磷对体外培养番鸭破骨细胞生成及骨吸收功能的影响

本试验旨在观察磷对体外培养番鸭破骨细胞(OC)生存、生成以及骨吸收功能的影响.分离1日龄番鸭长骨骨髓细胞,培养过程中分别加入不同比例的NaH2PO4、10-8 mol/L 1,25-(OH)2D3二因子、不同浓度的NaH2PO4单因子.倒置显微镜观察细胞形态,更换含磷培养液后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h和7 d进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP),分别进行OC计数、形态观察;培养30 h内吖啶橙染色,观察OC凋亡情况,7 d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝情况.结果表明:在同一时间点,添加磷培养液均能抑制1,25-(OH)2D3诱导产生OC,并抑制OC的骨吸收活性,抑制程度与磷浓度成正比,3、5和7 mmol/L组OC数量均极显著少于对照组(P＜0.01);5 mmol/L组OC数量极显著少于3 mmol/L组(P＜0.01);5 mmol/L组与7 mmol/L组差异不显著;更换含磷液培养12、18、24和30 h,均可见磷含量达3 mmol/L时OC数量均极显著少于对照组(P＜0.01),磷浓度相同组,OC数量随着培养时间的延长而减少.添加磷培养液能够抑制体外诱导培养OC的生成及骨吸收活性,抑制体外培养成熟OC的生存.     

不同钙磷比例对体外培养番鸭破骨细胞生成及骨吸收功能的影响

从1～7日龄番鸭长骨骨髓分离破骨细胞（Osteoclasts，OC）进行培养，培养过程中添加不同摩尔浓度比例的钙磷双因子（CCa：Cp为2：1、1：1、1：2）。倒置显微镜观察细胞形态，于培养第1、3天进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP），培养7d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝，研究不同钙磷比例对番鸭OC生成及骨吸收功能的影响。结果显示，培养第3天时试验组TRAP阳性细胞多于对照组，差异极显著（P〈0．01）。试验组中除CCa：Cp=1：1组与CCa：Cp=2：1组之间无显著差异外（P〉0．05），其余各组间差异均极显著（P〈0．01）。扫描电镜观察，象牙片吸收陷窝程度与钙磷比例大小（CCA：Cp为2：1、1：1、1：2）成反比。证实合适比例的钙、磷（CCa：CP=2：1）通过抑制OC生成和活化，抑制OC的骨吸收活性。     

两种方法所获鸭破骨细胞数量及活性比较

对直接从鸭骨髓腔机械分离的成熟破骨细胞（osteoclasts,OC）和由鸭骨髓来源单核细胞融合成的OC样多核巨细胞（multinucleatedgiantcells,MNGCs）进行培养,分别进行抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistantacidphosphatase,TRAP）染色并计数,扫描电镜观察象牙片吸收陷窝,比较了2种方法获得0C的骨吸收功能。结果显示,2种方法均能分离培养出TRAP阳性且具有骨吸收功能的多核OC,但直接分离获得的成熟OC骨吸收功能更强。     

骨保护素和核因子κB受体活化因子配基对体外培养鸭破骨细胞的影响

探讨了核因子κB受体活化因子配基(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)和不同浓度骨保护素(Os-teoprotegerin,OPG)对鸭破骨细胞(Osteoclasts,OC)生成和活化的影响.从7日龄内番鸭长骨骨髓分离破骨细胞,添加1,25-(OH)2D3进行诱导培养15 h后,更换含不同细胞因子的培养液(对照组:不加细胞因子;30 μg/LsRANKL组;30 μg/L sRANKL+10 μg/L OPG组;10μg/L OPG组;50 μg/L OPG组;100 μg/L OPG组),继续培养.倒王显微镜进行OC形态学观察,比较各组培养3 d后抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性OC数量、培养7 d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝.结果表明:50 μg/L OPG组、100μg/L OPG组OC数均极显著少于10 μg/LOPG组(P<0.01);添加OPG组OC数均极显著少于30μg/L sRANKL组(P<0.01),象牙片吸收陷窝随OPG添加浓度的增加而减少,面积减小,陷窝深度变浅.RANKL能够促进OC的生成及活化,而OPG可与RANKL竞争性地结合RANK抑制OC的生成和活化,从而抑制OC的骨吸收.     

