免疫磁珠富集法对牛源大肠杆菌O157∶H7分离鉴定的影响

为证明免疫磁珠吸附技术对牛源大肠杆菌 O157∶H7分离效率的影响,从新疆五家渠市、伊宁县、昌吉市3个牛场的采集18份粪样、162份肛拭子、10份饲料样、17份水样和36份胴体表面棉拭子样本,经EC肉汤增菌后,分别采用免疫磁珠富集后和直接进行SMAC和MUG试验进行选择性培养,然后对菌体rfbE基因和鞭毛fliC基因进行PCR检测,最后对疑似大肠杆菌 O157∶H7菌用生化试验进行符合性检测。结果2种方法分别从243份样品中分离到8株和4株大肠杆菌 O157∶H7,统计学分析该差异不显著。本试验结果表明,在实践中免疫磁珠吸附技术和普通方法相比虽然在统计学上差异不显著,但确实能够增加大肠杆菌O157∶H7的分离数量,这与以前的相关研究结果基本一致。     

免疫磁珠法分离大肠杆菌O_(157):H_7及毒力基因的PCR检测

为了了解新疆不同牛场中大肠杆菌O157:H7的流行情况,对新疆乌鲁木齐、伊犁地区、塔城地区多个牛场采集的粪样及水样样本的检测,样品经EC肉汤增菌、免疫磁珠富集后,用SMAC平板和MUG培养基进行初步筛选,再用rfb E和fli C基因对筛选后的疑似大肠杆菌O157:H7菌株做PCR检测,同时结合生化试验的方法进行符合性检验。结果从新疆3个地区不同牛场的208份样品分离得到5株肠出血性大肠杆菌O157:H7,检出率为2.4%。其中粪样检出5株,检出率为2.4%;水样未检出。生化试验结果表明,5株分离出的大肠杆菌O157:H7菌株与国标规定的O157:H7特性相同。表明,部分被检牛场存在大肠杆菌O157:H7威胁,应该引起重视。     

肠出血性大肠杆菌O157毒力及黏附相关基因的PCR检测和PCR—RFLP分析

为了了解大肠杆菌O157分离菌株携带毒力及黏附相关基因的情况及菌株的多态性.用聚合酶链式反应扩增stx1、stx2、eaeA、ehxA、EspA和Tccp基因.选用限制性内切酶HincⅡ和EcoRⅡ对分离的O157:H7菌株eaeA基因进行酶切,选用限制性内切酶HaeⅢ、HinfⅠ、EcoRⅡ和RsaⅠ对分离的O157:H7菌株chxA基因进行酶切,最后对这两个基因进行PCR-RFLP分析.结果,所有O157:H7菌株扩增出eaeA、ehxA、EspA和Tccp基因,但没有扩增出stx1和stx2基因;4株O157:H?菌株,均没有扩增出stx2、eaeA、ehxA、EspA和Tccp基因,且只有1株扩增出stx1基因.所有分离菌株的eaeA基因和ehxA基因选用限制性内切酶酶切之后所得酶切片段数目和大小与标准菌株的eaeA基因和ehxA基因选用限制性内切酶酶切之后所得酶切片段数目和大小相同.结果表明,由于所有菌株缺失stx2基因,其致病力相对较低,且在基因水平较为保守,多态性较为单一.     

大肠埃希菌O157∶H7 eae A基因的克隆及其表达质粒的构建

采用自行设计的引物,应用PCR方法直接从广东分离株大肠埃希菌O157∶H7021210的染色体DNA中扩增出eaeA基因的完整阅读框,得到了一条大小约为2 800 bp的基因片段。T-A克隆后将其亚克隆至原核表达载体pET-28a( ),经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定,证实成功构建原核重组表达质粒pET-eaeA。大肠埃希菌O157∶H7 eaeA基因的克隆及原核表达质粒的成功构建,为下一步进行诱导表达、活性鉴定及eaeA基因表达蛋白诊断抗原的研制奠定了基础。     

