拟南芥SSP1基因GFP载体构建及GFP植株筛选

[目的]以野生型拟南芥为材料构建SSP1基因GFP载体及GFP转基因植株。[方法]通过提取野生型拟南芥的RNA,反转录成为c DNA,并以c DNA为模板,利用高保真酶,进行SSP1基因的克隆,将克隆所获得SSP1基因和p XB94-GFP质粒进行双酶切,利用T4-DNA ligase进行连接,并转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞中,通过菌落PCR和测序获得阳性单克隆。通过质粒抽提试剂盒提出构建好的重组质粒,并将其转入农杆菌GV3101中,通过菌落PCR鉴定出阳性单菌落。将获得的阳性菌通过花序浸染法转入野生型拟南芥中,并通过抗性筛选获得阳性植株。[结果]克隆SSP1基因成功,菌落PCR显示SSP1基因成功连接到p XB94-GFP质粒上并成功转入农杆菌中,抗性筛选获得了SSP1-GFP转基因植株。[结论]成功获得SSP1-GFP转基因植株,为接下来进一步研究SSP1基因功能奠定了基础。     

拟南芥MDH2基因GFP载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]以野生型拟南芥为材料构建MDH2基因GFP载体及GFP转基因植株,研究MDH2基因在植物响应镉胁迫机制中的功能。[方法]通过提取野生型拟南芥的RNA,反转录成为cDNA,并以cDNA为模板,利用PCR扩增MDH2基因,将扩增所获得MDH2基因和pXB94-GFP质粒双酶切后连接,并转化进大肠杆菌感受态细胞中,鉴定正确后再转入农杆菌感受态细胞中,通过菌落PCR鉴定出阳性单菌落。再通过浸花法转入野生型拟南芥中,最后利用抗性筛选和PCR鉴定获得MDH2转基因阳性植株。[结果]成功克隆MDH2基因,并构建了MDH2-GFP重组质粒,抗性筛选获得了MDH2-GFP转基因植株。[结论]成功获得MDH2-GFP转基因植株,为进一步研究该基因在植物响应镉胁迫机制中的功能奠定了基础。     

拟南芥CTSP3基因GUS载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]深入研究植物基因CTSP3的基因表达模式及其对重金属镉胁迫的响应机制,以野生型拟南芥为材料构建CTSP3-GUS重组质粒及GUS转基因植株。[方法]通过提取野生型拟南芥的DNA,克隆其启动区基因片段,将基因片段和pART27-GUS质粒双酶切后连接,转化到大肠杆菌感受态细胞中,菌落PCR和测序获得阳性单克隆。然后将CTSP3-GUS重组质粒转入农杆菌感受态GV3101,获得阳性单菌落。接着采用浸花法侵染野生型拟南芥,最后通过抗性筛选和PCR鉴定获取CTSP3-GUS转基因植株。[结果]成功克隆CTSP3启动区基因片段,构建出重组质粒,获得了CTSP3-GUS转基因植株。[结论]获得CTSP3-GUS转基因植株,为接下来进一步研究该基因在植物响应镉胁迫机制中的功能奠定了基础。     

拟南芥PTR3基因过表达载体构建及转基因植株的获得

[目的]构建PTR3基因的过表达载体,并建立PTR3基因过表达植株,为进一步研究PTR3基因在调控重金属胁迫应答中的功能提供理论依据。[方法]提取野生型拟南芥总mRNA,并以反转录的c DNA为模板扩增出PTR3基因CDS全长,通过限制性核酸内切酶酶切、T4 DNA连接酶连接,将该基因连接到带有35S启动子的p BI121载体上。[结果]将重组载体转化至农杆菌GV3101菌株,通过浸花法将重组载体转化到野生型植株中,通过抗性筛选和遗传鉴定获得纯合的PTR3转基因阳性植株。[结论]PTR3过表达载体构建成功并获得转基因阳性植株,为研究PTR3基因的分子功能奠定基础。     

