H7亚型禽流感RT-PCR诊断方法的建立

参照GenBank中已发表的H7亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因设计合成了一对预计扩增片段大小约为310bp的引物。利用这对引物,通过对RT-PCR反应体系和反应条件的优化,建立了针对H7亚型禽流感的RT-PCR检测方法。敏感性试验和特异性试验结果表明,该方法敏感性高,最低可检出100pg的AIV-H7的mRNA,且应用该引物对新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)及其他亚型的流感病毒(H1、H3、H5、H9)在相同反应条件下未扩增出任何片段,具有较好的特异性。用所建立RT-PCR方法检测发病鸡组织病料及咽、肛拭子,检测结果与鸡胚病毒分离结果相比,阳性符合率高达90.6%。     

禽流感病毒H5、H9亚型的多重RT-PCR鉴别诊断

根据禽流感病毒H5、H9亚型的HA基因序列,设计了两对RT-PCR引物,同时对H5、H9亚型进行了多重RT-PCR扩增,得到了两条清晰的目的带.将目的带回收并进行测序,同源性比较结果证明其为禽流感H5、H9亚型的HA基因序列,作者对多重RT-PCR进行反应条件优化以及敏感性与特异性测定,证明该方法的敏感性和特异性都比较好.初步应用于30份临床病料,其检测结果与病毒的分离培养一致,比电镜和琼扩的检出率高,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应,可用于禽流感病毒H5、H9亚型的鉴别诊断.     

禽流感病毒H5、H7和H9亚型一步法多重RT-PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,参考GenBank中H5、H7和H9亚型AIV的HA基因序列的保守区域,利用Primer 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物,预期特异扩增H5AIV片段大小为380bp、H7AIV为501bp、H9AIV为732bp。经过反应条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的一步法多重RT-PCR方法。该方法特异性强,对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体检测结果为阴性;敏感性高,H5、H7和H9亚型AIV RNA的最低检出量分别为10-4、10-4、10-2拷贝/μL。初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的分子生物学诊断方法。     

H5、H9亚型禽流感病毒快速鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断我国目前流行的禽流感，根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计并合成2对特异性引物，利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT—PCR扩增，并对二联RT—PCR检测方法进行了敏感性及特异性试验。结果表明，这2对引物能特异地扩增H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段，大小分别为490bp和686bp；该检测方法敏感性高，特异性强；初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立

为了简便、快速、准确的检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H5、H7、H9亚型(lumpy skin disease virus,LSDV),本研究通过对禽流感病毒HA2基因保守区域的分析,设计、合成特异性引物和探针,结合Taq man-MGB探针技术,建立禽流感病毒H5、H7、H9亚型...     

应用多重引物RT-PCR快速诊断禽流感亚型

将本实验室分离保存、已经过PCR扩增、核酸测序鉴定的三种不同亚型禽流感病毒(AIVH5N1、H6N2、H9N2)分别接种鸡胚,收集尿囊液,分离提取AIV总RNA。参考H1￣H15亚型禽流感病毒的核蛋白(NP)基因序列以及H5、H6、H9亚型AIV血凝素(HA)基因序列,设计四对引物:NP1,NP2;H5P1,H5P2;H6P1,H6P2;H9P1,H9P2,混合为PCR扩增多重引物MP1,下游引物NP2、H5P2、H6P2,、H9P2混合为逆转录反应多重引物MP2。AIV总RNA在相同反应条件下经MP2逆转录,用MP1进行PCR扩增,AIVH5亚型材料得到205bp,563bp两条扩增带,AIVH6亚型材料得到205bp,233bp两条扩增带,AIVH9亚型材料得到205bp,690bp两条扩增带,都与实验设计相符合,阴性材料没有扩增带。该方法成功实现四对引物进行RT-PCR反应同时检测出AIV,准确诊断H5、H6、H9三种禽流感亚型,检测时间短,特异性强,能及时检测出AIV亚型。     

禽流感病毒H5和H9亚型多重RT-PCR快速检测方法的建立

根据禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）和血凝素（HA）基因序列，设计1对用来鉴定A型AIV特异性引物（NP—F,NP—R）和2对用来鉴定AIV H5和H9不同亚型特异性引物（H5-F，H5-R；H9-F，H9-R），建立了多重RT—PCR快速检测方法。该方法能同时从一种病毒扩增出2条核酸带。分别为型（NP：330bp）和亚型（H5A：550bp，或H9A：490bp）。通过对105份样品进行检测。并与病毒分离及琼脂扩散（AGP）血清学方法作平行对比，两者之间符合率达100％；试验灵敏度为10^2ELD50。结果表明，建立的多重RT—PCR为检测H5、H9亚型AIV提供了一种快速、经济、易行的技术。     

