基于高通量测序的海滨雀稗转录组学研究

采用新一代高通量测序技术Illumina HiSeq 2000对海滨雀稗叶片转录组进行测序,结合生物信息学方法开展基因表达谱研究和功能基因预测。通过测序,获得了47520544个序列读取片段(reads),包含了4752054400个碱基序列(bp)信息。对reads进行序列组装,获得81220个单基因簇(unigene),平均长度1077 bp,序列信息达到了87542503 bp。另外从长度分布、GC含量、表达水平等方面对unigene进行评估,数据显示测序质量好,可信度高。数据库中的序列同源性比较表明,46169个unigene与其他生物的已知基因具有不同程度的同源性。海滨雀稗转录组中的unigene根据GO功能大致可分为细胞组分、分子功能和生物学过程三大类48个分支,其中有大量unigene与代谢进程、结合活性和细胞进程相关。将unigene与COG数据库进行比对,根据其功能大致可分为25类。KEGG 数据库作为参考,依据代谢途径可将unigene定位到112个代谢途径分支,包括苯丙氨酸代谢通路、植物与病原物互作、植物激素生物合成和信号转导、黄酮类化合物合成、萜类骨架生物合成、脂类代谢、RNA降解等。SSR位点查找发现,从81220个unigene中共找到22721个SSR位点。SSR不同重复基序类型中,出现频率最高的为A/T,其次是CCG/CGG和AGC/CTG。本研究首次对海滨雀稗转录组进行了分析,为草坪草的分子生物学研究提供了宝贵的基因组数据来源。     

牦牛皱胃全长转录组测序分析

【目的】获得牦牛(Bos grunniens)皱胃全长转录组数据库,深入挖掘牦牛皱胃功能基因。【方法】采用PacBio Sequel高通量测序系统,使用单分子实时(single molecular real time, SMRT)测序技术对成年牦牛皱胃全长转录组进行测序,对原始数据进行质控和去冗余分析,再比对参考基因组获取过滤后的非重复序列(Unigenes),使用多种生物信息软件对牦牛皱胃全长转录本数据进行功能注释、转录因子注释、编码区预测、简单重复序列(simple sequence repeats, SSR)分析及可变剪接分析。【结果】通过测序共获得14 467 420条子序列,平均子序列长度为3 344.23 bp,质控得到循环一致性序列(CCS)有296 840条,全长非嵌合(FLNC)序列有277 402条,过滤和去冗余后对比参考基因组最终获得8 556条Unigenes。通过与NR、Swiss-Prot、KEGG、KOG、eggNOG、GO和Pfam数据库比对,对Unigenes进行注释,其中NR数据库注释了8 544条Unigenes; Swiss-Prot数据库注释了...     

基于高通量测序技术的敖鲁古雅驯鹿鹿茸转录组分析

试验旨在通过高通量测序技术获得驯鹿的遗传信息和鹿茸组织的转录组特征,并进一步挖掘其中与鹿茸经济性状相关的关键基因信息。对驯鹿鹿茸组织提取RNA,检测RNA纯度、完整性及是否有污染,合格后构建文库,文库构建成功需要进行库检,库检合格后使用Illuminanovaseq平台进行转录组测序分析。利用Diamond、HMMER、KAAS、Blast2GO等软件对驯鹿鹿茸转录组序列进行了功能注释、基因丰度分析和其他分析。结果显示,测序获得47 818 202条raw reads,经过滤和质量检查得到了46 964 478条clean reads,组装后得到49 171个Unigenes,表明本次测序获得了高质量的鹿茸转录组。基于序列一致性分析,Unigenes与NR、Swiss-Prot、KOG、KEGG、Pfam、GO数据库比对注释成功总共占89.54%,共44 029条序列。Corset聚类后得到49 171个Unigenes,在这些Unigenes中共找到13 795个SNPs位点和18 446个SSRs位点。GO注释结果显示22 955个Unigenes得到注释,占总注释结果的46.68%。与KEGG数据库进行比对分析,发现49 171个Unigenes可能参与或涉及代谢途径,其中20 258个Unigenes共注释到32个KEGG代谢通路。此外,在转录组结果中发现了一些高丰度的基因,如OPN、TMSB4、TMSB10等,它们的功能可能与驯鹿生茸有关。本试验结果不仅对驯鹿的基因组数据进行了补充,而且还初步揭示了生长期驯鹿鹿茸的基因特征,为驯鹿分子遗传学研究、资源保护与利用及种群资源恢复提供了参考。     

