克服昆明白小鼠胚胎发育阻滞的初步研究

为克服昆明白小鼠胚胎的2—细胞阻滞并使受精卵发育到囊胚期,本研究设两个实验组和一个对照组。第1实验组所用培养液为Brinster氏化学合成培养液与输卵管上皮和输卵管液混合的协同培养液;第2实验组用改良Brinster氏化学合成培养液;对照组用经典的Brinster培养液。培养是在5％CO_2和95％空气,37℃的CO_2箱内进行。3次体外培养试验结果是:第1实验组小鼠胚胎从受精卵发育到囊胚期平均发育率为43.7±7.76％;第2实验组的平均发育率为17.1±5.06％;对照组的平均发育率是15.3±3.06％。统计学分析表明,添加输卵管上皮和输卵管液的Brinster培养液对克服昆明白小鼠胚胎2—细胞阻滞具有一定作用。     

保存温度及时间对卵母细胞体外成熟及发育的影响

将屠宰场采集的驴卵巢随机分别置于4℃,20～25℃,25～30℃三种不同温度的生理盐水中运回实验室进行体外培养.由于三个屠宰场距离不同,选取最优的保存温度分别在1～2 h、3～4 h、6～8 h运回实验室,比较不同保存温度和保存时间下卵母细胞成熟率、孤雌激活发育卵裂率.结果表明:在不同保存温度的卵巢中,温度为25～30℃时卵母细胞成熟率(48.91％)与20～25℃(42.31％)、4℃(38.75％)无显著差异(P＞0.05),卵裂率25～30℃(44.44％)、20～25℃(38.64％)显著高于4℃(16.13％)(P＜0.05);保存时间1～2 h的成熟率(48.91％)和卵裂率(44.44％)与3～4 h(40.54％)、(36.67％)差异不显著,但保存时间在6～8 h成熟率(24.53％)和卵裂率(15.38％)显著低于1～2 h组和3～4 h组.由此推断,驴卵巢最佳保存温度为25～30℃、保存时间4h以内较有利于卵母细胞成熟发育.     

超排山羊卵巢卵母细胞体外成熟的初步研究

对超排山羊卵巢卵母细胞进行体外成熟培养的初步研究:试验一,分别用6、7、9、16号针头抽吸2～6mm卵泡,获有用卵母细胞百分率:分别为61.67％(37/60)、65.92％(178/270)、56.73％,(59/104)、31.43％(22/70);试验二,以TCM 199+10mol/L MHEPES+青霉素(6μg/m1)+链霉索(5μg/ml)为基础培养液(BM),再分别加入不同成分,配成5种卵母细胞成熟液:(A)BM+10％EGS(发情羊血清),(B)BM+10％EGS+HCG(2.5μg/ml,),(C)BM+10％EGS+HCG+E,(1μg/ml),(D)BM+10％FCS+HCG十E_2; (E)BM+10％EGS+HCG+E_2+颗粒细胞(1.5×10~6～3.0×10~6个/ml)。在38.5℃,5％CO_2培养26h,排卵后第1天卵巢母细胞体外成熟率分别为67.67％(20/30),60.42％(29/48),83.67％(41/49),67.79％(40/59),80.82％(59/73),排卵后第5天卵巢卵母细胞,在培液D中体外成熟率为71.43％(45/63)。研究表明,超排山羊卵巢卵母细胞经体外成熟可获得大量廉价的成熟母细胞。     

家兔卵巢卵母细胞体外成熟和体外受精的初步试验

从家兔卵巢卵泡中抽取卵母细胞,用含有FCS、BSA-V、HCG的TCM-199液和KRB修正液于37～39℃、5％CO_2、5％O_2和90％N_2的湿润环境中成熟培养和体外受精。试验以TCM-199液为基液,第一组加入PMsG10Iu/ml,第二组加入HcG10Iu/ml,第三组加入PMSG5Iu/ml、HCG5Iu/ml,第四组加入PMSG10Iu/ml、HCG5Iu/ml。结果表明:培养40小时后,4组卵丘细胞扩展率分别为80.65％、86.00％、85.40％和85.71％,组间差异不显著(P<0.05)。第一极体放出率分别为16.47％、7.14％、12.89％和19.23％。第二组低于其他各组,但差异不显著(P>0.05)。用体外获能的精子授精,卵裂率分别为26.96％、17.39％、32.35％和39.17％。授精后29～30小时出现2-细胞;44～45小时出现4-细胞;56小时出现8-细胞胚胎。     

