高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株的鉴定及部分Nsp2基因序列分析

本研究采集山西省不同地区的发病猪脏器组织与血液样品,采用特异性 RT-PCR方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)样品16份,应用设计的特异性引物扩增出Nsp2基因序列,利用DNAStar生物信息学分析软件,对获得的序列与国外代表毒株VR-2332、国内代表毒株CH-1a、BJ-4、HB-1及PRRSV变异毒株HuN4和JXA1的序列进行了比较,绘制系统发生树。氨基酸序列比较分析发现山西省流行毒株同源性分别在69.8%~71.7%、85.3%~87.9%、68.7%~70.6%、91.7%~94.3%、94.3%~98.5%、95.1%~98.9%。所获得的16株病毒之间的同源性在90.9%~100%之间。研究结果发现所获得的序列同源性与国内近几年流行的PRRSV的变异毒株HuN4和JXA1毒株的序列同源性最高,分别在94.3%~98.5%与95.1%~98.9%之间,Nsp2 基因缺失位置一致,其Nsp2均有2个部位出现了缺失,即Nsp2基因分别为编码1个氨基酸的3个核苷酸的缺失和编码29个氨基酸的连续87个核苷酸的缺失,结果表明,山西省目前流行PRRSV的变异毒株与国内流行株属于同一分支。     

PRRSV浙江分离株Nsp2基因序列分析

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)临床上主要表现为流产、早产、死胎、仔猪成活率下降和育成猪呼吸系统病变等.本研究用RT-PCR对2008年-2009年采集于浙江省部分发病猪场的41株疑似猪繁殖与呼吸综合征病猪的脾、肺、淋巴结混合组织样本进行PRRSV病毒检测和Nsp2基因序列分析.结果显示,41株PRRSV流行毒株中20份...     

两株高致病性PRRSV湖北分离株ORF5与Nsp2基因序列分析

2013年从湖北两个发病猪场采集疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,接种Marc-145细胞,可致明显细胞病变,各分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HBHS株和HBXN株)。采用RTPCR方法,对ORF5基因序列和Nsp2基因部分序列进行扩增并测序,并用DNA MAN软件将测序结果与国内外发表的13株参考毒株进行比对分析。结果显示,2株分离株Nsp2基因与国内高致病性JXA1、GD2007、GD2008毒株的氨基酸同源性很高,介于98.5%~99.5%;且该基因与国内其他变异株有完全一致的缺失特征;ORF5基因与国内高致病性毒株的氨基酸同源性为98.1%~99.5%,且系统进化树遗传距离很近,同处一个基因群中,而与CH-1a等经典毒株较远。这两株分离株均属于PRRSV美洲型变异株,此结论为该病的防治及疫苗的设计奠定了基础。     

云南高致病性PRRSV Nsp2和ORF5基因变异分析

为研究云南省高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异特征,采用RT-PCR对云南省2007年-2008年采集的56份猪组织样品中PRRSV Nsp2、ORF5基因进行检测,获得阳性样品12份,选择6份代表性样品将其PCR产物纯化后,克隆至pMD18-T载体后测序,并与已知代表毒株进行序列比对及系统发育分析。分离株Nsp2基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为94.9%～97.2%和91.4%～95.7%,其中1份样品(07YNMG)在486位～489位氨基酸发生了缺失。在系统进化树上可将其划分为4个亚组群,分离株分别与广东、贵州、浙江、山东等地分离毒株遗传关系密切。ORF5基因核苷酸与氨基酸序列同源性分别为97.8%～99.5%和97.0%～99.5%。氨基酸序列未发现缺失,仅个别位点发生点突变。系统进化树分析表明,分离株与浙江、贵州、广东、云南株亲缘关系较近,而与国内疫苗株以及PRRSV经典代表毒株CH-1a距离较远。     