基于高通量测序的水貂胚胎滞育期和激活期卵巢转录组分析

试验旨在获取胚胎滞育期与激活期水貂卵巢组织的转录组信息,挖掘滞育的胚胎激活前后水貂卵巢差异表达基因（DEGs）及其功能信息,为探讨卵巢信号调控水貂胚胎滞育的分子机制提供参考。随机采集8只健康雌性水貂（胚胎滞育期和激活期各4只）的卵巢组织为样本,利用Illumina HiSeq平台RNA-Seq技术对其进行转录组测序,筛选在水貂胚胎滞育期和激活期卵巢中的DEGs并进行生物信息学分析。结果显示,测序获得661 195 568个raw reads,经过滤后获得650 834 900个clean reads,组装后得到389 895个unigenes,通过与Nr、GO、KOG和KEGG数据库比对,对unigenes进行注释,其中Nr数据库注释了156 419个unigenes;GO数据库注释了122 657个unigenes;KOG数据库注释了58 320个unigenes;KEGG数据库注释了72 653个unigenes。滞育期和激活期卵巢中有1 797个DEGs,与胚胎滞育期水貂卵巢相比,激活期卵巢有1 298个DEGs显著上调,499个DEGs显著下调。GO功能分析发现,DEGs显著富集的生物学过程主要有跨膜信号受体活性、信号受体活性、G蛋白偶联受体活性、酶联受体蛋白信号通路、细胞表面受体信号通路、细胞周期阻滞、芳香酯酶活性。KEGG通路分析发现,水貂滞育期和激活期卵巢中的DEGs显著富集于神经活动配体-受体相互作用信号通路。本研究利用高通量测序技术获得水貂胚胎滞育期与胚胎激活期卵巢的转录组信息,为深入探究水貂卵巢调节胚胎滞育的分子机制奠定了基础。     

牦牛卵巢小RNA高通量测序及生物信息学分析

本研究旨在利用高通量测序技术描绘牦牛卵巢sRNA图谱,为探析牦牛繁殖性能提供基础。以牦牛卵巢组织作为研究对象,构建牦牛sRNA文库,进行高通量测序和生物信息学分析,最后利用RT-qPCR技术验证miRNA在牦牛卵巢组织中的表达。经测序后得到包含12 126 208条clean reads,其中特异序列为212 757条;比对分析显示,只有7 383 536(60.89%)条总序列及80 981(38.06%)条特异序列能与牦牛基因组匹配。与黄牛相比,牦牛sRNA中有56个表达量上调,其中miR-135a表达上调最显著;有33个表达下调,其中miR-2316表达下调最显著。RT-qPCR验证6个miRNA在牦牛卵巢组织中的表达情况,定量结果和测序结果基本一致。与牦牛EST序列信息比对后共预测出5个新miRNA。本研究成功绘制牦牛卵巢sRNA图谱,同时证实RNA-Seq高通量测序技术在完善sRNA信息及挖掘新miRNA方面的优势,对研究sRNA在牦牛遗传育种以及以牦牛为重要高原动物模型来进行高原适应性和抗逆性等相关领域的研究具有重要意义。     

基于高通量测序技术的敖鲁古雅驯鹿鹿茸转录组分析

试验旨在通过高通量测序技术获得驯鹿的遗传信息和鹿茸组织的转录组特征,并进一步挖掘其中与鹿茸经济性状相关的关键基因信息。对驯鹿鹿茸组织提取RNA,检测RNA纯度、完整性及是否有污染,合格后构建文库,文库构建成功需要进行库检,库检合格后使用Illuminanovaseq平台进行转录组测序分析。利用Diamond、HMMER、KAAS、Blast2GO等软件对驯鹿鹿茸转录组序列进行了功能注释、基因丰度分析和其他分析。结果显示,测序获得47 818 202条raw reads,经过滤和质量检查得到了46 964 478条clean reads,组装后得到49 171个Unigenes,表明本次测序获得了高质量的鹿茸转录组。基于序列一致性分析,Unigenes与NR、Swiss-Prot、KOG、KEGG、Pfam、GO数据库比对注释成功总共占89.54%,共44 029条序列。Corset聚类后得到49 171个Unigenes,在这些Unigenes中共找到13 795个SNPs位点和18 446个SSRs位点。GO注释结果显示22 955个Unigenes得到注释,占总注释结果的46.68%。与KEGG数据库进行比对分析,发现49 171个Unigenes可能参与或涉及代谢途径,其中20 258个Unigenes共注释到32个KEGG代谢通路。此外,在转录组结果中发现了一些高丰度的基因,如OPN、TMSB4、TMSB10等,它们的功能可能与驯鹿生茸有关。本试验结果不仅对驯鹿的基因组数据进行了补充,而且还初步揭示了生长期驯鹿鹿茸的基因特征,为驯鹿分子遗传学研究、资源保护与利用及种群资源恢复提供了参考。     

