禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原国家参考品的研制

按照国家一级标准物质要求和禽流感病毒（H5亚型）血凝抑制试验抗原制造及检验规程规定的抗原制备方法,研制了一批禽流感病毒（H5亚型）血凝抑制抗原国家参考品,用于检测禽流感病毒（H5亚型）制品生物效价和血凝抑制操作过程中的校验。该批抗原经过8家单位对其协作标定后对结果进行统计学分析,确定该批禽流感抗原的血凝效价为1：80。另对所研制的禽流感抗原均一性、稳定性、无菌检验、剩余水分测定、真空度测定等各项指标进行检测,结果均符合禽流感病毒（H5亚型）血凝抑制试验抗原制造及检验规程和国家一级标准物质要求。说明该禽流感病毒（H5亚型）血凝抑制抗原可以作为国家参考品。     

禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原国家标准品的研制

按照国家一级标准物质的要求,研制了禽流感病毒H9亚型(株)血凝抑制试验抗原国家标准品.对标准品的物理性状、无菌、效价、特异性、水分、真空度、均一性、稳定性等进行测定,各项指标均符合要求。经过8家单位对其协作标定,并经统计学分析,该批抗原血凝效价为460?80,最终定值为400。该禽流感病毒H9亚型(株)血凝抑制试验抗原可以作为国家标准品,批号为200901。     

抗禽流感H9亚型血凝素单克隆抗体的病毒中和作用

通过血凝抑制(HI)和鸡胚中和试验(VN)证实，本实验室制备的抗禽流感H9M2单抗11A5和11B2株可特异性地抑制H9亚型禽流感病毒的血凝特性，而与禽流感H5和H7亚型以及其他具有血凝性感染禽类的病毒(如新城疫等)不反应。两株单抗腹水HI效价均达到15Log2。中和试验表明：上述两株单抗均可有效抑制H9N2病毒在SPF鸡胚中的增殖，使病毒失去血凝活性．测得11A5和11B2株腹水对H9N2禽流感病毒的半数保护量分别为10^-3.35和10^-4.58。该单抗的研制成功对于进一步建立快速鉴别诊断禽流感H9亚型病毒具有重要意义。     

应用荧光免疫层析法检测H7亚型禽流感病毒

为了验证荧光免疫层析法检测H7亚型禽流感病毒的可行性,采用荧光免疫层析法分别对标准抗原和临床样品进行检测,评价该方法的特异性、敏感性、稳定性和方法的适用性。结果为H7亚型流感病毒荧光免疫层析试纸条能够检出H7N9、H7N2亚型禽流感抗原阳性,对其他抗原检测结果为阴性;能检出H7N9、H7N2亚型禽流感病毒抗原(血凝效价1:512)1 000倍的稀释度;检测10次H7N9亚型禽流感抗原的变异系数为1.12%,差异不显著;检测临床100份样品结果均为阴性。结果表明,应用荧光免疫层析法检测H7亚型禽流感病毒操作简便、试验时间短、不受人为因素干扰,适合市场、养殖场大规模的监测或检疫。     

6株H9N2亚型禽流感病毒的分子演化和抗原变异分析

H9N2亚型禽流感持续在我国鸡群中广泛流行,为了明确2017年山东省聊城市一肉鸡场H9N2亚型禽流感病毒的分子演化和抗原变异情况,对6株H9N2亚型病毒分离株进行了基因扩增、序列测定和进化分析,并分别使用病毒分离株和疫苗株抗原进行血凝抑制试验,比较免疫鸡血清的抗体效价差异。结果如下:NCBI Blastn分析表明,与各分离株基因同源性最高的序列分别来源于山东、河北、上海、江苏、浙江、江西、湖南、广东和日本等地的分离株,表明H9N2亚型禽流感病毒传播范围广,基因重排活跃。各基因的系统进化分析表明,分离株的8个基因片段分别与禽流感病毒欧亚分支的A/duck/HongKong/Y280亚系、A/quail/HongKong/G1/97亚系以及A/chicken/Shanghai/F/98亚系进化关系密切。从病毒基因型上来分析,6株病毒均隶属于2010年以来在国内鸡群中广泛流行的G57基因型。与耐药性相关的氨基酸位点分析表明,病毒M2蛋白存在S31N变异,表明病毒对离子通道蛋白抑制剂耐药。对1 000份疫苗免疫鸡血清进行血凝抑制抗体效价的检测,发现H9N2亚型禽流感分离株抗原与疫苗用标准抗原相比,所测得的血凝抑制抗体滴度平均低1~2log2,表明二者HA抗原性略有差异。总之,2017年在该肉鸡场流行的这6株H9N2亚型禽流感病毒仍然为G57基因型,分离株的HA抗原反应性与疫苗株略有差异。     

