斑马鱼CYP11a1基因在不同性腺发育时期的表达

采用实时荧光定量PCR技术,分析了斑马鱼Danio rerio的CYP11a1基因在成鱼4个组织和性腺发育3个时期的表达情况。结果表明:CYP11a1基因在卵巢、精巢、肌肉和脑组织中均有表达且存在差异,在脑中表达量最低(P0.05),在卵巢、精巢、肌肉中的表达量分别为脑中表达量的204.7倍、38.9倍、17.0倍;CYP11a1基因在3个卵巢发育时期的表达量表现为先降低后升高的趋势,其在卵巢成熟期的表达量最低(P0.05),在卵巢成熟前期、卵巢成熟后期的表达量分别为卵巢成熟期表达量的1.7倍、1.5倍;CYP11a1基因在3个精巢发育时期的表达量表现为先升高后降低的趋势,在精巢成熟期表达量最高(P0.05),分别为精巢成熟前期、精巢成熟后期表达量的6.5倍、13.4倍。研究表明,尽管CYP11a1基因在卵巢和精巢发育过程中的表达规律不同,但CYP11a1基因在一定程度上与斑马鱼的性腺发育相关,其可能在促进斑马鱼精子成熟中发挥一定作用。     

Cilp基因对斑马鱼肌间骨和脊椎发育的影响

为阐明cilp基因在斑马鱼椎骨和肌间骨发育中的作用,利用CRISPR/Cas9建立了斑马鱼cilp基因敲除纯合突变系（cilp-/-）,对其进行了骨骼表型的观察,并进一步采用qRT-PCR分析了14个骨骼发育相关基因在突变体胚胎发育阶段和成鱼骨骼中的表达水平变化。结果显示,与野生型斑马鱼相比,90 dph（days post hatched）cilp-/-斑马鱼的肌间骨数量显著减少了10.27%（P<0.05）,而肌间骨的长度无明显变化;同时突变体斑马鱼中椎骨发生异常融合及髓棘缺失。qRT-PCR结果显示,与野生型相比,col1a1a、sp7、smad4a和smad5基因在胚胎发育的整个时期都存在显著的差异（P<0.01）;在突变体成鱼尾部骨骼组织中bmp2a、bmp2b、smad5、sp7、runx2a、runx2b和bglap基因的表达量均显著低于野生型,表明cilp基因敲除导致了BMPs和SMADs家族基因的表达水平下降,并下调了下游的成骨细胞发育相关基因的表达量,推测cilp功能缺失可能通过抑制BMPs信号通路,影响成骨细胞分化和骨形成,从而导致了肌间骨数量的减少和脊椎骨异常融合。     

长链非编码RNAs TCONS＿00028652、lnc＿H007和lnc＿H001在斑马鱼胚胎期的时空表达

[目的]长链非编码RNAs(long noncoding RNAs,lncRNAs)近年来受到了越来越多的关注,被认为是重要生物学过程中潜在的关键调控因子,目前已经在斑马鱼胚胎和组织中发现了大量的lncRNAs。然而,这些在成体组织中已发现并鉴定的有差异表达的lncRNAs在胚胎发育时期的时空表达谱仍不清楚,本文研究成体斑马鱼心脏中发现的3个lncRNAs在胚胎发育阶段的时空表达谱。[方法]首先对其编码潜能利用在线软件进行分析,并通过Ensemble、NCBI等网站对其与蛋白编码基因的关系进行分析,然后利用实时荧光定量PCR方法分析了lncRNAs TCONS_00028652、lnc_H001和lnc_H007在斑马鱼胚胎发育阶段以及不同组织的表达水平。为了进一步研究其在斑马鱼胚胎发育过程中表达的空间位置,采用全胚原位杂交技术进行检测。[结果](1)通过在线数据库对其在基因组上的位置与编码基因的关系分析发现,TCONS_00028652属于基因间长链非编码RNA,lnc_H001属于内含子型,而lnc_H007属于反义型长链非编码RNA;(2)通过实时荧光定量PCR检测发现它们在胚胎发育不同时期几乎都有表达,而且在成体组织中,不仅在心脏中有表达,在其它组织也有表达,其中TCONS_00028652在大脑和肝脏中的表达高于其它组织,lnc_H001在大脑中的表达高于其它组织,而lnc_H007则是在心脏中表达高于其它组织。[结论]3种lncRNAs不仅在斑马鱼心脏发育和修复中起作用,而且在其它器官发育和修复以及胚胎发育过程也发挥一定的作用。     