基于高通量转录组测序的牦牛和犏牛附睾体部差异表达基因分析

本研究旨在通过转录组测序数据库筛选牦牛和犏牛附睾体部之间的差异表达基因(DEGs),了解DEGs对犏牛不育转录调控的影响。分别采集3头牦牛和犏牛的附睾体部,利用RNA测序分析(RNA-seq)技术,通过GO、KEGG富集等生物信息学方法分析筛选DEGs。结果表明,牦牛和犏牛附睾体部DEGs总数有82个,其中54个DEGs显著上调,28个DEGs显著下调;通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证了8个DEGs,与转录组测序结果一致;通过GO和KEGG对DEGs进行分析,SLC22A20、T2R65A、TKTL1的下调与精子获能、运动和抗氧化活性相关;磷酸戊糖通路和嗅觉转导是显著富集通路,OR9K2、OR1E1、OR10AG1、TKTL1的下调可能与犏牛不育相关。本研究揭示了牦牛和犏牛附睾体部基因区域特异性表达与功能特异性表达的密切关系,进而为探索雄性犏牛不育的分子机制以及提高高原哺乳动物繁殖力提供基础数据。     

基于高通量测序的梅花鹿卵巢衰老的转录组分析

【目的】获取青年梅花鹿和老年梅花鹿卵巢组织的转录组信息,为深入研究梅花鹿卵巢衰老的潜在机制提供依据。【方法】以4岁龄青年梅花鹿和10岁龄老年梅花鹿卵巢作为试验样本,对样本进行石蜡切片、苏木精-伊红染色和卵泡计数;用Trizol法提取卵巢样本RNA构建转录组文库,应用Illumina HiSeq^TM2000测序平台测序,对测序结果进行差异表达基因、GO功能、KEGG通路和蛋白互作网络分析,并挑选部分差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证。通过RIPA裂解液提取卵巢样本蛋白并对组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)蛋白在青年和老年梅花鹿中的表达情况进行Western blotting检测。【结果】组织学分析结果表明,老年梅花鹿的卵巢卵泡数显著低于青年梅花鹿(P<0.05),而闭锁卵泡数极显著高于青年梅花鹿(P<0.01)。转录组学分析结果表明,老年和青年梅花鹿卵巢间共有1 477个差异表达基因,其中表达上调基因503个,表达下调基因974个。GO功能和KEGG通路富集结果表明,免疫系统过程、转录、DNA损伤修复、炎症反应、凋亡等生物事件与卵巢衰老有关...     

高通量转录组测序技术在猪肉品质研究中的应用进展

猪肉中基因的表达决定了蛋白质的种类、结构和功能,从而决定了肉品质,而肌内脂肪(IMF)和肌纤维(MF)是影响肉品质的关键物质。本文主要综述了高通量转录组测序技术在研究猪肉品质相关的IMF和MF转录组的应用,重点阐述了其研究进展。     

椰子油对育成猪肝脏转录组高通量测序的影响

试验设计了椰子油组和对照组2个处理。采集育成猪肝脏组织,进行转录组高通量测序,找出2种处理间的差异表达基因及差异代谢通路。利用Illumina Hi SeqTM2 500高通量RNA-seq测序技术测序,使用Top Hat2软件将测序得到的reads序列与猪参考基因组(Sscrofa10.2)序列比对,找出差异表达基因,并在Nr、GO和KEGG数据库中进行功能注释、富集分析和聚类分析。结果表明:椰子油组和对照组肝脏中差异表达基因共有487个,与对照组相比,椰子油组表达上调的基因有222个,下调的基因有265个。在差异表达上/下调前15位基因中,有多个基因是参考基因组中没有的新基因和功能未知基因。GO功能分类注释到细胞组成、分子功能和生物学过程数据库中的差异表达基因数分别有398、368个和398个;注释到KEGG通路中差异表达基因数188个。     