两株高致病性PRRSV河北分离株NSP2和ORF5基因的克隆及遗传变异分析

从河北省保定某两个猪场疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征病料中分离出能引起Marc-145细胞病变的病毒,经RT-PCR鉴定证明,该病毒为美洲型PRRSV,分别命名为BD1和BD2株。并将其克隆、测序,与国内外PRRSV分离株的Nsp2和E基因序列进行了比较。结果表明,与PRRSV高致病性毒株JXA1、GD、WUH1、SY0608、HUN0701的核苷酸序列同源性为95.3%~96.5%,BD1和BD2株ORF5基因存在部分突变,没有缺失,与国内高致病性PRRSV分离株JXA1、HUB1、Jiangxi-3、Henan-1、WUH1的同源性高达97.2%~99.3%。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GD07b株的分离鉴定及Nsp2基因同源性分析

在某集约化猪场采集疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征病死猪的肺、淋巴结等病料,进行检测,将RT-PCR检测结果为阳性的病料处理后接种Marc-145细胞,培养72~96 h后细胞单层出现明显的CPE。收获病毒经RT-PCR方法检测,并将此PCR产物经纯化后连同引物送相关公司进行测序,结果显示,该病毒为繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因缺失株,将该病毒命名为HPPRRSV-GD07b株。将GD07b株序列与国内外19株PRRSVNsp2基因进行比较分析,结果表明,该毒株Nsp2基因与CH-1a株等4株PRRSV经典株同源性较低,为60.5%~81.6%;而与14株变异株同源性较高,为90.6%~98.9%。     

广西高致病性 PRRSV Nsp2基因的克隆、序列分析和抗原表位预测

根据猪繁殖与吸吸综合征病毒(PRRSV)VR2332 Nsp2基因序列合成特异性引物,对广西分离的高致病性PRRSV进行RT-PCR扩增,将扩增出的796 bp片段插入pMD18-T载体中进行序列测定和分析,并用DNA Star软件对Nsp2基因推导的氨基酸序列进行了表位分析。结果显示,广西3个县、市的PRRSV分离株Nsp2基因第483位和第532位~第560位氨基酸发生缺失,核苷酸序列之间的同源性为97.0%~97.4%,推导编码的氨基酸序列之间的同源性为93.6%~94.7%;与PRRSV VR2332株、MLV株和CH-1a株核苷酸之间的同源性分别为79.0%~79.2%、78.8%~78.9%和88.2%~89.3%;氨基酸之间的同源性分别为59.4%~60.2%、59.4%~60.2%和70.9%~81.6%,表明广西3个县、市的PRRSV分离株Nsp2基因与VR2332株、MLV株和CH-1a株比较变异较大。表位分析表明,由于博白株的Nsp2基因的第532位~560位氨基酸的缺失,与VR2332株比较,其亲水性、抗原指数均发生了大的变化。     

PRRSV分离株Nsp2基因和ORF5基因的遗传变异分析

为了解山东省PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2007～2009年分离到的14株山东省内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和ORF5基因序列的测定和分析.结果显示,与参考毒株JXA1相比,14株PRRSV Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到96.1%～99.8%和98.0%～99.8%,氨...     

PRRSV天津分离株Nsp2基因的克隆和遗传进化分析

从天津市病猪中分离得到3株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),分别命名为TJ-S1、TJ-S2和TJ-S3。根据GenBank中PRRSV BJ-4株的基因序列设计并合成针对Nsp2基因高变区的引物,RT-PCR扩增目的基因并将其克隆到pGEM-T载体进行测序,并与国内外已发表的毒株序列进行比较。结果表明,3个毒株都是美洲型PRRSV,而且TJ-S1、TJ-S2株的Nsp2基因发生30个氨基酸的不连续缺失;基因系统发育树分析表明,TJ-S1株、TJ-S2株与HuN株、SD-14株的亲缘关系很近,TJ-S3株与CH-1a株的亲缘关系较近。     

PRRSV分离株Nsp2基因和ORF5基因的遗传变异分析

为了解山东省PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2007~2009年分离到的14株山东省内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和ORF5基因序列的测定和分析。结果显示,与参考毒株JXA1相比,14株PRRSV Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到96.1%~99.8%和98.0%~99.8%,氨基酸序列同源性分别达到92.9%~100%和97.5%~99.5%。序列分析结果表明,14株毒株在Nsp2蛋白内部均存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失;ORF5基因编码的GP5蛋白不存在缺失,但存在点突变。遗传进化分析表明,07年分离毒株JQ与参考毒株JXA1亲缘关系很近;09年分离的12株PRRSV,2株仍与国内2006~2007年间的分离株在同一分支,9株已经处在不同分支,1株单独处在一个分支。2007~2009年山东地区流行的PRRSV分离株具有年度特征,无明显的地域特征。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TS株结构蛋白基因的克隆与变异分析