斑马鱼Tph1a蛋白表达、纯化及对脂代谢基因的影响

对斑马鱼色氨酸羟化酶1a(Tph1a)进行原核表达、纯化,探究其在斑马鱼脂代谢中的作用.根据大肠埃希菌的偏爱密码序列,优化斑马鱼tph1a编码区,插入原核表达载体pET-28a,构建融合蛋白表达质粒,并诱导表达、纯化和复性后,腹腔注射斑马鱼,检测其对脂代谢基因表达的影响.结果表明:重组蛋白Tph1a表达形式为包涵体;纯化和复性后的蛋白质具有57 ku的特异性条带;腹腔注射复性蛋白后,高脂组斑马鱼acc、pgc1a基因等表达上调,lpl基因表达下调,且pgc1a基因的表达丰度远高于其他脂代谢基因.这一研究成功构建了原核表达载体pET-28a-tph1a,获得体外高效表达;该蛋白质不仅诱导肥胖斑马鱼的长链脂肪酸合成阻滞,更促进脂肪酸氧化与分解,为探究Tph1a在鱼类脂代谢调控中的功能奠定了基础.     

营养液漂浮育苗棉苗根系适应水生环境的机理研究

【目的】棉花营养液漂浮育苗是一种新型的育苗技术,但棉花根系对水生环境的适应机理尚不清楚。作者从根系的结构、蛋白质组学以及关键基因表达等方面研究棉花根系的适应机理。【方法】以基质育苗为对照,用透射电镜和光学显微镜观察营养液漂浮育苗不同苗期棉苗主根尖的超微与显微结构,以蛋白质双向电泳技术分析营养液漂浮育苗3叶1心期棉苗水生根的蛋白质差异,并用实时荧光定量PCR技术进行营养液漂浮育苗不同苗期棉苗水生根以及3叶1心期棉苗不同部位关键基因即乙醇脱氢酶基因与烯醇酶基因的表达验证。【结果】营养液漂浮育苗棉苗主根中各个时期均出现了通气组织。漂浮育苗的皮层薄壁细胞体积较小。漂浮育苗棉苗主根的韧皮部生长基本正常,而木质部生长出现弱化,其导管直径明显比对照小,导管占中柱的比例也比对照小。1叶1心期,漂浮育苗棉苗主根尖细胞中出现酚类物质。2叶1心期,漂浮育苗的主根尖皮层细胞之间存在明显的细胞间隙。3叶1心期,漂浮育苗的主根尖中出现淀粉粒。4叶1心期,漂浮育苗棉苗的主根尖中出现含晶细胞,同时,细胞中出现明显的质壁分离现象。分析漂浮育苗条件下3叶1心期棉苗的水生根与对照根系蛋白质双向电泳的结果,总计28个差异蛋白被鉴定出来,28个差异蛋白包括20个非冗余蛋白。对这些蛋白进行功能分类,主要涉及新陈代谢、细胞结构、细胞防卫、能量代谢、蛋白质合成、细胞生长等,涉及的主要代谢途径为：糖酵解、乙醇发酵、三羧酸循环等途径。营养液漂浮育苗棉苗水生根中的乙醇脱氢酶2a基因从2叶1心期至5叶1心期与对照相比均有显著差异。水生根中1叶1心期至4叶1心期相对表达量呈上升趋势,4叶1心期至5叶1心期呈急剧下降趋势,在3叶1心期漂浮育苗棉苗水生根中的乙醇脱氢酶2a基因相对表达量与漂浮棉苗茎、叶相比有显著差异。营养液漂浮育苗棉苗水生根中的烯醇酶基因从1叶1心期至4叶1心期的相对表达量比对照均有显著差异,其相对表达量从1叶1心期至5叶1心期呈逐渐下降的趋势,在3叶1心期漂浮育苗棉苗水生根中的烯醇酶基因相对表达量与漂浮棉苗茎、叶相比有显著差异。【结论】在营养液漂浮育苗环境下,棉苗水生根通过根系结构及基因表达的变化来适应水生环境,是棉花对水生环境适应机理。     