牛源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定

为调查新疆部分地区E.coli O157∶H7的感染情况和菌株致病性,从新疆阿克苏、伊犁、塔城3个地区的牛场采集新鲜粪样564份,对E.coli O157∶H7进行分离与鉴定。利用E.coli营养肉汤(EC肉汤)对样品进行增菌后,用山梨醇麦康凯培养基(SMAC)平板选择性培养,再经过4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸苷培养基(MUG)的筛选,对疑似菌株进行生化和PCR鉴定,并将分离鉴定到的菌株进行小鼠攻毒试验。结果显示,从伊犁地区采集的样品中共分离出2株E.coli O157∶H7(Y166和Y226),其检出率为0.88%;小鼠攻毒试验中,Y166和Y226试验组小鼠在48h内全部死亡,具有一定致病性;从阿克苏、塔城所采样品中未分离到E.coli O157∶H7。     

季节对新疆牛源E.coli O157∶H7分布的影响研究

试验旨在研究季节对牛源E.coli O157∶H7分布的影响。在新疆地区A、B、C 3个牛场中,分别于春、夏、秋、冬4个季节采集牛肛拭子(399份)、粪便(68份)、水(29份)和饲料(43份)样本,先用EC肉汤增菌,再用山梨醇麦康凯培养基(SMAC)与4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸苷(MUG)选择性培养,然后进行PCR鉴定和毒力基因检测。结果显示,从3个牛场539份样本中共检出E.coli O157∶H7菌株5株(0.93%,5/539),其中春季样本检出2株(1.44%,2/139),秋季样本检出1株(0.56%,1/180),冬季样本检出2株(1.38%,2/145),未能从夏季样本中检出目标菌;B牛场的菌株检自肛拭子样本(0.69%,1/145),C牛场的菌株分离于饲料(20.00%,3/15)和肛拭子(0.66%,1/152)样本,水中未分离到目标菌。牛源E.coli O157∶H7的分布具有明显的季节性,B牛场只在秋季的肛拭子样本中检出了1株E.coli O157∶H7,C牛场分别在春季和冬季各检出2株,春、冬季E.coli O157∶H7分离率高于夏、秋季。因此,在新疆特殊的气候特点和饲养模式下,防控牛源E.coli O157∶H7的传播时,要十分注意寒冷季节圈舍内卫生的管理,尤其要严防饲料被粪便污染。     

猪源大肠杆菌O157:H7广西分离株的鉴定

为了解大肠杆菌O157:H7是否在猪场存在,采集有拉稀症状猪的粪便,接种到新生霉素mEC增菌肉汤,增菌培养后转接到O157:H7显色培养基上,对可疑菌株用因子血清和PCR方法做进一步鉴定,实验结果证实得到5株大肠杆菌为O157:H7血清型。动物试验发现,5个分离菌株对小白鼠的致死率为33.3%—100%之间。调查结果证实广西猪群中存在强致病性的O157:H7血清型大肠杆菌。     

江苏某奶牛场健康奶牛体内产志贺毒素大肠杆菌的分离鉴定及其对小鼠致病性的研究

通过对江苏省某奶牛场连续6个月的定群、定畜跟踪调查,获得产志贺毒素大肠杆菌(STEC)在该牛场分布的广泛性、持续性和血清型多样化的资料,并对一些重要血清型分离株作致病性的鉴定.基于本实验室已经建立的多重PCR方法对stx1、stx2、eaeA、ehxA共4个基因进行检测,对检测出的阳性样品,非O157 STEC采用多重PCR结合CT-SMAC平板的分离方法,而O157 STEC通过免疫磁珠结合O157显色平板的分离方法.结果表明,该奶牛场STEC的初筛率为16.1%(112/696),分离率为11.1%(77/696).分离株属于35种O血清型和60种O:H血清型.该场的优势血清型为O4、O26和O93,O157在该场存在,但并非优势血清型.77个分离株中,stx2基因的检出率为68.8%,远远高于其它毒力基因,如stx1(19.5%)、eaeA(11.7%1)和ehxA(20.8%).该场分离到一些O157和O26血清型的菌株,对小鼠具有较强的致病性.奶牛是STEC的天然宿主,可健康带菌.除了O157STEC外,非O157 STEC中一些高致病力菌株对人类的健康也存在威胁.     