自主活动鸟类禽流感及新城疫的生态学与流行病学调查分析

在2004年初H5亚型禽流感在中国内地引起暴发前后，于湖北、广西二疫区市县的生态系中，自健康的鹰、鸽子、野鸭和鹌鹑中采集了54份血清，应用血凝抑制试验（HI）对其进行了血清学检测，并将获得的血清学检测数据进行了统计学分析。分析结果显示，在总共采集的54份血清样品中，抗新城疫病毒（NDV）抗体、抗It6亚型禽流感病毒（H6）抗体、抗H9亚型禽流感病毒（H9）抗体、抗H5亚型禽流感病毒（H5）抗体阳性率分别为64．8％、64．8％、75．9％、29．6％。推断这一时期新城疫病毒（NDV）、H6亚型禽流感病毒（H6）、H9亚型禽流感病毒（H9）和H5亚型禽流感病毒（H5）共循环于该生态系中，其中新城疫病毒、H9、H6亚型禽流感病毒长期、稳定循环于该生态系中，为该生态系主要流行血清型。血凝抑制试验检测结果发现，抗H5亚型禽流感病毒抗体效价较低，最高仅为640，其阳性率为29．6％，推断其可能为新近传入的病毒或新近重组变异出现的新病毒、与该次流感暴发相关的新病毒，这一推断还有待于通过对病毒基因序列的分析而做进一步验证：另外，新城疫病毒在该生态系中的稳定循环，构成了对家禽持久、潜在的威胁。对于自1994年以来，长期稳定循环于我国生态系及家禽中的H9亚型禽流感病毒则仍然是以G9-like为优势亚组。本研究结果还提示我们，对我国自主活动鸟类的生态系中抗禽流感病毒抗体的监测是预警、预报我国家禽流感暴发的有效途径，也是十分必要的，同时，血清学的检测结果为我们进一步的分子水平的分析研究提供了明确的靶向。     

蛋鸡大肠杆菌和H9亚型禽流感病毒混合感染的诊治

2014年1月,建水某蛋鸡养殖场发生一起以呼吸困难、产蛋下降、急性死亡为特征的病例.采集病料进行细菌和病毒的分离与鉴定,分离到的6株大肠杆菌,血清学试验结果显示,血清型为O78、O88.药敏试验结果显示,分离株对丁胺卡那霉素、环丙沙星等敏感,但对头孢氨苄、强力霉素、新霉素等药物有耐药性.分离到1株病毒,鸡胚尿囊液HA效价8log2～ 10log2,血凝抑制试验结果显示,分离病毒的血凝特性能被H9亚型禽流感标准阳性血清所抑制,表明从病料中分离出了H9亚型禽流感病毒,诊断为大肠杆菌与H9亚型禽流感病毒的混合感染.     

暴发高致病禽流感疫区鸟类禽流感的血清学调查

本研究应用血凝抑制试验(H I),2004年初H 5亚型禽流感在中国内地发生前后,于湖北、广西二疫区市县的生态系中,自健康的鹰、鸽子、野鸭和鹌鹑中采集了54份血清,对其进行了血清学检测,并将获得的血清学检测数据进行了统计学分析。分析结果显示,在总共采集的54份血清样品中,抗H 6亚型禽流感病毒(H 6)抗体、抗H 9亚型禽流感病毒(H 9)抗体、抗H 5亚型禽流感病毒(H 5)抗体阳性率分别为64.8%、75.9%、29.6%。推断,这一时期,H 6亚型禽流感病毒(H 6)、H 9亚型禽流感病毒(H 9)和H 5亚型禽流感病毒(H 5)共循环于该生态系中,其中H 9、H 6亚型禽流感病毒长期、稳定循环于该生态系中,为该生态系禽流感主要流行血清型。血凝抑制试验检测结果发现,H 5亚型禽流感病毒抗体滴度较低,最高仅为640×,其阳性率为29.6%,推断其可能为新近传入的病毒或新近重组变异出现的新病毒,可能为与该次禽流感暴发相关的新病毒,这一推断还有待于通过对病毒基因序列的分析而做进一步验证。     

禽流感H_5和H_9混合疫苗免疫肉鸽的效果试验

将禽流感H5亚型二价灭活疫苗（H5N1,Re-4＋Re-5）和H9亚型（SS株）灭活疫苗等量均匀混合,采用不同剂量不同次数分别注射。用血凝和血凝抑制试验方法检测H5亚型（Re-4、Re-5）和H9亚型（SS株）抗体效价。试验表明：以较小剂量0.5ml/只,间隔21d二免能产生整齐、持久、高滴度保护抗体,据此提出鸽H5和H9亚型禽流感多价混合疫苗的参考免疫程序。     