斑马鱼不同发育时期血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）基因表达的实时定量PCR分析（摘要）

[目的]探讨血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）基因在斑马鱼不同发育时期的表达。[方法]采用Trizol法分别提取12、24、48、72和96h斑马鱼胚胎和仔鱼总RNA;再使用MMLV反转录酶将其反转录为cDNA;合成的cDNA用实时定量RT-PCR方法检测VEGFR-2基因的表达。实时定量RT-PCR扩增反应结束后,利用熔解曲线对扩增产物进行特异性分析。采用2^-△△Ct法进行数据分析。[结果]VEGFR-2基因表达量在12～72h呈上升趋势,在96h时有所下降。12h相对表达量最低,与其他发育期差异极显著（P〈0.01）,72h相对表达量最高,与12、24和96h差异极显著（P〈0.01）,与48h差异显著（P〈0.05）。[结论]斑马鱼血管发育至72h达成熟阶段,血管发育成熟前,VEGFR-2基因表达水平逐步增长;血管发育成熟后,VEGFR-2基因表达水平下降。     

生长素对猪孤雌激活胚胎体外发育的影响及其受体基因的表达模式

为探明生长素及其受体GHSR-1a在胚胎早期发育中的作用,以猪孤雌激活胚胎为研究对象,在其体外发育过程中添加不同浓度生长素,观察胚胎发育速度和发育效率,并用荧光定量PCR检测猪孤雌激活胚胎早期发育过程中生长素特异性受体基因GHSR-1a的表达。结果显示,相对于对照组,添加10.0 mg/L生长素可以显著提高4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚胚的发育率(P0.05),并能加快4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、桑葚胚的发育速度(P0.05)。GHSR-1a mRNA在2-细胞期到桑葚胚期保持较高表达水平,囊胚期后显著下降(P0.05);免疫荧光染色表明GHSR-1a在猪孤雌激活胚胎各发育时期均有表达,4-细胞期、8-细胞期和桑葚胚期的表达量显著高于囊胚期(P0.05)。推测生长素通过提高GHSR-1a的表达来提高猪孤雌激活胚胎的发育速度和效率。     

Trx及其抑制因子TXNIP基因在发育不同阶段牛体外胚胎中的转录与表达

【目的】研究Trx及其抑制因子TXNIP基因在牛卵母细胞及不同发育阶段体外受精胚胎中的表达变化.【方法】采用实时荧光定量PCR方法,检测牛GV期卵母细胞、MⅡ期卵母细胞、受精卵、2-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎、桑椹胚和囊胚中Trx1、Trx2和TXNIP基因mRNA的相对表达量.【结果】Trx1和Trx2基因在GV期卵母细胞和不同发育阶段的胚胎均有不同程度的表达.GV期卵母细胞Trx1mRNA表达量最高,随着卵母细胞的成熟及受精后胚胎的发育逐渐降低,囊胚期胚胎表达量又急速升高.Trx2基因在受精前的卵母细胞中高表达,受精后表达量逐渐下降,囊胚期胚胎Trx2 mRNA的表达量最低.内源性抑制因子TXNIP基因在2-4细胞胚胎阶段之前都是高表达,从8-16细胞胚胎阶段表达下降,在囊胚期胚胎表达量最低.【结论】牛卵母细胞及附植前胚胎自身的抗氧化能力在发育的不同阶段可能有所不同,而Trx1、Trx2及TXNIP基因在卵母细胞和不同发育阶段胚胎中的表达模式可能起到了重要的调控作用.     