现行牛IVF程序在水牛体外受精的应用研究

本研究对我所现行的牛体外受精程序（ＩＶＦ）应用于水牛体外受精的可行性进行了探讨。结果表明，水牛卵巢生长卵泡少，平均仅可回收５枚卵母细胞，只相当于黄牛（１４．３）的１／３。水牛卵母细胞的体外成熟率为５１．７％，体外受精卵裂率为５８．７％，均极显著地低于黄牛黄牛快，体外受精后的第６ｄ囊胚发育率占３６．４％，累计至第７ｄ时占８０．７％，极显著地高于黄牛（５７．６％，Ｐ〈０．００１）。水牛早期胚胎的体外囊     

山羊大腔卵泡卵母细胞的体外成熟和体外受精

从屠宰场采集卵巢。抽吸法回收2～6mm大腔卵泡卵母细胞。随机抽样后,测量其直径为167.42±17.43μp。A,B级卵泡卵母细胞进行体外成熟培养,其成熟率为67.50％。山羊新鲜精液以BO液或MD-H液处理后,与体外成熟卵母细胞进行授精,受精率分别为56.61％（17／30）和63.33％（19／30）,两组间差异不显著（P＞0.05）。BO和MD-H液均适宜于山羊精子获能处理。体外受精卵的2细胞胚发育率为16.67％（6／36）,4细胞胚发育率为2.78％（1／36）。     

绵羊卵巢运输、保存温度及时间对其卵母细胞孤雌发育能力的影响

为研究绵羊卵巢不同运输温度、保存温度及时间对其卵母细胞孤雌发育能力的影响,将采集卵巢随机分别置于(10～15),(20～25),(30～35)℃3种不同温度生理盐水中运输到实验室培养,然后优选较好运输温度将采回卵巢随机分为3个试验组,分别保存在4,(14～18),(25～30)℃生理盐水中,保存15～17h后进行成熟培养并孤雌激活。结果表明:(1)在不同运输温度的卵母细胞中,温度为20～25℃时卵母细胞能够进行最好的发育,其成熟率和囊胚率分别为67.44%,35.93%;(2)将绵羊卵巢在14～18℃保存15～17h,对卵母细胞的成熟率(61.81%)、孤雌激活后囊胚的发育率(29.03%)均无显著影响,而将卵巢保存在4℃或25～30℃却显著降低了卵母细胞的成熟率(41.90%,18.40%)与卵裂率(9.09%,13.04%),没有发育到囊胚。从而得出,绵羊卵巢卵母细胞体外培养的长距离运输适宜温度为20～25℃。卵巢在14～18℃保存过夜,不影响卵母细胞的发育能力。     

绵羊卵母细胞最优运输温度和体外成熟时间的研究

本试验为研究不同运输温度和体外成熟时间对卵母细胞的影响，从屠宰场共采集894枚屠宰绵羊卵母细胞，分两批处理，一批分别处于10～15℃，20—25℃，30～35℃三种不同的运输温度；另一批通过16—18h，20—22h，24～26h，28～30h四种不同的体外成熟时间，后经体外受精观察其发育情况。结果发现：①在不同运输温度的卵母细胞中，温度为20～25℃时卵母细胞能够进行最好的发育，达到第一极体的卵母细胞为64．86％，达囊胚的卯母细胞为34．58％。②在不同体外成熟时间的卯母细胞中，时间为20—22h时卵母细胞能够最好的发育，达到第一极体的卵母细胞为62．79％，达囊胚卵母细胞为31．70％。     