牛源大肠杆菌O157：H7的分离及毒力基因鉴定

从2个牛场采集新鲜粪便,增菌后,免疫磁珠富集,涂布筛选性培养基,挑取可疑菌落用rfbE/fliC二重PCR和血清学方法鉴定。设计毒力基因stx1、stx2、eae、hlyA和tccp相应引物,针对O157：H7对分离株进行PCR鉴定。口服攻毒链霉素处理的BALB/c小鼠明确分离株致病性。结果显示,成功分离到7株出血性大肠杆菌O157：H7,并且有1株迟缓性发酵山梨醇麦康凯培养基。毒力基因检测显示,其中6株毒力因子表型为stx1-stx2＋eae＋hlyA＋tccp＋,另有1株表现型为stx1＋stx2＋eae＋hlyA＋tccp＋,各分离株tccp基因均为阳性,但携带的重复片段数量有差异。所采集样品中肠出血性大肠杆菌O157：H7的检出率高达12%。1×1010 CFU同剂量口服接种经PBS洗涤的5株O157：H7分离株全菌,小鼠存活率有差异分别为40%,50%,60%,20%,50%,各分离株在小鼠体内排菌时间也有差异分别为攻毒后7,9,13,13,15d。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7 EMA-PCR检测技术的建立

肠出血性大肠杆菌O157∶H7是一种重要的人畜共患传染病病原菌。为建立一种特异、灵敏的O157∶H7新型检测技术,以O157抗原基因(rfbE基因)为模板设计特异性引物,利用叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide bromide,EMA)处理菌液,沸水浴法制备细菌裂解液,优化PCR条件,建立一种快速、有效的O157∶H7活菌EMA-PCR检测方法。结果显示:EMA-PCR可从rfbE基因阳性菌株CVCC248和两株临床分离菌株cd0912、cd0803中扩增出大小为495 bp的特异性条带,检测灵敏度可达12 CFU/mL。经EMA处理,从含有1%～100%O157∶H7 CVCC248活菌混合悬液制备的DNA中均可扩增出目的片段。因此,成功建立了肠出血性大肠杆菌O157∶H7的EMA-PCR检测方法;该方法可避免因分析的样品中含有死细菌而造成的假阳性检测结果,检测的准确性和真实性较传统PCR大大提高。O157∶H7 EMA-PCR技术的建立为O157∶H7的临床诊断提供了新的方法,具有重要的实际应用价值和良好的应用前景。     

饲料中肠出血性大肠杆菌O157∶H7双重PCR检测方法的建立

根据肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli,EHEC)O157∶H7的O抗原编码基因rfb E和H抗原编码基因fli C分别设计引物,建立双重PCR方法。饲料样品人工污染EHEC O157∶H7后进行增菌培养,利用双重PCR进行检测EHEC O157∶H7。结果表明:建立的PCR方法能够特异性扩增出目的条带,敏感性可达到100 cfu细菌。双重PCR方法可以有效地检测出饲料中人工污染的EHEC O157∶H7,人工污染饲料样品经4 h预增菌处理后,该方法的检测下限为20 cfu细菌。本研究建立的双重PCR方法可快速、特异地检测出饲料中污染的EHEC O157∶H7,可用于饲料中EHEC O157∶H7的检测及流行病学调查。     

上海市动物及其产品中大肠埃希菌O157:H7带菌情况的调查

为了解上海市动物及动物产品中大肠埃希菌O 157∶H 7带菌情况及其毒力采集上海市猪、牛等动物粪便以及市场和超市猪肉、牛肉、牛奶、虾仁等样本568 份,应用免疫胶体金技术、分离培养、形态特征观察生化特性鉴定、血清学试验、多重引物PCR进行大肠埃希菌O 157∶H 7的分离、鉴定及毒力基因分析。结果表明,上海市动物及动物产品中存在大肠埃希菌O 157∶H 7,检出率为2.05%。其中牛粪、猪粪中检出率较高,分别为9.76%和8.57%。     