Trx及其抑制因子TcNIP基因在发育不同阶段牛体外胚胎中的转录与表达

[目的]研究Trx及其抑制因子TcNIP基因在牛卵母细胞及不同发育阶段体外受精胚胎中的表达变化.[方法]采用实时荧光定量PCR方法,检测牛GV期卵母细胞、MⅡ期卵母细胞、受精卵、2-4细胞胚胎、8-16细胞胚胎、桑椹胚和囊胚中Trx1、Trx2和TcNIP基因mRNA的相对表达量.[结果]Trx1和Trx2基因在GV期卵母细胞和不同发育阶段的胚胎均有不同程度的表达.GV期卵母细胞Trx1 mRNA表达量最高,随着卵母细胞的成熟及受精后胚胎的发育逐渐降低,囊胚期胚胎表达量又急速升高.Trx2基因在受精前的卵母细胞中高表达,受精后表达量逐渐下降,囊胚期胚胎Trx2 mRNA的表达量最低.内源性抑制因子TcNIP基因在2-4细胞胚胎阶段之前都是高表达,从8-16细胞胚胎阶段表达下降,在囊胚期胚胎表达量最低.[结论]牛卵母细胞及附植前胚胎自身的抗氧化能力在发育的不同阶段可能有所不同,而Trx1、Trx2及TcNIP基因在卵母细胞和不同发育阶段胚胎中的表达模式可能起到了重要的调控作用.     

斑马鱼中snrpc基因的发育时序表达分析

为了深入研究鱼类snrpc基因的作用机制,通过分析斑马鱼snrpc的发育时序表达,来探讨snrpc基因在斑马鱼中的功能机理。从斑马鱼的胚胎中提取RNA,进行反转录、PCR、克隆等,得到snrpc基因在胚胎发育不同时期的表达水平。结果表明,在斑马鱼胚胎发育初期,snrpc表达量较高,随着胚胎的不断发育,snrpc的m RNA表达量有所下降,到后期表达量又上升。因此,snrpc表达量的变化可能预示着snrpc发挥功能的关键时期,对snrpc的克隆和表达分析,为后续进一步研究其相关功能奠定了基础。     

2-甲基异茨醇对斑马鱼氧化磷酸化及免疫相关基因表达的影响

-甲基异茨醇（2-methylisoborneol, 2-MIB）是由多种放线菌土壤生物、蓝细菌等产生的一种挥发性有机物,在水体中广泛存在。2-MIB除了导致鱼类土腥味以外,是否对鱼类造成其它影响尚不得而知。本研究将斑马鱼饲养在2-MIB浓度为42ng/L的水中24h后,进行鳃组织的转录组测序分析,发现2-MIB处理组中有163个基因显著上调,565个基因显著下调。KEGG通路富集显示氧化磷酸化相关的生化过程上调,而免疫相关信号通路发生下调, RT-qPCR进一步显示,2-MIB显著上调氧化磷酸化相关基因ndufb7、mt-cyb、mt-nd4、mt-nd6、mt-co2和mt-atp6的表达,而Toll-like receptor signaling pathway相关免疫基因rela、cd40、ikbkb、mapk8b、mapk3、ripk1l显著下调。超氧化物歧化酶SOD活性在2-MIB暴露后,鳃和肝脏组织中的SOD升高。本研究表明水体中的2-MIB会提高鱼体内活性氧水平,引起细胞损伤,还可能导致相关免疫机能下降。     