转基因鲤性腺结构及繁殖性能的研究

采用解剖及显微观察对大麻哈鱼生长激素基因鲤(以下简称转基因鲤)的性腺发育和繁殖性能进行了研究.结果表明:转基因鲤精巢组织结构属壶腹型,其壁由2层膜组成,外为腹膜,内为白膜,精小叶不规则排列,小叶由许多精小囊组成,精小囊是精子发生增殖、生长、成熟的地方,精子成熟后由精小囊进入小叶腔内.卵巢1对,位于腹腔两侧,外为腹膜,内为被膜,卵子成熟后由输卵管从泄殖孔排出体外.精卵生殖细胞发育程序相似,可分为6个时期.其中雌性个体成熟年龄为1周年;雄性个体成熟比雌性个体成熟早.成熟卵巢的成熟系数为0.49 ～0.84,成熟精巢的成熟系数为1.47 ～4.87.繁殖期性腺发育观察:7月时精巢中精原细胞和精母细胞所占比例较高,卵巢中初级卵母细胞所占比例较高;8月时精巢中精原细胞数量开始减少,精母细胞开始增加,并有少量精子细胞和精子出现,卵巢中卵母细胞数量有所增加,并出现一些小的液泡和卵黄物质;9月时精巢中大多都为精子细胞和精子,卵巢中大部分卵母细胞进入卵黄充塞期.通过对繁殖期3个月雌、雄个体性腺发育与普通鲤作t检验,雌、雄个体性腺发育程度有所不同但差异不显著(P＞0.05).该研究证明转基因鲤的性腺发育是正常的,雌、雄个体性个体都能达到性成熟.     

黄牛小腔卵泡卵母细胞体外受精及早期胚胎发育的影响因素

从屠宰场收集黄牛卵巢,取皮质深层卵母细胞进行体外成熟、体外受精和早期胚胎体外培养,分析影响其效果的因素。结果表明,在成熟培养液中添加促卵泡素(FSH)(10 IU/mL)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)(20 IU/mL)和17β-雌二醇(17β-E2)(1μg/mL)对卵母细胞受精后早期胚胎发育能力有极显著的促进作用。等量牛卵泡液(BFF)与初生犊牛血清(NCS)效果差异不显著,以添加15?F为最宜。颗粒细胞与输卵管上皮细胞均能显著提高卵母细胞体外成熟受精后早期胚胎的发育率,颗粒细胞 输卵管上皮细胞对克服胚胎阻滞现象效果最显著。     

羔羊超数排卵及体外受精技术研究

用FSH+ PMSG和FSH+LH 2种处理方法,对8只6周龄的高山细毛羊进行超数排卵试验,4只作对照组,并对采集到的卵子进行体外受精,探索羔羊超数排卵的可行性及体外受精的效果.结果表明:2组处理共获得发育卯泡583个,回收卵母细胞255枚.卵母细胞经体外培养24 h后与上游法获能的精子进行体外受精,48 h后2组处理...     

LH Plays a Role to Enhance the Nuclear and Cytoplasm Synchronization During In vitro Maturation of Ovine Oocytes

This study is aimed to investigate the effect of luteinizing hormone (LH) on maturation and fertilization in vitro of ovine oocytes.The ovine oocytes were cultured in vitro in medium with or without LH,and then checked by confocal laser scanning microscope to observe the distribution of cortical granules stained with FITC-LCA during different maturation periods.Similarly,some in vitro matured oocytes were also fertilized in vitro for analysis of their developmental potentiality further.After being cultured in vitro for 4 h,there were significant differences about the rate of germinal vesicle break down (GVBD) between the treatment (with LH) and the control groups (without any hormones) (36.76% vs 18%,P<0.05).Further,there were also significant differences of the cleavage and blastocyst rates between these two groups (67.15% vs 42.37%,21.9% vs 12.71%,P<0.05,respectively).The distribution of cortical granules appeared to spread from the edges to the central site of sheep oocytes following their delaying durations of maturation in vitro.It can be concluded that LH may play a role to delay the occurence of GVBD,prolong the maturation duration of cytoplasm,and enhance the nuclear and cytoplasm synchronization of ovine oocytes matured in vitro and finally improve their in vitro developmental potentiality.     