猪MII期卵母细胞的玻璃化冷冻的初步研究

试验采用3种冷冻载体(麦管、开放式拉长麦管和半麦管)对猪卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的影响进行研究,以探讨采用自制半麦管作为载体对猪MII期卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的影响.结果发现,采用半麦管法、OPS法玻璃化冷冻的猪卵母细胞的形态完整率、存活率、卵裂率分别为90.85%、60.07%、20.43%和84.15%、55.71%、14.71%,无显著差异(P＞0.05),但采用半麦管法的结果好于OPS法;与麦管法的形态完整率、存活率和卵裂率(分别为60.06%,39.64%和0)均有显著性差异(＜0.05).结论为采用半麦管法玻璃化冷冻猪卵母细胞可以稍微提高其冻后发育能力.     

骆驼斯氏副柔线虫转录组的高通量测序及分析

为了系统了解斯氏副柔线虫的转录组特征并构建其转录组图谱,以不同发育阶段的斯氏副柔线虫为研究对象,应用Illumina Nextseq 500高通量测序技术平台对其进行转录组测序及生物信息学分析,结果每个样本均得到3GB的原始数据,经质量控制和拼接组装后,共获得128 454个Unigene,序列片段的平均长度与N50值分别为634和1 037bp;将Unigenes与COG,Nr,Trembl等数据库进行比对,结果表明有35 324个Unigene比对到COG数据库,根据蛋白种类大致分为25类;通过GO功能分类,5 227个Unigene映射到GO不同的功能节点上;通过KEGG pathways分析,共有13 424个Unigene参与了8 155个代谢通路。该研究结果为斯氏副柔线虫病的基础理论、诊断方法及防治研究奠定基础。     

基于高通量转录组测序技术构建猪脂肪沉积的lncRNA和miRNA相关ceRNA调控网络

脂肪沉积性状是养猪生产中的重要经济性状,也与生猪养殖的经济效益密切相关。课题组前期对3对具有极端背膘厚度的长白猪全同胞个体的背部皮下脂肪组织样本进行链特异性建库RNA测序和小RNA测序鉴定lncRNA和miRNA,通过差异表达分析,共得到220个lncRNA和18个miRNA在高、低背膘组间差异表达。本研究进一步分析它们的生物学功能,进行靶向关系预测和靶基因功能富集分析,并构建猪脂肪沉积的lncRNA和miRNA相关ceRNA调控网络。结果发现,差异表达lncRNA及miRNA靶基因能够显著富集到多个糖脂代谢相关的通路,如“脂肪细胞分化”、“糖酵解/糖异生”等。最终成功构建了一个与脂肪沉积过程密切相关的ceRNA调控网络,包含9个差异表达lncRNA,6个差异表达miRNA和25个靶基因。本研究结果为探究非编码RNA在猪脂肪沉积过程中的功能及其分子调控机制提供了新的思路。     

基于转录组测序生物信息学分析的研究进展

随着DNA双螺旋结构的发现,基因组研究开始进行,中心法则也成为了研究生命科学的核心。这对近年来分子生物学及检测技术的迅猛发展提供了良好的开端,随之而来的是基因测序研究成为了生物学上一个新的热点话题。虽然通过转录组测序可以获得海量基因数据,但是数据的深入探索还需要进一步研究,而这些深入的挖掘,需要生物信息学分析手段,从而建立了多组学,通过对其进行不断完善,使得现代生物科学形成了一个完整的系统。这使得生物基因学的研究可以成为一个逐层的分析,将通过整合分析出的信息数据来描述生命活动。因此,功能基因组的研究已经成为了动植物基因组研究的重要方向,特别是对转录组的研究尤为重要。作者通过对转录组学的时代背景、转录组研究的复杂性、DNA测序技术的发展史以及转录组学研究方法进行归纳,简述了转录组学的发展历程,并对转录组研究内容做了一个简单系统的介绍,为更加深入地了解转录组测序奠定了基础。     