omd基因对斑马鱼骨骼矿化的影响

omd基因编码骨调蛋白,可以调控人类骨骼的矿化。目前关于omd基因对鱼类骨骼矿化的作用尚不清楚。为了探究omd基因对鱼类骨骼的影响,调查了omd基因在斑马鱼不同发育阶段和不同组织的表达,并利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功构建斑马鱼omd基因突变体（omd-/-）。结果表明：omd基因在斑马鱼体内随着发育表达量逐渐增加,在脊柱和肌肉中表达较高;相比野生型斑马鱼,omd-/-品系斑马鱼的骨骼形态和尾部肌肉结构未发现明显变化,脊柱的钙含量下调59.81%;与野生型相比,omd-/-纯合敲除品系斑马鱼平均游泳距离下降33.93%,平均游泳速度下降39.44%,相对静止的时间增加88.26%,游泳能力下降。这些结果表明,omd基因缺失影响斑马鱼脊柱的矿化,并在一定程度上影响了斑马鱼的活动能力。     

斑马鱼miR-30e对血细胞生成的作用机制研究

microRNA(简写为miRNA)是一类内源基因编码的单链RNA分子,参与转录后基因的表达调控,在血液生成过程中起着重要作用。为研究miR-30e对鱼类血液生成的作用机制,以斑马鱼Danio rerio作为模式生物,针对青藏高原裂腹鱼血液组织中高表达的miR-30e,利用生物信息软件预测斑马鱼miR-30e的靶基因,构建含斑马鱼ALAS2-3′UTR序列的双荧光素酶报告质粒与斑马鱼miR-30e进行共转染,检测细胞双荧光素酶活性的变化;同时构建含斑马鱼ALAS2-3′UTR序列的绿色荧光蛋白质粒,与miR-30e共同显微注射斑马鱼胚胎,观察GFP荧光强度与蛋白表达量的变化。结果表明:斑马鱼胚胎在注射miR-30e模拟体48 h后,其血红蛋白表达明显减少;转染miR-30e的293T细胞双荧光素酶活性显著降低(P<0.05);斑马鱼胚胎注射miR-30e模拟体24 h后,其GFP荧光强度明显降低,且GFP蛋白表达量明显减少。研究表明,ALAS2基因是miR-30e的一个靶基因,miR-30e通过抑制ALAS2表达而抑制血红细胞的生成。     

烟草叶形突变体的形态特征与关键基因表达差异研究

为分析烟草叶片大小差异的原因,以‘红花大金元’野生型和两个叶片突变体（突变体1、突变体2）为材料,对叶片形态、解剖结构以及叶发育关键基因的表达差异进行研究。结果表明：突变体1的叶长、叶宽、叶面积分别为野生型的61.88%、25.87%、10.12%,比叶重是野生型的1.91倍;突变体2的叶长、叶宽、叶面积分别为野生型的78.82%、106.63%、83.92%,比叶重是野生型的1.35倍。突变体1同一层海绵组织细胞总数为野生型的10.93%,海绵组织细胞体积较野生型减小,叶片厚度显著增加,增幅为23.15%;突变体2同一层海绵组织细胞总数为野生型的48.12%,海绵组织细胞体积与野生型相比增加,叶片厚度显著增加,增幅为18.03%。基因NtARF2-1、NtDA1、NtTOR1、NtARF10-1、NtEBP1、NtGRF8、NtGRF16在突变体1中的表达量与野生型相比差异显著,其中NtEBP1上调表达最显著,上调2.22倍;NtGRF8、NtGRF16下调最显著,表达量分别为野生型的16.06%、13.07%。与野生型相比,NtTOR1、NtTOR2、NtARF10-1、NtEBP1的表达量在突变体2中显著上调,其中NtTOR1表达量上调最显著,上调3.17倍;NtARF2-1、NtARF2-2、NtDA1、NtGRF8、NtGRF16的表达量在突变体2中显著下调, NtGRF8、NtGRF16下调最显著,表达量分别为野生型的13.43%、21.68%。以上结果表明,突变体1与突变体2叶面积的减小与细胞总数的减少密切相关,突变体1、突变体2叶片细胞大小与数目的改变可能与基因NtTOR1、NtEBP1、NtGRF8、NtGRF16表达有关。     