猪源大肠杆菌O157∶H7体外氟苯尼考耐药诱导及对抗菌药物敏感性变化研究

为初步研究猪源大肠杆菌O157∶H7(E.coli O157∶H7)对氟苯尼考耐药性的产生和消除机制,本研究采用亚抑菌浓度体外耐药诱导的方法将两株猪源大肠杆菌O157∶H7诱导成氟苯尼考高度耐药菌株,采用无氟苯尼考压力下连续传代培养的方法将获得的氟苯尼考耐药菌株的氟苯尼考耐药性消除,检测耐药诱导菌和耐药消除菌对抗菌药物的敏感性,并检测菌株质粒携带的耐药基因。结果显示,经氟苯尼考耐药诱导,猪源大肠杆菌O157∶H7对氟苯尼考、阿莫西林、头孢唑啉、头孢拉定和头孢噻吩由敏感变为耐药,对头孢噻肟的敏感性由敏感变为中介,对氧氟沙星、环丙沙星和阿奇霉素由中介变为耐药;而经耐药消除后,菌株恢复对上述药物的敏感性;在菌株的质粒中检测到氟苯尼考耐药基因、喹诺酮类耐药基因和β-内酰胺酶基因,与耐药表型相符。结果表明,在氟苯尼考压力的长期存在下,猪源大肠杆菌O157∶H7对氟苯尼考产生耐药,且对青霉素类、头孢类和喹诺酮类药物产生交叉耐药,在去除氟苯尼考压力下连续培养,可消除菌株的部分耐药性。     

猪源大肠杆菌O157∶H7耐药表型和消毒剂抗性调查

为了调查广西猪源大肠杆菌O157∶H7分离株的耐药表型和消毒剂抗性情况,本研究测定5株猪源大肠杆菌O157∶H7广西分离株的药物敏感性和消毒剂抗性,并应用PCR对5株细菌的耐氨基糖苷类抗生素基因:氨基糖苷磷酸转移酶基因aph(3)-Iia、乙酰转移酶基因aadA和aadB进行扩增。27种抗菌药物的敏感结果表明,5株菌株只对氟苯尼考、头孢曲松、头孢西丁和头孢噻肟敏感;对罗红霉素、多黏菌素B、利福平、林可霉素、阿莫西林、氨苄西林和头孢噻吩的耐药率为100%;对壮观霉素、链霉素、头孢拉定等药物的耐药率在20%~60%之间。在5株大肠杆菌O157∶H7广西分离株中,分别有1株、1株和3株菌株对23种、11种和9种抗菌药产生耐药性。PCR结果证实,5株细菌携带有耐氨基糖苷类抗生素基因,耐药基因的存在与其耐药表型有一定的相关性。消毒剂抗性结果显示,5株细菌对聚维酮碘溶液、新洁尔灭消毒液、稀戊二醛溶液、双季铵盐—碘消毒液、复方过氧乙酸具有抗性,只对二氯异氰尿酸钠粉敏感。研究结果对预防和控制广西大肠杆菌O157∶H7提供了数据。     

大肠杆菌O_(157)∶H)7荧光PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立大肠杆菌O157∶H7荧光PCR检测方法,试验参照Gen Bank中已发表的大肠杆菌O157∶H7的O抗原RFBE基因序列,针对保守区序列设计了特异性引物和探针,优化了反应体系和反应程序,评价了该方法的特异性、敏感性、重复性,并进行了临床样品检测。结果表明:该方法的特异性和重复性好,具有较高的敏感性,最低检测浓度为5 cfu/mL;用该方法检测60份冻肉样品,得到的结果与传统的细菌分离鉴定法一致。说明建立的大肠杆菌O157∶H7荧光PCR方法是快速鉴定大肠杆菌O157∶H7的有效方法,具有较大的应用价值。     