生长因子和体细胞共培养对牛体外受精的影响

为研究表皮生长因子（EGF）和胰岛素（Insulin）对牛卵母细胞体外发育的影响以及体细胞共培养对体外受精胚胎体外发育的影响,将获取的牛卵泡卵母细胞在含有30μg,LEGF或50mg／L Insulin或30μg／LEGF＋50mg／L Insulin的成熟培养液中进行成熟培养,比较不同生长因子对牛卵母细胞体外成熟和体外受精的影响;将受精卵用颗粒细胞单层培养系统或牛输卵管上皮细胞单层培养系统进行体外培养,比较体细胞共培养系统对体外受精胚胎体外发育的影响。结果表明,成熟培养液中添加30μg／LEGF或者30μg／LEGF＋50mg／L Insulin可以显著提高卵母细胞的成熟率和受精后的卵裂率（P〈0．05）;输卵管上皮细胞共培养系统可以显著提高受精后的囊胚发育率（P〈0．05）,可以用于牛体外受精胚胎的体外培养。     

促黄体素对绵羊卵母细胞体外成熟核质同步化的影响

 【目的】研究促黄体素（LH）对绵羊卵母细胞体外成熟和体外受精的影响。【方法】将绵羊卵母细胞置于含LH（处理组）或不含LH（对照组）的成熟液中进行体外成熟,在不同时间点取出,观察卵母细胞核成熟情况;结合皮质颗粒分布变化的观察结果判断细胞质成熟情况。【结果】绵羊卵母细胞体外成熟4 h时,处理组生发泡破裂（GVBD）率显著低于对照组（36.76% vs 50%,P＜0.05）;体外成熟24 h并进行体外受精后,处理组卵母细胞卵裂率和囊胚率显著高于对照组（67.15% vs 42.37%,21.9% vs 12.71%,P＜0.05）。激光共聚焦扫描检测结果表明,随着核的成熟,绵羊卵母细胞的皮质颗粒由胞质中心区域向周边发生规律性迁移,经LH处理的卵母细胞,皮质颗粒扩散的程度明显好于对照组。【结论】LH可能通过延迟生发泡破裂和促进胞质成熟的方式,使绵羊卵母细胞的核质成熟趋于同步,有助于绵羊卵母细胞的体外成熟以及受精后的进一步发育。     

卵丘细胞对牛体外受精效果的影响

[目的]探索卵丘细胞对牛体外成熟卵母细胞体外受精效果的影响.[方法]试验采用体外成熟后卵母细胞脱除卵丘细胞组、部分脱除组及不脱除组.[结果]与卵丘细胞共培养时,部分脱除组的卵裂率及囊胚率(74.4％±4.1、53.7％±5.1)好于不脱除组(72.7％ ±5.1、52.4％±3.5),差异不显著(P＞0.05)、两者都好于全部脱除组(39.6％±4.5、l8.8％±4.6),差异显著(P＜0.05),且都显著优于对照组.卵丘细胞与褪黑素两者联合使用时,效果最佳.部分脱除组的卵裂率及囊胚率(79.8％±3.7、56.5％±5.1)好于不脱除组(78.2％±2.6、55.8％±4.6),差异不显著,两者都好于完全脱除组(48.3％±5.5、22.7％±4.3)及对照组,且差异显著(P＜0.05).[结论]该研究对奶牛和肉牛的生产提供了技术支持.     