番鸭破骨细胞骨髓诱导培养体系的建立

无菌分离、冲洗7日龄内番鸭长骨骨髓,收集、培养破骨细胞（Osteoclasts,OC）。培养过程中对照组不添加钙、磷因子,试验组加入不同浓度比例的钙磷双因子（Ca∶P分别为2∶1、1∶1、1∶2）,进行破骨细胞骨髓诱导培养。倒置显微镜观察细胞形态,于培养1、3d进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）计数,培养7d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝。结果显示,培养3d时试验组TRAP阳性细胞均多于对照组,差异极显著（P〈0.01）;试验2∶1组与1∶1组差异不显著（P〉0.05）,其余各组间均差异极显著（P〈0.01）;扫描电镜观察,象牙片吸收陷窝程度与钙磷比例大小（2∶1、1∶1、1∶2）成反比。当钙磷比例为1∶2时,破骨细胞数量最多,功能活跃。结果表明,鸭破骨细胞骨髓诱导培养体系已成功建立。     

1,25(OH)_2D_3对体外诱导培养鸡胚破骨细胞的影响

为了研究1,25(OH)2D3对体外诱导培养鸡胚破骨细胞的作用,从18日龄鸡胚长骨(股骨和胫骨)分离骨髓细胞进行培养,在培养过程中分别添加10-7,10-8和10-9mol/L的1,25(OH)2D3。通过倒置显微镜观察其活体形态,对培养1,3,5,7 d的破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)鉴定,培养7 d后进行骨吸收陷窝和功能分析。结果显示,10-8mol/L组除第1天和其他各组差异不显著以外,第3,5,7天诱导所生成的破骨细胞的数量都显著高于10-7和10-9mol/L这2组(P0.05),极显著高于对照组(P0.01)。经扫描电镜观察,无论是吸收陷窝面积还是陷窝吸收程度,10-8mol/L组均显著高于其2组;对照组无明显陷窝。由此可知,1,25(OH)2D3能诱导鸡胚骨髓细胞形成破骨细胞,且浓度为10-8mol/L时效果最好,所诱导的破骨细胞活性较高。     

鸡破骨细胞分离和培养方法的改进

为获得大量有活力的鸡破骨细胞(Osteoclast,OC),本试验选取18日龄鸡胚,从长骨中提取骨髓细胞,用胰酶消化,40%和70%的percoll梯度离心分离骨髓间质细胞。在此基础上,用60 ng/mL核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、50 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导培养。采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、骨吸收陷窝以及标志性蛋白TRAP、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、组织蛋白酶K检测鉴定破骨细胞。结果显示,诱导后的TRAP阳性细胞剧增,TRAP、MMP-9和组织蛋白酶K蛋白表达极显著上调,可在牛骨上形成大量的骨吸收陷窝。研究表明,该方法是一种快速、实用、高效的鸡破骨细胞分离培养技术。     

鸭胚与小鼠的破骨细胞特性比较

本文分别采集鸭胚与小鼠的破骨细胞(osteoclast,OC),通过检测TRAP阳性细胞数及骨吸收陷窝面积,比较鸭胚与小鼠的OC形态、数目及活性。结果表明,鸭胚OC形状不规则、体积较大、核多且主要分布于胞质,而小鼠OC形状较规则、体积小、核多且大多分布于细胞边缘;随机选取视野中,鸭胚与小鼠OC数差异不显著;而鸭胚OC骨吸收陷窝面积显著大于小鼠OC骨吸收陷窝面积(P0.05)。表明鸭胚与小鼠OC均具有OC的普遍特征,但两者在骨吸收活性方面存在差异。     

骨保护素对破骨细胞活性的影响

旨在探讨骨保护素(osteoprotegerin,OPG)对破骨细胞(osteoclast,OC)活性的影响.采用小鼠原代OC模型,在体外培养的基础上添加不同浓度OPG,通过TRAP阳性细胞计数、细胞骨架F-actin染色、骨吸收功能检测等手段,观察OPG对体外培养OC的作用.结果发现,OPG能够直接作用于OC,减少其数量,破坏其F-actin环,减弱其骨吸收活性,且随OPG浓度的增加,对OC的影响更加明显.结果表明,OPG能够减少OC数量并抑制其骨吸收活性,呈现剂量效应.     

TNF-α/IL-1α机制对破骨细胞形成和活化的影响

为了探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)/鼠重组白介素-1α(IL-1α)是否能独立于RANKL/RANK/ OPG机制之外直接刺激破骨细胞(OC)的形成和活化.提取4周龄C57雌性小鼠脾细胞,加入鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)TNF-α(±IL-1α)进行体外培养,同时加入骨保护素(OPG)和可溶性NF-κB受体活化子配体(sRANKL)以区别RANKL/RANK/OPG机制.通过OC形态学观察、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、骨吸收陷窝方法鉴定OC的形成和活化水平.结果显示:TNF-α(±IL-1α)能诱导睥细胞融合产生TRAP阳性的多核细胞并在象牙片上产生吸收陷窝,加入OPG不能阻断其诱导破骨细胞形成和产生骨吸收陷窝.结果表明:在MCSF存在的情况下,TNF-α以一种独立于RANKL/RANK/OPG之外的机制诱导破骨细胞的形成和活化,而且IL-1α能显著促进TNF-α的诱导作用(P＜0.05).