小菜蛾表皮蛋白基因克隆及表达分析

[目的]克隆小菜蛾表皮蛋白基因(Plutella xylostella cuticular protein,PxyICP),分析其序列特征和发育表达模式,为深入研究PxyICP在小菜蛾表皮形成中的生理功能提供科学参考.[方法]以小菜蛾为试验材料,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆PxyICP,以生物信息学方法对其序列特征进行分析,并采用实时荧光定量PCR研究PxyICP mRNA在小菜蛾不同发育时期中的相对表达量.[结果]克隆获得的PxyICP基因开放阅读框长531 bp,编码177个氨基酸,相对分子质量约18.90 kD,等电点为5.32.氨基酸序列分析结果表明,小菜蛾表皮蛋白第1~16位氨基酸是参与跨膜蛋白转移的信号肽,且该序列具有昆虫表皮蛋白CPR家族中RR-1型保守基序的典型特征.不同发育时期的实时荧光定量PCR分析结果表明,PxyICP在小菜蛾各发育时期的表达量不同,其中PxyICP在2、3和4龄幼虫、蛹和成虫中的表达量分别是1龄幼虫的2.43、0.51、0.63、3.19和12.32倍,以在成虫的表达量最高.[结论]成功克隆获得PxyICP基因,根据其发育表达模式推测PxyICP蛋白参与小菜蛾成虫表皮的硬化和黑化等生理过程.     

Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish

In the zebrafish, cells of a clone derived from a single blastomere migrate away from one another during gastrulation. Later in development their descendants are usually found scattered within several different types of tissues of embryo. The divisions and migrations of individual cells were monitored during early development, revealing that in most cases the lineal descendants of single cells present at gastrula stage exclusively populate only single tissues, and may have stereotyped positional relationships within these tissues. Thus the gastrula stage is the first stage when heritable restrictions in cell type might arise in the zebrafish.     

团头鲂形态发育相关基因HoxB1b的克隆及功能研究

脊椎动物Hox族基因是一类重要的生长和发育调控基因,它编码具有螺旋—转角—螺旋结构的转录因子,能与下游靶基因特定区域结合并激活表达,从而调节脊椎动物胚胎发育过程中前后轴的形态建成。利用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了团头鲂(Megalobrama amblycephala) HoxB1b基因的全长cDNA序列,并研究了该基因的表达模式。结果表明：（1）团头鲂HoxB1b基因cDNA全长为1 479 bp,其中包括一个编码306个氨基酸残基的921 bp阅读框,聚类分析结果表明,该基因与斑马鱼、红鳍东方鲀、青鳉的相似度分别为89%、45%、40%,在脊椎动物中具有一定的保守性;（2）RT-PCR分析结果显示,HoxB1b在团头鲂胚胎发育过程的各时期均有稳定表达,但在成熟卵中未检测到该基因的表达,表明该基因属非母源表达类型。进一步的整胚原位杂交结果显示,HoxB1b在团头鲂不同时期胚胎存在明显的空间表达差异,受精后20 h（20 hours post fertilization, 20hpf)胚胎主要在后脑表达,受精后40 h（40hpf)胚胎除了在后脑表达外,在胸鳍也检测到表达;（3）HoxB1b基因在团头鲂成鱼部分组织或器官中有表达,且在雌雄鱼中基因表达量有一定差别。综上所述,团头鲂HoxB1b基因的功能与胚胎前后轴上的后脑和胸鳍发育密切相关,并在团头鲂成鱼相关组织中具有重要生理功能。     

绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶2基因（AlGRK2）的表达分析及在绿盲蝽生长发育中的功能

