鸭源致病性大肠杆菌工型菌毛pilA基因序列测定及生物信息学分析

据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列，由Oligo 6．0设计一对引物，以提取的鸭源致病性大肠杆菌基因组为模板，进行PCR扩增，获得了5株鸭源致病性大肠杆菌的pilA基因，序列测定和生物信息学分析表明：鸭源致病性大肠杆菌pilA基因核苷酸序列长度为549bp，编码182aa，与人源、鸡源及猪源大肠杆菌pilA基因之间核苷酸同源性为87．3％～100．0％，氨基酸同源性为87．5％～100．0％。对不同宿主来源大肠杆菌pilA基因所编码蛋白的二级结构、亲水性、抗原性、抗原表位进行预测分析比较，结果显示Ⅰ型菌毛间具有一定的结构相似性，并存在一定的共同抗原位点；系统进化分析表明，各菌株之间的pilA基因遗传相关性与其宿主来源及血清型之间没有严格的相关性。     

鸡源大肠杆菌1型菌毛结构基因(pilA)克隆

根据人源大肠杆菌１型菌毛结构基因ＤＮＡ序列,在其保守区设计了１对带有ＢａｍＨ Ｉ／ＨｉｎｄⅢ酶切位点的引物,经ＰＣＲ扩增,从２４株鸡源大肠杆菌致病株染色体中得到２１个大小约６５７ｂｐ的阳性产物,经酶切、连接、转化及筛选,得到３种来自不同自清型鸡源大肠杆菌ＰＣＲ产物的阳性克隆。经核酸序列测定,确认所克隆的外源基因为１型菌毛ｐｉｌＡ基因。     

致病性鸡大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimA基因的克隆和同源性分析

根据Genbank已发表的致病性鸡大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)Ⅰ型菌毛fim A基因序列,设计并合成了位于fim A基因保守区的1对引物.应用PCR技术以鸡大肠杆菌标准株和分离株DNA为模板,扩增到片段长为549 bp的阳性产物;经酶切、连接、转化和筛选,得到fim A基因,并克隆、测序;运用DNAStar软件对核酸序列分析,确定所扩增和克隆的DNA片段为fim A基因.     

鸡大肠杆菌1型菌毛基因簇E基因的克隆与序列测定

鸡大肠杆菌1型菌毛是一种重要的致病因子,可以黏附到家禽机体的呼吸道上皮,从而引起机体发病。1型菌毛基因簇由fimB,fimE,fimA,fimI,fimC,fimD,fimF,fimG和fimH等组成。在国外K12株大肠杆菌1型菌毛fimE基因是一个大小为为555 bp,具有相变开关功能的片段,我国鸡源大肠杆菌1型菌毛fimE基因序列尚未见报道。本研究通过聚合酶链式反应扩增、克隆到了鸡大肠杆菌MG10株1型菌毛的fimE基因,测定了基因序列,并运用相关软件将其翻译成氨基酸序列。通过对fimE基因序列分析比较及对fimE蛋白进行预测分析,发现鸡大肠杆菌与K12大肠杆菌1型菌毛的fimE基因之间的同源性达到99.1%以上;亲水性、抗原性预测表明,二者之间都存在密切的相似相关性。结果表明,核酸同源性为99.5%。fimE基因的核苷酸序列中有5个核苷酸残基发生了改变,而预测氨基酸序列变化仅第184位氨基酸由缬氨酸V变为丙氨酸A;其余无核苷酸的变化。     

鸡大肠杆菌1型菌毛fimH蛋白结构基因克隆及序列测定

根据已发表的大肠杆菌1型菌毛fimH基因序列,以产1型菌毛菌株MG2(O11)、YR5(O78)、MG12(O18)基因组DNA为模板,对大肠杆菌1型菌毛fimH基因进行扩增并与国外同源菌株基因序列进行比对。结果表明:核酸同源性分别为97.8%、99.7%、97.8%,氨基酸序列的相似性分别达到98.7%、99.3%、98.0%。运用DNA-STAR软件对fimH蛋白抗原决定簇进行预测分析,发现它们的抗原决定簇基本相似,这说明fimH基因序列及氨基酸序列的变异并未对fimH蛋白的抗原结构产生明显影响。     

广西地区仔猪致病性大肠杆菌的菌毛基因多重PCR检测及质粒DNA指纹图谱分析

对广西地区56株仔猪致病性大肠杆菌进行菌毛基因的多重PCR检测及质粒DNA指纹图谱分析。多重PCR检测结果证实该方法可用于各大肠杆菌野生菌株的检测,且适用于仔猪大肠杆菌性腹泻病的快速诊断和流行病学调查。质粒DNA指纹图谱分析发现这56个菌株质粒的获得率为100%,来源相同的菌株具有相同或相似的质粒图谱,来源不同的菌株的质粒图谱一般不同。所有菌株都含有1条大小相同的质粒带,表明广西流行的猪大肠杆菌性腹泻病主要是由携带相同质粒的大肠杆菌引起。试验结果表明,质粒DNA指纹图谱法可作为大肠埃希氏菌分型的分子生物学方法。     

鸭源致病性大肠杆菌的分离鉴定及致病性观察

自湖北省荆州市某鸭场送检病料中分离到一株疑似鸭大肠杆菌,经选择性培养基培养、生化试验、PCR鉴定、动物回归试验、药物敏感性试验,确认为鸭大肠杆菌,该菌对多种抗生素具有耐药性,用已分离鉴定的大肠杆菌经腹腔注射途径感染15日龄雏鸭,致病性试验结果显示,经腹腔注射途径感染雏鸭死亡率达100%,引起纤维素性心包炎、肝被膜炎和气...     