鉴别禽流感病毒H5、H7、H9亚型及N1-N9亚型RT-PCR方法的建立

快速检测和鉴定禽流感病毒(AIV)亚型对该病的防控具有重要意义。参考文献报道设计合成引物,采用二步RT-PCR方法,从H5/H7亚型AIV血凝抑制抗原和H9鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,建立禽流感病毒通用、H5/H7/H9亚型和N1-N9亚型鉴定方法。结果表明:针对AIV基质蛋白基因(M)和核蛋白基因(NP)的通用检测方法能有效扩增出目的条带;鉴别H5/H7/H9亚型的复合PCR扩增结果与预期目标一致;鉴别N1-N9亚型PCR方法扩增出N1/N2/N6/N9亚型目的条带;与其他4种常见病原无交叉反应。初步应用该方法检测样品,证明该方法对禽流感快速诊断和亚型鉴定具有潜在的应用价值。     

H5、H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成两对特异性引物,扩增出H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段、大小分别为490 bp和686 bp;该检测方法敏感性高,特异性强,初步建立起快速,敏感特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

H5、H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成2对特异性引物,利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这2对引物能特异性地扩增出H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490bp和686bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

北美H7亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

本研究通过分析NCBI数据库中H7亚型禽流感病毒HA基因序列,根据该基因设计引物,建立了针对北美H7亚型禽流感病毒HA基因的一步法RT-PCR检测方法,并对反应条件进行了优化。该方法可特异地检出北美H7亚型禽流感病毒HA基因,而未检出欧亚分支H7亚型禽流感病毒H7N2和H7N9、其他亚型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1、H5N8和H9N2),以及新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒;检测方法的灵敏度可达0.1 pg/μL。该检测方法的建立为监测北美H7亚型禽流感病毒提供了良好的技术支撑,可用于外来禽流感病毒的检测。     

H5亚型禽流感病毒间接免疫荧光快速诊断方法的建立

本研究以当前严重威胁我国养禽业的高致病性禽流感H5亚型病毒为研究对象，病毒在犬肾细胞（MDCK）上培养增殖，经蔗糖梯度离心对病毒进行纯化，免疫清洁级的新西兰公兔，高免血清经辛酸-硫酸铵法和葡聚糖G50柱纯化，制得第一抗体。以FITC标记的山羊抗兔IgG为第二抗体，通过反应条件的优化，建立了间接免疫荧光快速诊断方法。本法的最佳检测组织为心肌和胰腺，检测时间只需3小时，本法可检出人工感染后36小时尚未表现出临床症状鸡只中的病毒，对禽流感H7亚型、H9亚型病、新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎禽出败等病料进行特异性检验结果均为阴性。运用本方法对69个禽场的临床病料进行了检测，检测结果与鸡胚分离法进行比对，9个阳性场（广东省2004年9个原疫点的病料）的9份病料中，检出8份阳性；而鸡胚分离法阴性样品，本法检测结果与之完全相符。本法用于禽流感H5亚型病毒的快速诊断具有快速、简便、敏感、特异、费用低廉和不存在交叉污染等优点，在当前流行的H5亚型高致病性禽流感快速诊断中具有良好的应用前景。     

H5和H7亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链反应快速检测及鉴别方法的建立

参考禽流感病毒(AIV)M基因和HA基因序列设计了3对引物，其中1对为针对不同HA亚型AIV的通用引物，另外2对为分别针对AIVH5和H7亚型的特异性引物。这些引物所扩增的cDNA片段大小分别为244、860和634bp。利用这3对引物，通过对多重RT—PCR扩增条件的优化，成功建立了快速检测鉴别AIVH5、H7亚型的多重RT—PCR技术。特异性和敏感性试验结果表明，该技术对AIV H5亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和860bp的cDNA片段；对AIV H7亚型同时扩增出2条大小分别为244bp和634bp的cDNA片段；对AIV H5和H7亚型混合样品能同时扩增出3条大小分别为244、860和634bp的cDNA片段；对其他AIV HA亚型只扩增出1条244bp的cDNA片段；对其他常见禽病病原扩增均为阴性；该多重RT-PCR对AIV RNA、AIV H5和AIV H7亚型RNA的最低检出量分别为10、100和100Pg。     

SYBR Green Ⅰ定量RT-PCR快速检测H5亚型禽流感病毒方法的建立

针对H5亚型禽流感H基因保守序列设计引物,建立基于SYBR Green Ⅰ检测模式的荧光定量RT-PCR(real-time ILT-PCR,RtLT-PCR),最低检测限为2.1x102拷贝质粒DNA,扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm=(79.5±0.3)℃,对H5N1亚型和H5N2亚型禽流感病毒灭活抗原均有阳性扩增,对H7、H9亚型禽流感病毒、健康鸡、鸭组织及其它家禽常见病原11NAJL扩增,可重复性好,批内变异系数及批间变异系数分别为2.99%和5.12%;检测速度快,从样本处理到报告结果仅需5 h.     