从河北唐山分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),接种Marc-145细胞,经2代盲传后出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为TS株。利用RT-PCR扩增出TS株各基因的cDNA片段,然后克隆入pMD19-T载体并测序。应用DNAStar软件,结合其它河北毒株与多株GenBank中已发表的PRRSV毒株相应基因进行序列比较。结果表明:PRRSV TS株与VR-2332同源性为88.9%-94.7%,与河北省2007年以来发现的8个毒株同源性很强,为98.0%-99.7%;与LV株的亲缘关系较远,同源性为61.2%-69.0%,属于美洲型。遗传进化树表明国内美洲型分离株明显分为2个亚群,所有河北省流行毒株属于同一亚群,且TS株与高致病性代表毒株JXA1关系非常近。本研究将为河北省预防和控制PRRS提供重要的理论数据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Nsp2基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法,从吉林省部分地区猪场的病料中扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的Nsp2基因并测序。应用DNAStar 7.0、ClustalX 1.83、MEGA 4.0软件对测序结果进行分析,并与NCBI上已登录的PRRSV代表毒株的Nsp2基因进行序列比对,结果显示,得到的Nsp2基因与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为62.0%～87.5%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为97.8%～98.9%;氨基酸序列比对结果显示与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为34.4%～59.0%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为95.1%～98.4%。因此,引起吉林省部分地区猪场发生猪繁殖与呼吸综合征的PRRSV与国内流行的高致病性PRRSV毒株亲缘关系较近。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Nsp2基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法,从吉林省部分地区猪场的病料中扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Nsp2基因并测序.应用DNAStar 7.0、ClustaⅨ 1.83、MEGA 4.0软件对测序结果进行分析,并与NCBI上已登录的PRRSV代表毒株的Nsp2基因进行序列比对,结果显示,得到的Nsp2基因与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为62.0%～87.5%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为97.8%～98.9%;氨基酸序列比对结果显示与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为34.4%～59.0%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为95.1%～98.4%.因此,引起吉林省部分地区猪场发生猪繁殖与呼吸综合征的PRRSV与国内流行的高致病性PRRSV毒株亲缘关系较近.     

Cloning and Sequence Analysis of Nsp9 Gene of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus FS Strain

In order to evaluate the function of Nsp9 gene,the target gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) FS strain was amplificated and sequenced after being cloned into the pMD18-T vector.The physical and chemical properties,homology,hydrophilicity,surface probability plot,antigenic index,secondary structure and subcellular localization were predicted by various softwares.The results showed that the length of Nsp9 was 1 929 bp,its predicted molecular weight was 70.5 ku and pI was 7.78,and it was unstable protein.There were many antigen sites,and the flexibility and hydrophilicity of Nsp9 were ideal.The study showed that Nsp9 possessed potential antigenicity,and it fits for preparation of monoclonal antibodies.The results of subcellular location showed that it might exist in the cytoplasm.Nsp9 of FS strain shared 96.9% to 98.9% amino acid homology with other strains of the some hypotype.Some amino acid mutations were found between the parent strains and vaccine strains,and insertions and deletions could be found among the European strains and the American strains.Whether these insertions and deletions correlate with the virulence and polymerase needed further research.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒FS株Nsp9基因的克隆与序列分析