拟南芥MYB4基因GUS载体构建及其转基因植株的筛选

[目的]进一步验证MYB4基因在响应干旱胁迫中的应答功能,构建ProMYB4:GUS载体,通过筛选鉴定获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥植株的全基因组为模板,利用特异性引物扩增MYB4基因启动子,将目的基因连接到pART27载体上。然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌GV3101,浸花法转化野生型植株。最后通过抗性筛选和PCR鉴定获得阳性转基因植株。[结果]MYB4启动子成功克隆,测序结果经过比对完全正确。抗性筛选获得了阳性转基因植株。[结论]成功获得ProMYB4:GUS阳性转基因植株,为进一步研究MYB4基因功能奠定了基础。     

拟南芥CDR6基因过表达载体构建及过量表达植株筛选鉴定

[目的]以拟南芥为材料克隆CDR6基因,构建CDR6基因的过量表达载体并筛选鉴定获得过表达植株.[方法]提取拟南芥mR-NA,反转录成cDNA,并以此为模板克隆CDR6基因CDS全长,通过限制性内切酶切割、T4 DNA连接酶连接,将CDR6基因CDS全长连接到带有35S强启动子的pXB094载体上;然后转化至Trans1-T1感受态细胞中,菌落PCR鉴定阳性单克隆并测序确认.将重组质粒转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,通过浸花法侵染拟南芥野生型植株,通过抗性筛选和鉴定获得预期的转基因植株.[结果]菌落PCR鉴定和测序结果表明CDR6基因已成功构建至pXB094载体;通过抗性筛选并鉴定获得了过量表达阳性植株.[结论]筛选和鉴定获得的过量表达植株为研究CDR6基因的分子功能奠定了基础.     

拟南芥bZIP23基因过量表达载体的构建及过表达植株的筛选

[目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因,构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株,为验证其功能奠定基础.[方法]提取拟南芥总RNA和RT-PCR克隆bZIP23基因,用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接,使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上;将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中,筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证,获得重组质粒.将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,浸花法转化拟南芥野生型植株.[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,bZIP23基因与35S过量表达载体已连接,获得了重组载体;抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株.[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础.     

一个耐镉基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步研究MNB1基因在植物应对镉胁迫响应中的功能,构建拟南芥中MNB1基因过量表达载体,通过筛选鉴定最终获得相应的转基因植株。[方法]以野生型拟南芥c DNA为模板,PCR扩增MNB1基因全长,将该基因连接到过量表达载体上;然后将构建成功的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,浸花法转化野生型植株;最后利用转基因筛选与遗传鉴定获得MNB1转基因阳性植株。[结果]MNB1基因CDS全长1 368 bp,酶切连接后转化大肠杆菌鉴定得到阳性菌落,测序结果经比对完全正确。通过抗性筛选及PCR电泳检测获得阳性转基因植株。[结论]MNB1基因过表达载体构建成功并获得相应转基因植株,为进一步研究该基因调控植物镉胁迫响应中的功能及其分子机制奠定基础。     

一个耐硒基因过表达载体的构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步验证WRKY47基因在调控硒胁迫应答中的功能,构建WRKY47过表达载体,获得相应的转基因株系。[方法]以野生型拟南芥的c DNA为模板,利用PCR扩增WRKY47基因全长,将该基因连接到p BI121载体上。将获得的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,通过浸化转化法将WRKY47重组质粒转化到拟南芥野生型植株中,利用转基因筛选与遗传鉴定获得WRKY47转基因阳性植株。[结果]扩增获得WRKY47基因,CDS全长1 470 bp,连接转化并获得测序正确的重组载体p BI121-WRKY47。通过抗性筛选和分子鉴定获得阳性转基因植株。[结论]成功构建过表达载体并获得相应的转基因株系,为进一步研究该基因的分子机制奠定基础。     

一个抗旱/抗寒基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步研究LWT1基因在调控低温和干旱应答中的功能,构建拟南芥LWT1基因过表达载体,获得相应的转基因株系.[方法]以野生型拟南芥的cDNA为模板,利用PCR扩增LWT1基因全长,将该基因连接到pART27载体上.将获得的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,通过浸花转化法将LWT1重组载体转化到拟南芥野生型植株中,利用转基因筛选与遗传鉴定获得LWT1转基因阳性植株.[结果]LWT1基因CDS全长990 bp,PCR电泳结果一致,测序比对结果正确.通过抗性筛选和分子鉴定获得转基因植株.[结论]LWT1过表达载体构建成功并获得相应的转基因株系,为进一步研究该基因的分子机制奠定基础.     