【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）G蛋白偶联受体激酶2基因（AlGRK2）cDNA序列,明确其时空表达谱,阐明外源蜕皮激素（20E）对AlGRK2表达的影响,分析AlGRK2在绿盲蝽生长发育中的作用,为进一步研究其在蜕皮激素信号转导通路中的功能打下基础。【方法】RACE法克隆获得AlGRK2全长,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析不同日龄绿盲蝽及雌成虫不同组织中AlGRK2的表达谱,分析外源20E诱导及RNAi处理后,AlGRK2 mRNA表达的应答反应及对绿盲蝽生长发育主要参数（发育历期、若虫体重及成虫羽化率）的影响。【结果】AlGRK2 cDNA序列全长2 715 bp,开放阅读框2 106 bp,编码701个氨基酸,ExPASy预测其蛋白分子量为80.2 kD,理论等电点为6.56;蛋白结构分析显示AlGRK2包含4个结构域,即G蛋白信号调节区（RGS,54—175 aa）、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（S-TKc,191—454 aa）、丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶的伸展部分（S-TK-X,455—534 aa）和PH结构域（PH,558—655 aa）,其中PH结构域是GRK2蛋白的典型结构域;系统发育分析结果表明,绿盲蝽GRK2与茶翅蝽GRK2亲缘关系最近;AlGRK2在绿盲蝽1—16日龄虫体内均有表达,mRNA表达量呈现出波动式下降的模式,在绿盲蝽初始龄期的表达量较高,而在末龄期的表达量显著下降;AlGRK2在绿盲蝽雌成虫卵巢和脂肪体中高表达,在胸与足中的表达量较低;外源20E处理后,AlGRK2在绿盲蝽1日龄和3日龄表达量显著下调,AlGRK2在雌成虫各组织中均表达上调,在卵巢及脂肪体中上调幅度最大,相反的是,20E信号通路中PLC抑制剂U73122处理的AlGRK2表达量下调;绿盲蝽若虫发育历期、末龄若虫体重和成虫羽化率均显著下降,相反的是,U73122处理组若虫期的发育历期显著延长;此外,与注射dsGFP处理组相比,注射dsAlGRK2处理后绿盲蝽的AlGRK2表达水平显著下降,若虫死亡率及发育历期显著增加,而成虫羽化率和5龄若虫体重均显著下降。【结论】AlGRK2在绿盲蝽体内的表达谱显示出发育阶段特异性和组织特异性;外源20E抑制剂及RNAi处理后,均可抑制AlGRK2的表达,同时还可对绿盲蝽生长发育产生不利影响,表现为延缓绿盲蝽的发育进度、降低5龄若虫体重及成虫羽化率。     

南极鱼Ⅲ型抗冻基因真核表达质粒的构建及其细胞表达

为了探讨多聚AFPⅢ的作用机制,从南极鱼Lycodichthys dearborni的多聚三型抗冻蛋白基因LD12 cDNA中克隆得到AFPⅢ的四聚体,命名为LD4,并构建真核表达质粒Tol2-actin-LD4-2A-EGFP。将表达质粒转染到斑马鱼细胞系ZF4中,发现LD4可以在ZF4中大量表达并且能够减少斑马鱼细胞在低温胁迫下的死亡率。通过对不同处理温度(28、18、10 ℃)下的WT、EGFP和LD4细胞进行转录组测序分析,找出26个表达差异转录因子,其中I3MB13、ZNF687b等表达上调,JUN、Cremb等表达下调,并且通过荧光定量PCR的验证。通过KEGG pathway分析发现,这些差异性基因主要参与细胞凋亡、细胞周期、增殖等调节通路。采用 Annexin V-PE/7-AAD双染色法对3种不同温度下的WT、EGFP和LD4细胞进行细胞凋亡检测,结果显示,LD4在低温下与对照组相比凋亡率没有显著差异,说明LD4可能是通过其他通路而不是通过抑制细胞凋亡来抵御低温胁迫,这为LD4作用机制的进一步研究提供了理论基础。