鸡源大肠杆菌与人源大肠杆菌Ⅰ型菌毛蛋白同源性比较

应用DNA-Star分析软件对3个不同血清型鸡源大肠杆菌YR10(O18)、MG10(O11)及GL7(O78)与人源大肠杆菌(pSH2)Ⅰ型菌毛蛋白结构基因(pilA)序列、氨基酸序列、二级结构及抗原决定簇进行了比较分析。结果表明,鸡源与人源大肠杆菌结构基因序列相似性为:GL7(O78)对pSH2为88.9%;YR10(O18)对pSH2为92.3%;MG10(O11)对pSH2为98.3%。氨基酸序列相似性为:GL7(O78)对pSH2为90.2%;YR10(O18)对pSH2为95.1%;MG10(O11)对pSH2为98.9%。可见,3个菌株Ⅰ型菌毛蛋白的二级结构及抗原表位与人源存在较多的相似性。     

大肠杆菌F18菌毛A亚单位基因（fedA）的克隆与序列测定

利用PCR技术，分别从产F18ab菌毛的猪水肿病大肠杆菌分离株G及产F18ac菌毛的大肠杆菌8813株中扩增出510bp左右的F18菌毛A亚单位基因（fedA）。将这2个PCR扩增产物按预测阅读框架克隆入pGEX-6p-1载体的谷胱甘肽S－转移酶（GST）基因的下游，筛选获得阳性重组质粒，并对质粒中的插入序列进行测定。序列分析表明：F18ab与F18ac的fedA基因的核苷酸序列同源性为97.6%，的氨基酸序列同源性为94.7%，两者的主要区别在于F18ac fedA基因的第363bp处比F18ab多3个核苷酸，并出现一个新的酶切位点（NgoMI）。     

大肠杆菌F18菌毛A亚单位基因(fedA)的克隆与序列测定

利用PCR技术 ,分别从产F18ab菌毛的猪水肿病大肠杆菌分离株G及产F18ac菌毛的大肠杆菌 8813株中扩增出 5 10bp左右的F18菌毛A亚单位基因 (fedA)。将这 2个PCR扩增产物按预定阅读框架克隆入pGEX 6p 1载体的谷胱甘肽S 转移酶 (GST)基因的下游 ,筛选获得阳性重组质粒 ,并对质粒中的插入序列进行测定。序列分析表明 :F18ab与F18ac的fedA基因的核苷酸序列同源性为 97.6 % ,推导的氨基酸序列同源性为 94.7% ,两者的主要区别在于F18acfedA基因的第 36 3bp处比F18ab多 3个核苷酸 ,并出现一个新的酶切位点 (NgoMI)     

鸡大肠杆菌1型菌毛疫苗的免疫原性

将由DNA-Star软件分析得到的具有1型菌毛抗原差异性的鸡大肠杆菌M10(O11)、GX7(O78)及YR10(O18)株,分别经营养肉汤37℃、48 h大容量培养后,提取O18菌毛制成单价1型菌毛油乳剂亚单位疫苗,制备O18全菌灭活疫苗及O11、O78、O18多价灭活疫苗。将4周龄SPF鸡分别免疫接种O18菌毛油乳剂疫苗(每雏菌毛免疫量200μg)和O18菌毛菌体灭活疫苗,均隔离饲养至7周龄,进行后胸气囊攻毒。结果表明,未免疫鸡的死亡率为66.67%~88.88%;免疫鸡用同源菌株攻毒死亡率为0;用异源菌株YR17(O2)攻击后死亡率为6.25%~41.17%。另有SPF鸡免疫O11-O78-O18多价菌毛菌体灭活油乳剂疫苗,隔离饲养至7周龄同法攻击,结果显示,免疫鸡用同源混合菌株攻击的死亡率为13.33%,未免疫攻击的死亡率为70.00%;免疫鸡用异源菌株O2攻击的死亡率为3.33%,未免疫鸡为61.53%。表明多价菌毛1型灭活疫苗不仅具有良好的免疫原性,而且具有一定的交叉保护作用。     