转基因拟南芥株系后代遗传稳定性鉴定

转基因材料的遗传稳定性是基因工程成败的关键内容之一,快速确证其多代遗传特性是进行大量后代材料分析的技术保证。该文主要利用PCR技术以提取出的DNA作为模板对外源基因进行扩增,从而鉴定外源基因的遗传特性。对提取出的DNA进行琼脂糖凝胶电泳分析,实验结果表明,提取出的DNA产量和质量较高,PCR的结果快速确证了转基因拟南芥外源ADH1基因的遗传稳定性。     

NtSKP1-GFP植物表达载体的构建及亚细胞定位

用PCR技术扩增NtSKPl基因的编码区,定向克隆至表达载体pCAMBIA1302上构建用于瞬时表达NtSKPl蛋白的重组质粒.重组质粒经PCR和测序鉴定后用冻融法转入农杆菌LBA4404,进而经农杆菌LBA4404介导转入烟草悬浮细胞,激光共聚焦显微镜观察确定其亚细胞定位.测序结果表明,插入片段与预期序列完全一致,与载体形成了一个完整的基因表达盒;亚细胞定位结果表明NtSKPl蛋白在胞浆和核部位均有分布.     

HbDREB1基因表达载体的构建及其转基因烟草的鉴定

[目的]研究强抗寒性牧草——短芒大麦DREB1（dehydration responsive element binding protein1）基因的功能,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定理论基础。[方法]利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,对转基因烟草进行分子生物学鉴定,并对离子渗漏率、脯氨酸表达量生理生化特性进行测定。[结果]HbDREB1整合入烟草基因组,已在转录水平上表达,转基因烟草在冷胁迫条件下的离子渗漏率明显低于对照组,且其脯氨酸表达量明显增高。[结论]HbDREB1基因具有提高植物抗寒性的潜能。     

转RSAG12-IPT基因苎麻株系光合性能研究

以转RSAG12-IPT基因苎麻T0代的株系及对照为材料,在大田环境下,在纤维成熟期测定其功能叶片的净光合速率和叶绿素含量.结果表明,部分转基因株系的净光合速率显著高于受体品系5041,其叶绿素组成成分的含量发生了变化,叶绿素总含量也显著高于对照.可见,导入RSAG12-IPT基因后,部分苎麻株系功能叶片的光合性能得到显著改善.     

转TaCRT基因拟南芥植株表型分析及抗性鉴定

为了进一步揭示小麦钙网蛋白基因TaCRT是否参与植物对环境胁迫响应,通过根癌农杆菌GV3101介导法将该基因cDNA克隆转入拟南芥,使其异源过量表达,分析转基因拟南芥纯系和野生型植株在表型上的差异,并对转基因株系的抗盐性进行鉴定。结果表明,过表达TaCRT基因的拟南芥纯系植株在正常培养条件下,植株生长相对旺盛,根系较短,分化的不定根数目较多,而在盐胁迫条件下,与野生型相比,转基因株系的耐盐性较强。     

HARDY基因植物表达载体的构建及在番茄中的遗传转化

HARDY(HRD)是AP2/ERF-like家族转录因子的一员,已有的研究表明它的过量表达可以增强水稻的抗旱性、提高水稻的水分利用效率.为了研究它是否在其他的农作物中具有普遍的适用性,本试验从拟南芥中克隆了HRD基因,成功构建了HRD基因的高效植物表达载体pBIN-HRD.采用农杆菌介导法转化番茄(亚心87-5),经PCR、RT-PCR分析表明,阳性的转HRD基因植株已获得表达.