为了对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp9基因的功能进行预测,利用RT-PCR法从细胞毒中扩增PRRSV FS株的Nsp9基因,并将其克隆至pMD18-T载体上,测序得到Nsp9基因序列,利用多种生物信息学软件分析Nsp9序列生物学信息。结果显示,Nsp9基因全长1 929 bp,目的基因的蛋白分子质量为70.5 ku,pI为7.78,表明该蛋白不稳定;抗原性分析显示,Nsp9基因存在多个抗原位点,柔韧性较好,多处位点的亲水性较强,适合作为单抗制备的表位;同种亚型不同毒株的Nsp9基因氨基酸同源性为96.9%～98.9%,这表明Nsp9基因高度保守,可进一步作为检测靶蛋白用于猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的诊断与疫苗免疫;亚细胞定位预测该基因可能定位于细胞质中,而不是细胞核内;同源建模预测三级结构结果显示,三维结构呈右手型,具有3个亚结构域,没有信号肽。此外,亲本株Nsp9基因与疫苗株Nsp9基因存在多个氨基酸的突变,这些氨基酸的插入与缺失是否与病毒的聚合酶活性和毒力有关还需要进一步试验验证。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒BJSD株和BJPG株序列分析

本研究旨在预测与分析高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒BJSD株和BJPG株序列特点,为其下一步研究作准备。利用分子生物学软件及服务器,对BJSD株和BJPG株全序列及各结构蛋白的生化特性、溶解性和核定位信号等进行了分析,结果显示BJSD株和BJPG株至少有12个非结构蛋白和6个结构蛋白;同源性比较结果显示GP3和GP5蛋白变异性高,M和N蛋白保守。GP3、GP5和M蛋白糖基化位点与参考株相比有变化,GP2、GP4和N蛋白糖基化位点与所有参考株一致。服务器预测BJSD株 和BJPG株GP2、M和N蛋白生化特性显示各项数据完全一致,其中N蛋白的碱性氨基酸比例明显高于其他蛋白,总平均亲水值明显低于其他蛋白;GP2、GP3和GP4蛋白不稳定,GP5、M和N蛋白稳定。BJSD株和BJPG株可溶性只有GP3和GP5略有差别,其余蛋白数据一致,6个结构蛋白预测不溶性概率均在66%以上,GP3不溶性概率最高。BJSD株和BJPG株结构蛋白核定位结果显示,两株仅GP3和GP5有差异,其余蛋白分布情况完全一致。可以利用以上一些不同于以往各代表株的特点,对PRRS的诊断和防制做进一步的研究。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GX1003株全基因序列测定与分析

为了解广西省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况,采用RT-PCR对PRRSV广西地方分离株GX1003株全基因组进行分段扩增、测序与分析。结果表明,不包括Poly(A)尾,GX1003株基因组全长为15 320nt。同源性分析表明,GX1003株与比对的国内外PRRSV美洲型毒株全基因核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别为85.0%～99.4%和82.1%～99.1%,与欧洲型代表株LV株的同源性分别为60.6%和51.3%。序列分析表明,GX1003株的NSP2编码区存在第481位aa和第533～561aa发生30个氨基酸的不连续缺失,具有高致病性PRRSV(HP-PRRSV)的遗传特征;同时,在不同编码区出现与HP-PRRSV代表株JXA1株不同的遗传变异现象。遗传进化分析表明,比对的所有美洲型毒株可以分为4个亚群,GX1003株分布在以JXA1株为代表的亚群4中。表明PRRSV广西地方分离株GX1003株属于HP-PRRSV,但其基因组在不同区域发生了新的遗传变异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州PT分离株Nsp2基因克隆及序列变异分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)贵州PT分离株Nsp2基因序列特征,选择PRRSV JXA1株Nsp2基因保守区域设计并合成特异性引物,用RT-PCR方法扩增出PRRSV贵州PT分离株Nsp2基因片段,克隆至pMD18-T载体并测序,应用DNAStar、PSORTⅡ、TMHMM、MLRC等软件对Nsp2序列的理化参数、同源性、亲水性、表面可及性、抗原性和亚细胞定位等进行分析和预测。结果显示,该基因cDNA长588 bp,蛋白理论分子质量为21.5674 ku,理论pI值为5.02,为不稳定蛋白,具有良好的形成抗原表位的条件。亚细胞定位结果表明该蛋白极有可能位于细胞核,其Nsp2基因与所选18个毒株相应片段的同源性为80.0%~99.8%。预测Nsp2蛋白具有良好的抗原性,在PRRSV的流行过程中,Nsp2基因不断发生遗传变异,产生新的变异序列。