禽流感病毒H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的制备和鉴定

以常规方法纯化H9亚型禽流感病毒，制备了两株分泌抗禽流感病毒H9亚型血凝素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞11A5和1182，其上清ELISA效价均为1：10^4，腹水效价为1：10^7和1：10^6，HI效价上清分别为8、7log2，腹水效价均为15log2。采用HI方法证明其对禽流感病毒H9亚型的特异性，通过Western blot方法证明两株单抗都针对H9亚型禽流感病毒HA1蛋白。     

H9N2亚型禽流感病毒中和单克隆抗体的制备与应用

为建立H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）免疫层析快速检测技术,本研究以差速离心法纯化H9N2亚型AIV免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合和HAT选择性培养;以H9N2亚型AIV感染MDCK细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法,通过对杂交瘤细胞的IPMA筛选和连续克隆化筛选鉴定抗H9N2亚型AIV中和性单克隆抗体;以胶体金标记HA单克隆抗体,配对HA单克隆抗体和羊抗小鼠IgG为检测线和质控线,制备H9N2亚型AIV快速检测试纸条,测定其特异性和敏感性。结果显示,获得了11株稳定分泌抗H9N2亚型AIV单克隆抗体的杂交瘤细胞,其单克隆抗体腹水IPMA效价在1.28×10^-4至2.56×10^-5之间。单克隆抗体3A2、5H6、6B8、7E10和9G12血凝抑制试验（HI）显示血凝抑制活性,其（HI）效价在6log2~9log2之间。单克隆抗体3A2、6B8和9G12在病毒中和试验中对H9N2亚型AIV有显著病毒中和活性,中和效价分别1∶6 400、1∶25 600和1∶25 600。Western blotting结果提示,该中和单克隆抗体识别HA蛋白线性抗原表位。利用配对单克隆抗体3A2和9G12研制的H9N2亚型AIV检测试纸条检测H9N2亚型AIV尿囊液的效价为9log2,灵敏度与经典血凝试验（HA）相当,与其他亚型AIV （H1、H3、H5、H7）,以及新城疫病毒和鸡传染性法氏囊病病毒等相关病毒均无交叉反应。本研究制备了具有病毒中和活性的抗H9N2亚型AIV单克隆抗体,并初步研制了H9N2亚型AIV检测试纸条,为H9N2亚型AIV新型疫苗研制和快速检测奠定良好的研究基础。     

H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定

以禽流感病毒A/Chicken/Hubei/327/2004(H5N1)免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用血凝抑制试验筛选细胞培养上清,采用有限稀释法对阳性孔进行克隆,3次克隆后获得7株能稳定分泌抗H5亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1C4,1D4,1E12,2E11,4C12,4G2和5E12。细胞培养上清HI效价为24~27,腹水HI效价可达210~218。所有单抗与禽流感H7和H9亚型标准血凝抗原,新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒无交叉反应。在细胞上的中和试验显示具有较高的中和效价,获得的单克隆抗体可在禽流感流行病学的监测中发挥重要作用。     

禽流感病毒CH02株(H9)的鉴定及其NS 基因分子特征分析

从疑似感染H9亚型禽流感病毒的病鸡内脏组织中分离到1株能凝集鸡红细胞的病毒,通过血凝抑制试验、鸡胚中和试验、RT-PCR鉴定,确认其为H9亚型禽流感病毒,并命名为CH02株。该病毒HA效价为2^7.67±0.58;其血凝性可被抗H9亚型禽流感病毒阳性血清完全抑制,HI效价为7log2;鸡胚半数感染量(EID₅₀)为10^-8.68 EID₅₀/0.1 mL;最小致死剂量致鸡胚死亡的平均时间(MDT)为85.6 h;1日龄鸡脑内致病指数(ICPI)为0.625;其NS基因与香港株、南京株、北京株、汕头株、韩国株、巴基斯坦株的核苷酸同源性为88.6%~100%,经进化分析CH02株与香港株(A/duck/Hong Kong/Y280/97)同属一个分支。     

种鸡禽流感抗体的检测与分析

为了解潍坊市某些种鸡禽流感免疫抗体的水平,本试验利用血凝和血凝抑制试验对9个鸡场188羽种鸡的血清进行禽流感抗体检测。结果表明H5亚型禽流感抗体效价在8log_2至12log_2的血清有178头份,免疫合格率94.68%,H9亚型禽流感抗体效价在8log_2至12log_2的血清有159头份,免疫合格率84.57%。     

禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测方法的建立

将禽流感病毒H7亚型标准抗原作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取免疫合格的脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合。通过血凝抑制试验,筛选得到12株杂交瘤细胞上清具有HI效价,且与禽流感病毒H7亚型阳性血清间具有较好的竞争效果。将竞争效果最好的1H11细胞扩大培养后制备腹水,获得的单克隆抗体具有效价高、特异性好等特点。使用H7标准抗原包被ELISA板,将HRP标记的单克隆抗体作为竞争抗体,建立了一种禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测方法。利用该方法对待检血清进行测试,与HI试验有99.3%的符合率,说明试制的禽流感病毒H7亚型竞争ELISA抗体检测试剂盒可以用来检测禽流感病毒H7亚型抗体,且操作简便快捷,可批量操作,大样本检测鸡群抗体水平。     

我国H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白145和153位抗原位点变异分析

H9N2亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)易发生抗原漂移,但识别我国H9N2亚型AIV流行株抗原差异性的关键抗原位点还不清楚.选取两株血凝抑制(HI)效价高的H9N2亚型AIV单克隆抗体2E4与2D6对A/Chicken/Shanghai/F/1998(H9N2)毒株施加抗体压力制备单抗逃逸突变株,鉴定抗原位点...     

8株H9亚型禽流感病毒的分离鉴定与抗原交叉保护性分析

为了探讨河南省鹤壁市H9亚型禽流感病毒的流行情况及抗原的差异性,试验采用病毒分离鉴定及交叉攻毒免疫保护试验对8株H9亚型禽流感病毒进行了抗原差异性分析。结果表明:利用SPF鸡胚从疑似感染H9亚型禽流感病毒的病料中分离鉴定出8株病毒,这8株病毒诱导的SPF鸡产生的HI抗体效价基本相同,能抵抗不同毒株的攻击。说明河南省鹤壁市H9亚型禽流感病毒流行毒株间具有较好的交叉保护力。     

一株H9亚型禽流感病毒的分离鉴定及免疫试验

为了解养禽业禽病流行病毒株的基本情况,本研究对2014年从山东某鸡场采集的疑似流感的病料样品采用鸡胚尿囊腔接种进行病毒的分离,并经血凝试验(HA试验)、血凝抑制试验(HI试验)及分子生物学试验对其病原学进行鉴定。结果显示,分离鉴定到一株病毒分离株。HA试验结果表明该分离株具有血凝活性,经病毒亚型鉴定为一株H9亚型禽流感病毒(AIV),该病毒株为欧亚分支的BJ亚分支,将该病毒株筛选纯化后作为毒种,制备了禽流感油乳剂灭活疫苗,将该疫苗免疫SPF鸡,21 d后对其HI抗体效价进行检测,结果显示其平均效价达到9.1 log2,免疫后第35 d HI抗体平均效价达到峰值10.3 log2,至免疫后第10周,HI抗体平均效价仍达8.5 log2。本研究分离的病毒制备成疫苗后具有较好的免疫效果,可以作为疫苗候选株。     

H9N2亚型禽流感病毒TJ1株的分离与鉴定

从发病蛋鸡群分离到H9N2亚型禽流感病毒TJ1株,对其进行了系统的生物学特性鉴定.结果表明,分离毒TJ1株具有血凝性,且凝集不被新城疫和产蛋下降综合征抗血清抑制,而被H9亚型禽流感病毒标准阳性血清抑制,禽流感琼扩试验结果为阳性,在电镜下呈典型的流感病毒粒子形态,证明该毒株为A型流感病毒;通过致病力试验,分离毒TJ1株对6周龄SPF鸡无致病性,为低致病性毒株;用其制备成油乳剂灭活疫苗免疫雏鸡,能很快产生对H9特异的血凝抑制抗体,于免疫后3周攻毒,可以保护雏鸡抵御同病毒攻击的感染,表明分离毒TJ1株具有良好的免疫原性.     

朗德鹅禽流感病毒的分离与鉴定

用禽流感病毒ELISA试剂盒对某朗德鹅养殖场的病鹅气管粘液进行了检测，发现5份粘液样本均呈禽流感阳性；随后取相应气管组织材料接种于9～11日龄鸡胚分离病毒．发现尿囊液能使鸡红细胞发生凝集，用禽流感病毒H5、H7、H9标准阳性血清和新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊炎病毒抗血清作HI试验，结果禽流感病毒H5亚型抗血清的血凝抑制滴度达到2^7，而禽流感病毒H7、H9亚型及其他病毒抗血清无血凝抑制滴度，说明从朗德鹅分离到的病毒为H5亚型禽流感病毒。