基于转录组测序生物信息学分析的研究进展

随着DNA双螺旋结构的发现,基因组研究开始进行,中心法则也成为了研究生命科学的核心。这对近年来分子生物学及检测技术的迅猛发展提供了良好的开端,随之而来的是基因测序研究成为了生物学上一个新的热点话题。虽然通过转录组测序可以获得海量基因数据,但是数据的深入探索还需要进一步研究,而这些深入的挖掘,需要生物信息学分析手段,从而建立了多组学,通过对其进行不断完善,使得现代生物科学形成了一个完整的系统。这使得生物基因学的研究可以成为一个逐层的分析,将通过整合分析出的信息数据来描述生命活动。因此,功能基因组的研究已经成为了动植物基因组研究的重要方向,特别是对转录组的研究尤为重要。作者通过对转录组学的时代背景、转录组研究的复杂性、DNA测序技术的发展史以及转录组学研究方法进行归纳,简述了转录组学的发展历程,并对转录组研究内容做了一个简单系统的介绍,为更加深入地了解转录组测序奠定了基础。     

基于单细胞转录组测序技术对鄂尔多斯细毛羊次级毛囊形态发生诱导期的研究

【目的】试验旨在解析鄂尔多斯细毛羊胚胎期次级毛囊诱导期形态发生过程中主要细胞类型的分子特征和分化过程。【方法】对采集的3只鄂尔多斯细毛羊(胎龄87 d)体侧部(肩胛骨后缘处)的皮肤样本进行HE染色,鉴定毛囊的发育时期;部分皮肤样本经过混样后进行单细胞转录组测序(scRNA-Seq),应用t-分布随机近邻嵌入(tSNE)分析细胞簇,分别使用胶原Ⅰ型α1链(Col1a1)和角蛋白15(Krt15)鉴定真皮谱系细胞和表皮谱系细胞,并使用皮肤组织不同细胞的标记基因进行细胞类型分析;对测序数据进行拟时序分析,探究其分化过程中差异基因的表达;通过GO功能富集分析进一步验证基因的功能。【结果】HE染色结果发现,鄂尔多斯细毛羊在胎龄87 d处于次级毛囊诱导期。通过scRNA-Seq在胎龄87 d的细毛羊体侧部皮肤细胞样品中获得10 603个细胞和18 704个基因的scRNA-Seq数据可用于下游分析。tSNE分析发现,皮肤组织中共有15个细胞簇;Col1a1和Krt15标记基因鉴定表明,真皮细胞和表皮细胞具有高度异质性。拟时序分析构建毛囊形态发生过程中真皮/表皮细胞谱系细胞的分化轨迹和基因动态表达图...     

基于高通量转录组测序的红花籽油对肥育猪肝脏差异表达基因的影响

18头肥育猪按饲粮均分为2组,添加红花籽油组和不添加油脂组(对照组)。试验期60d结束,全部屠宰,分别采集肝脏组织样品,进行高通量转录组测序,找出2处理组间的差异表达基因和差异代谢通路。利用Illumina HiSeqTM2500高通量RNA-seq测序技术对2组肥育猪肝脏RNA测序,使用TopHat2软件将测序得到的reads序列与猪(Sscrofa10.2)参考基因组序列比对,找出差异表达基因,在Nr、GO和KEGG数据库中进行功能注释、富集分析和聚类分析。结果显示,红花籽油组和对照组肝脏中差异表达基因共有1 114个,与对照组相比,红花籽油组表达上调的基因有579个,下调的基因有535个。GO功能分类注释到细胞组成、生物学过程和分子功能数据库中的差异表达基因分别有902,903,857个。注释到KEGG通路中差异表达基因414个,显著富集通路4个(P0.05)。     

单细胞转录组测序技术原理及其应用

基因转录调控及其机制分析是后基因组时代生物学研究的重点之一。常规研究往往建立在细胞群体或者组织上,一般表现出的是细胞的综合反应,难以判断单个细胞的情况,而在肿瘤、疾病预防等方面都需要对少量或单个细胞进行研究,因此,单细胞研究技术必不可少。常规的基因组扩增技术难以消除内含子的影响,并且无法用来阐述某些类型或某些特殊单个细胞之间基因表达的异质性,而转录组测序从RNA入手,将其反转录为cDNA后再进行大量扩增,可以完美地消除内含子的影响。本文主要就单细胞分离技术、单细胞转录组测序技术、高通量测序技术进行综述,并列举了现阶段的研究进展,分析了该项技术在各个领域的应用以及在家畜育种中的应用前景。