H5亚型禽流感病毒一步法复合RT-PCR检测方法的建立

针对近年来H5亚型禽流感(AI)频发的严峻形势,本研究通过分析GenBank中AI的221个HA基因和M基因序列,在保守区内用Oligo4.0软件设计合成2对引物,建立了能同时鉴别AIV型与亚型的一步法复合RT-PCR,其扩增的目的片段大小分别为372、229 bp。通过对AIV尿囊液和棉拭子浸出液进行不同稀释倍数检测,结果病毒在尿囊液最低检出量为10-4稀释。用病毒分离和该方法同时检测不同脏器、口咽及泄殖腔棉拭子样品,结果该方法检测灵敏度比病毒分离低10~100倍。用该方法检测H1~H15亚型AIV和鸡新城疫病毒等其他14种禽病毒,结果所有AIV均有M基因229 bp的目的条带,且仅H5亚型AIV有372 bp的特异性条带,而其他14种禽病毒无任何目的条带。     

H5亚型和N6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、简便的H5亚型、N6亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,根据GenBank中H5亚型、N6亚型AIV的HA和NA基因保守序列,分别设计了2对特异性引物,通过优化条件,建立了H5亚型和N6亚型AIV二重RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对H5N6亚型AIV特异性扩增出418bp和251bp目的片段,对H5Ny(y≠6)亚型AIV扩增出418bp目的片段,对HxN6(x≠5)亚型AIV扩增出251bp目的片段,对其他亚型和常见的禽病病原体均未扩增出目的片段;敏感性结果显示,该方法对H5亚型和N6亚型最低检测限为1.59×10-5ng/μL。本研究建立的H5亚型和N6亚型AIV检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,为H5亚型和N6亚型AIV临床检测以及防控提供了有效方法。     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒多重反转录聚合酶链式反应检测方法的建立

参考GenBank登录的H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的血凝素基因序列,利用DNAStar软件分析其同源性,利用Primer Premier5.0软件设计3对分别针对AIVH5、H7和H9亚型的特异性引物。3对引物所扩增的cDNA片段大小分别为427、228、830bp。结果显示,利用3对引物,通过对多重RT-PCR扩增条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。该方法对H5、H7和H9亚型AIV能同时扩增出3条大小分别为427、228、830bp的cDNA片段,与其他常见禽病病原不存在交叉反应。该方法对H5、H7和H9亚型AIVcDNA的最低检出量分别为10-4、10-2和10-4。结果表明,本试验建立了可同时检测鉴别H5、H7和H9亚型AIV的多重RT-PCR技术。     

H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

H7亚型禽流感病毒致病性强、危害性大,是进出口家禽及禽类产品的主要检疫对象。为了加强对H7亚型禽流感病毒的检测,建立新的快速检测方法。通过对GenBank已报道的H7亚型禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了两套分别针对H7N2亚型和H7Nx亚型的特异性引物和用FAM标记的Taq Man MGB核酸探针,建立了H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR方法(Real-time RT-PCR)。该方法特异性好,不存在假阴性和假阳性的现象;敏感性高,对禽流感病毒H7亚型标准HI抗原检测的敏感性达到10-5,能够满足口岸禽流感病毒快速、准确、有效的检疫需求。     

H5、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒的多重RT-PCR检测

根据Genbank注册发表的H5、H9亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因和新城疫病毒(NDV)的HA基因序列,设计多对引物,每种病毒各筛选出一对特异性好、灵敏度高的引物,其中FP1/FP2扩增H5亚型AIVHA基因片断长为545bp;P3/P4扩增H9亚型AIVHA基因片断长为321bp;P11/P22扩增NDVHA基因片断长为672bp。用RT-PCR方法,通过特异性试验、灵敏度试验,H5、H9亚型AIV和NDV引物的灵敏度分别达到了1:104、1:108、1:104稀释度,与传染性支气管炎(IB)、传染性法氏囊病(IBD)、传染性喉气管炎(ILTV)、传染性鼻炎(IC)、霉形体(MS)、H1N1猪流感等抗原无交叉反应。实验结果表明,本研究建立了检测H5、H9亚型AIV和NDV的多重RT-PCR方法,混合引物的最佳退火温度为50℃,鉴定检测仅需4小时。     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

旨在提高对禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）检测效率,及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及H5、H7和H9亚型的HA基因序列保守区域,设计并合成了相关探针和引物,建立了禽流感病毒（AIV）四重荧光RT-PCR检测方法,该方法可在检测禽流感病毒（AIV）的同时,确定病原是否为H5、H7和H9亚型。结果显示,该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10^-5 ng·μL^-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品,经检测,其中有60份样品为流感病毒阳性,且全部是H9亚型,该结果与行业标准方法（NY/T 772—2013）检测结果一致,κ值为1（P<0.001）。本方法能实现对禽流感病毒及H5、H7和H9亚型的高通量快速检测,将在AIV快速检测中发挥重要作用。