鸡大肠杆菌重组1型菌毛疫苗的免疫原性

[目的]制备鸡大肠杆菌重组1型菌毛疫苗,并探索其免疫原性。[方法]从含1型菌毛的基因重组菌株CZYRl0与野生型鸡大肠杆菌分离株YR（018）中提取1型菌毛,制备菌毛油乳剂疫苗。通过对鸡群的攻毒试验,探讨该疫苗的免疫原性。[结果]重组1型菌毛蛋白具有免疫保护作用。重组1型菌毛疫苗的保护力比分离的鸡大肠杆菌1型菌毛疫苗保护率低,但差异不显著（P〉0．05）。[结论]该研究可为鸡大肠杆菌病的免疫防治提供依据。     

鸡大肠杆菌1型菌毛单克隆抗体的研制

将菌毛化的大肠杆菌C600（fim^ ）经0.3%甲醛灭活后作为免疫原，经淋巴细胞杂交瘤技术，用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）筛选获得1F4－1和2C32株抗F1菌毛a或b因子抗原单抗和1株抗F1c因子抗原单抗，它们均为IgG1。免疫印迹试验结果表明：3株单抗均能同禽大肠杆菌1型菌毛反应，识别分子质量为17ku左右的菌毛蛋白。同时对沙门氏菌及猪源大肠杆菌进行检测，结果均无交叉反应性，说明禽病原性大肠杆菌F1菌毛与沙门氏菌1型菌毛及猪大肠杆菌粘附素之间存在很大差异。     

鸭源大肠杆菌3种tet基因的多重PCR检测

利用肉汤稀释法测定21株鸭大肠杆菌对四环素等7种抗茵药物的敏感性,并用多重PCR方法同时检测3种四环素耐药基因(tetA、tetB和tetC).结果显示:所有菌株均呈现tetA、tetB和tetC基因阳性,与药敏试验结果阳性符合率76.67%,携带3种tet基因的临床分离鸭大肠杆茵不仅对四环素类药物耐药,还对头孢噻肟、...     

禽致病性大肠杆菌1型菌毛单克隆抗体的研究及其应用

本试验用提取的禽致病性大肠杆菌1型菌毛免疫BALB/c小鼠,筛选获得2株单克隆抗体;经MSHA试验和Western-blot试验证明,它们是1型菌毛,其凝集价分别为25～26、28～29,ELISA效价分别为103、104～105;对46株带有1型菌毛的禽致病性大肠杆菌优势血清型分离株进行了检测,结果表明该单克隆抗体都与之发生特异性反应。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因克隆与序列分析

为了了解鸭肝炎病毒的遗传变异情况,试验采用RT-PCR方法对采自广东省各地12个DHV临床分离株的VP1基因进行了扩增、克隆、测序和序列分析.结果表明,12个DHV分离株的VP1基因序列长度均为714 bp,编码238个氨基酸,12个分离株与GenBank公布的参考株核苷酸同源性为91.7％～95.8％,氨基酸同源性为94.5％～98.3％,而12个分离株之间的核苷酸序列同源性达到99.2％～100％,氨基酸同源性为97.9％～100％.系统分析证明,12个DHV分离株均为DHV-Ⅰ型,不同分离株VP1基因无碱基插入和缺失,但存在点突变,各DHV分离株间亲缘关系较近,但存在一定的遗传差异.     

肠毒素型大肠杆菌F18菌毛对产蛋鸡免疫的原性

提取猪源肠毒素型大肠杆菌(ETEC)标准株和临床分离株F18菌毛,并制备弗氏佐剂苗,分别免疫产蛋母鸡后用间接ELISA法定期检测母鸡卵黄抗体和血清抗体效价.结果表明:无论标准株还是分离株,F18菌毛对产蛋鸡均具有良好的免疫原性,卵黄抗体效价最高可达1∶25600,血清抗体效价高于卵黄抗体效价,最高可达1∶51200.     

鸡大肠杆菌(O78)1型菌毛单克隆抗体研制及对分离菌株的检测

将菌毛化的鸡大肠杆菌国内分离株GL7(O78)灭活后作为免疫原,经淋巴细胞杂交瘤技术,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选,获得3E1、3H1、4A9和5G4共4株能稳定分泌1型菌毛抗体的杂交瘤细胞,它们均为IgG。免疫印迹试验结果表明:4株单抗均能同鸡大肠杆菌1型菌毛反应,识别分子质量为17~17.5 ku的菌毛蛋白。同时对鸡大肠杆菌表达1型菌毛的分离株进行检测,结果表明同一血清型或不同血清型间的鸡病原性大肠杆菌1型菌毛之间存在差异,O血清型不能完全体现菌株间的遗传相关性。     

不同基因型禽Ⅰ型副粘病毒致病性及全基因组序列分析

为了解当前流行于鸭群的禽Ⅰ型副粘病毒的致病性和分子特征,测定分析了两株病毒对不同动物的致病性、病毒的遗传进化地位及其全基因组序列.结果表明,所分离的两株病毒中,M4毒株与疫苗Ulster株同源性最高,为基因Ⅰ型,基因组全长15186 nt,PX2/03毒株则与近来分离自水禽的FP1/02等高致病分离株的同源性最高,为基...