大肠杆菌O157:H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制

为建立快速检测鼠感染大肠杆菌O157∶H7后的抗体,本研究采用颗粒为20nm的胶体金溶液标记纯化的羊抗鼠IgG,制备金标探针,喷涂于玻璃纤维膜上;将大肠杆菌O157∶H7抗原和抗大肠杆菌O157∶H7单克隆抗体F1分别包被于硝酸纤维素膜上作为检测线和质控线,组装成鼠血清O157∶H7抗体胶体金免疫层析检测试纸条。实验结果表明,该试纸条仅与O157∶H7阳性鼠血清发生特异性反应,用该试纸条与常规间接ELISA平行比较检测O157∶H7免疫鼠血清,抗体效价分别为1×106和1×105,两者的敏感度相当。该试纸条操作简便,10min可出结果,适用于调查与追溯鼠O157∶H7感染状况时的现场检测。     

肠出血性大肠杆菌强定殖株中新的双组份系统的鉴定

为了比较7株肠出血性大肠杆菌O157∶H7的定殖能力,采用灌胃感染的方式,将7株肠出血性大肠杆菌分别感染小鼠。对粪便中的细菌以及盲肠内定殖的细菌进行分离、计数,发现牛源菌株C1的定殖能力最强,且定殖维持时间最长。对C1菌株的基因组序列分析得到1对功能未知的双组份调节系统(TCS),N5512/N5520。PCR检测显示N5512/N5520存在于绝大多数肠出血性大肠杆菌O157∶H7临床分离株(98.5%),而在其他致病型的大肠杆菌中没有检测到。本研究为大肠杆菌O157∶H7的定殖和致病机制研究奠定了基础。     

猪源大肠杆菌O157∶H7毒力差异株的转录组测序分析

为了解大肠杆菌O157∶H7毒力差异株转录组差异,丰富O157∶H7转录组数据信息,本研究采用Illumina HiSeq^TM 2000平台对两株大肠杆菌O157∶H7毒力差异株进行高通量测序,测序数据采用测序评估、基因功能注释等生物信息学方法进行分析。结果发现,经过测序,两个菌株分别获得3 113 118和2 944 912条reads,比对到参考基因组上的reads分别占总reads的83.76%和78.97%。以中等毒力株为参考,在高毒力株中共获得941个差异表达基因,其中上调基因637个,下调基因304个。GO功能注释分析表明,差异表达基因主要与催化活性功能、黏附、转运活性、受体活性、酶调节活性、定位、生化调节、运动等诸多生理生化过程相关;KEGG富集分析发现共有425个基因注释到160个代谢通路中,其中新陈代谢、核糖体、鞭毛合成、嘧啶代谢、糖类代谢、细菌趋化等通路显著富集。此次通过大肠杆菌O157∶H7毒力差异株转录组研究对差异表达基因涉及的信号调控及可能的功能基因进行了探索,丰富了转录组信息,为进一步开展大肠杆菌O157∶H7毒力相关基因的研究及分子调控机制奠定了基础。     

3种食源性致病菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立

旨在建立一种可同时快速检测大肠杆菌O157 ∶ H7、沙门菌和产单核细胞李氏杆菌3种食源性致病菌的TaqMan多重荧光定量PCR(qPCR)方法.针对大肠杆菌O157 ∶ H7 rfbE基因、沙门菌invA基因和产单核细胞李氏杆菌hlyA基因的保守序列分别设计特异性引物和TaqMan探针,建立多重qPCR反应体系,进行...     

肠出血性大肠杆菌O157 ler基因缺失突变株的构建及其特性

以肠出血性大肠杆菌O157∶H786～24为始发菌株,利用自杀性载体pCVD442,根据同源重组的原理敲除了染色体上的ler基因,构建了O157∶H7 ler基因缺失突变菌株,并对其生物学特性进行了初步研究。荧光定量PCR试验结果表明,始发菌株对HEp-2细胞的平均黏附数量是突变菌株的17倍。试验也证实了ler基因对LEE致病岛毒力基因的正调控作用,这为O157∶H7基因缺失突变弱毒疫苗株的建立奠定了基础。