此基础上从不同培养液、不同蔗糖浓度和外源激素对毛状根生长的影响方面筛选山豆根毛状根生长的最佳培养液。结果表明:利用发根农杆菌R1601感染山豆根无菌苗子叶16min,在MS+AS 100μmol/L的固体培养基上培养可诱导产生毛状根,且诱导率最高,达66.67%;1/2 MS+IAA 0.5mg/L+5%蔗糖的培养液最有利于山豆根毛状根的生长。     

发根农杆菌菌株和烟草品种对毛状根诱导率的影响

采用3×3双因子设计,研究发根农杆菌菌株和烟草品种对烟草毛状根诱导率的影响。结果表明:各菌株在不同烟草品种上均诱导出毛状根,经PCR技术检测,确定了发根农杆菌Ri质粒的rolB基因已整合到烟草基因组中。不同烟草品种和发根农杆菌菌株均显著影响毛状根的诱导率;Sumxun毛状根平均诱导率最高,达到了53.4%,其适宜菌株为A4和ATCC15834;K326为34.2%,其适宜菌株为R1000;云烟85为25.6%,其适宜菌株为ATCC15834。     

黄芩毛状根的诱导及响应面法优化培养条件

[目的]应用响应面法优化黄芩毛状根的培养条件。[方法]利用发根农杆菌1.2556感染黄芩获得毛状根,在单因素试验的基础上,利用Box-Benhnkcn设计和响应面分析法对影响黄芩毛状根生长的培养条件(培养时间、温度、摇床转速和接种量)进行分析,优选最佳培养条件。[结果]毛状根在无外源激素的MS培养基上自主生长,表现出典型的发根特征。毛状根的最优培养条件为:培养时间24.95 d、温度27.4℃、摇床转速123.69 r/min、接种量0.500 g;在此条件下,黄芩毛状根的生长量为(fm)9.271 28 g/瓶。[结论]该研究优化了黄芩毛状根的培养条件,为黄芩的进一步开发利用提供了依据。     

党参毛状根诱导条件研究

[目的]研究党参毛状根的诱导条件。[方法]利用发根农杆菌A4、C58C1和A1476进行毛状根诱导,探讨发根农杆菌种类、外植体类型、菌液浓度、侵染时间和共培养天数等因素对党参毛状根诱导的影响。[结果]3种发根农杆菌中A4诱导率最高;茎段的诱导率最高;发根农杆菌浓度在OD_(600)为0.4时诱导效果较好;较佳侵染时间为5 min;共培养时间为2 d时诱导率较高;头孢噻肟钠浓度为300 mg/L时除菌效果较好。[结论]该试验为大量生产毛状根以及毛状根的后续研究提供试验基础。     

西洋参发根的诱导及其培养条件的研究

利用发根农杆菌A4菌株在西洋参根外植体上直接诱导产生发根。在1/2 MS和MS固体培养基上得到西洋参发根,并在B5液体培养基上建立起发根离体培养系,经连续多代的培养,发根仍保持旺盛生长状态。PCR扩增结果表明,发根农杆菌Ri质粒的rolC基因已整合到西洋参发根基因组中并得到表达。利用紫外分光光度法测得西洋参发根的总皂苷含量达3.88%。经对发根比生长速率的测定,确定1/2 B5培养基(15 g/L蔗糖)、摇床转速100 r/min、每4周更换1次培养基并继代培养1次为西洋参发根生长适宜条件。     

花生毛状根诱导及其体外培养

[目的]优化花生毛状根诱导条件,为体外培养毛状根生产白藜芦醇以及培养花生根结线虫奠定基础。[方法]研究不同的发根农杆菌及其菌液浓度、外植体类型、侵染时间、共培养时间、乙酰丁香酮浓度对花生毛状根诱导的影响。[结果]发根农杆菌ACCC10060的毛状根诱导率高于ATCC11325;幼叶外植体的毛状根诱导率高于子叶;最佳侵染菌液浓度为0.2～0.4;最佳共培养时间为2 d;最佳侵染时间为10～15 min;菌液中添加75μmol/L乙酰丁香酮(AS)可以提高毛状根诱导率。通过毛状根能在无激素的MS培养上自主生长以及毛状根冠瘿碱检测,确定发根农杆菌中Ri质粒中已整合到花生基因组中。毛状根体外培养的研究表明,液体培养效果好于固体培养,最佳液体培养基为无激素的MS培养基。[结论]该研究建立的花生毛状根培养体系,将为花生转基因技术的完善及利用毛状根生产白藜芦醇和无菌的花生根结线虫提供试验基础。     

发根农杆菌侵染大豆产生发根的研究

利用A4发根农杆菌,对不同大豆品种的无菌苗采用针刺的方法对子叶节部位进行接种,诱导毛状根产生,测定毛状根中大豆苷元的含量。结果表明,以合丰35为受体材料,毛状根诱导率最高,为58%,明显高于其他处理。发根中大豆苷元的含量是正常无菌苗和大田幼苗根中含量的2倍。