生发泡移植过程对小鼠卵母细胞体外受精的影响

为研究生发泡(GV)移植后的重组卵母细胞能充分在体外成熟和发育,本试验比较了GV移植过程及体外成熟对小鼠卵母细胞体外受精的影响。通过透明带切口及GV移植获得的重组GV期卵母细胞的成熟率为87.0%(147/169),体外受精后发育到原核期胚和2-细胞期胚的比率分别为76.2%(112/147)和42.2%(62/147),与仅做透明带切口但不进行GV移植的对照组相似(P>0.05),表明GV移植过程未对卵母细胞体外受精后的早期胚胎发育能力产生不利影响。但与体内成熟的卵母细胞相比,体外成熟卵母细胞的受精率和卵裂率都明显降低,表明其进一步发育的能力受到影响。     

绵羊卵母细胞孤雌激活及其随后体外发育的初步研究

对绵羊卵母细胞体外成熟培养和孤雌激活的影响因素作了初步研究.卵母细胞在TCM199培养液中培养24 h后,采用1.3 kV/cm、60 μs、0.1 mmol Ca2+和1.4 kV/cm、40 μs、0.1 mmol Ca2+2种处理对成熟卵母细胞进行电激活,卵裂率分别为76.1%和77.0%,2种处理差异不显著(P＞0.05).发生卵裂的卵母细胞在SOFaaBSA培养液中培养(分换液和不换液2种处理)至7～8 d统计囊胚率,换液的囊胚率为12.2%,不换液的囊胚率为22.8%,二者差异显著(P＜0.05).     

透明质酸对绵羊卵母细胞体外成熟与早期胚胎发育的影响

[目的]探讨不同浓度透明质酸对绵羊卵母细胞的体外成熟和早期胚胎发育效果的影响。[方法]以绵羊卵母细胞为试验材料,分别在绵羊卵母细胞体外成熟和体外胚胎培养液中添加0、1.5、3.0、4.5 mg/ml的透明质酸（HA）,研究其对绵羊卵母细胞体外成熟和早期胚胎发育的影响。[结果]当HA浓度为1.5和3.0 mg/ml时,绵羊卵母细胞的成熟率分别为72.54%和62.17%,显著高于对照（P〈0.05）。当HA浓度介于1.5～3.0 mg/ml时,HA对绵羊卵母细胞体外成熟有促进作用。当HA浓度为1.5 mg/ml时,绵羊卵母细胞的卵裂率和囊胚率均显著高于对照组与其他组（P〈0.05）,囊胚细胞总数显著高于其他各组（P〈0.05）。这说明HA可以促进绵羊卵母细胞的早期胚胎发育。[结论]HA不仅可以促进绵羊卵母细胞成熟,而且在细胞分化中也会起作用。当HA浓度为1.5 mg/ml时,最有利于绵羊的早期胚胎发育。     

培养条件对绵羊卵巢卵母细胞体外成熟及受精的影响

对绵羊卵巢卵母细胞体外成熟培养及体外受精培养条件进行筛选,结果表明:在基础培养基中添加FCS可以显著提高卵母细胞的体外成熟率,而添加10%、15%和20%FCS的组间,卵母细胞的成熟率差异不明显,表明在基础培养液中添加10%FCS即可使绵羊卵母细胞的体外成熟率达到一个比较高的水平;体外培养时间不同对绵羊卵母细胞的成熟有较大的影响,培养24 h和26 h的卵母细胞成熟率(分别为73.3%和77.5%)显著高于培养18 h和20 h的卵母细胞成熟率(分别为62.5%和65.0%);对活力较低的绵羊精子而言,采用直接上浮法要比离心洗涤法更有利于选取活力较高的精子,并可提高受精卵的卵裂率.     

牛卵母细胞体外培养成熟前后及体外受精卵SDH的电镜细胞化学研究

本文用Kerple-Fronius和Hajos的电镜细胞化学方法,对牛卵巢2-5mm卵泡中的卵母细胞及体外培养成熟卵和体外受精卵,进行了琥珀酸酶(SDH)定位及活性变化的研究.观察结果培养前的卵母细胞酶活性较明显,主要定位于线粒体膜上,内脊上也有少量的定位.体外培养成熟卵线粒体上的酶活性明显减弱.而体外受精卵在线粒体的膜及内脊上都有很强的酶活性定位.结果表明,牛卵母细胞的SDH活性随卵母细胞的成熟过程减弱,随受精过程增强. 本文还从超微结构角度上,对酶活性变化的原因进行了讨论