LFY基因双T-DNA植物表达载体的构建

LFY基因是从从野生型拟南芥中克隆出的一个与调控花分生组织启动相关的基因,它有促进植物提早开花的作用。用PCR方法从克隆载体上扩增出LFY基因并在两端添加XhoⅠ酶切位点,将其连接在用XhoⅠ切除了hyg基因的pCAMBIA1301表达载体上,得到去除选择标记的LFY基因植物表达载pCAM-BIA1301-LFY。质粒pCAMBIA1301经HindⅡ/EcoRⅠ双酶切补平自连后得到去除多克隆位点的质粒pCAMBIA1301-,再经SacII/SphI双酶切后插入到经SacⅡ酶切的pCAMBIA1301-LFY中。建成双T-DNA植物表达载体pCAMBIA1301-LFY-hyg-,经酶切鉴定证明了所构建载体的正确性。将此双T-DNA载体用农杆菌介导法转化菊花叶片,期望得到无选择标记含LFY基因的转基因菊花。     

DREB基因双T-DNA植物表达载体的构建及验证

W34基因经pGEM-T-EASY载体,克隆到pBDREB载体EcoRI位点,得到在Amp平板上生长的转化子pBW34-DREB质粒;质粒pBW34-DREB、pSPROK、pBlueks分别经Pst I／KpnI、KpnI／EcoRI、PstI／EcoRI双酶切,三片段连接构建成中间表达载体pBWD-Tnos;再用SmaI／EcoRV双酶切pBWD-Tnos。将回收的DREB基因的完整的表达结构元插入到经SmaI酶切的质粒载体pCDMAR-Hyg中,构建成双T-DNA植物表达载体pCDMAR-pWDT-Hyg,大小为13．59kb,经酶切鉴定,证明构建的载体与预期设计的一致。将此双T载体用农杆菌介导法转化玉米胚性愈伤组织,期望得到无选择标记的安全的转基因植物。     

猪α乳清蛋白基因双元载体的构建和转化拟兰芥植物

将人工合成的植物化的猪α乳清蛋白基因编码区克隆到载体中,构建了带有35 S启动子--猪α乳清蛋白基因--终止子表达单元的双元载体,采用农杆菌法对拟兰芥进行植物转化.利用该双元载体上的除草剂抗性基因(Bar基因)为选择性标记进行筛选,获得了一些抗除草剂的转化植株.对转化植株后代植进行猪α乳清蛋白基因的PCR检测,证实外源猪α乳清蛋白基因已整合到植物基因组DNA中.     

抗旱、耐盐基因P5CS植物表达双元载体的构建

以含有P5CS的重组质粒pBIP5CS—F129A为模板,通过PCR的方法获得了目的基因P5CS（1905bp）并将其克隆到pBS—T载体上。利用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ将P5CS基因从克隆载体上消化下来,定向插入到无GUS基因植物表达载体pCHF3的CaMV35S启动子和NOS终止子之间。通过冻融法将此表达载体导入农杆菌LBA4404中,经PCR鉴定表明,P5CS基因植物表达双元载体构建成功。     

葡萄糖氧化酶基因植物表达载体的构建

为进一步开展转基因研究创造条件,用限制性内切酶将葡萄糖氧化酶(GOD)基因从pMD/GO载体上切下,定向连接到植物表达载体pROKⅡ的CaMV35S启动子下游和NOS终止子上游,成功地构建了GOD基因植物表达载体pROK/GO。利用冻融法将此表达载体导入根癌农杆菌LBA4404中,提取转化质粒,经PCR和酶切鉴定表明,GOD基因植物表达双元载体构建成功。     

BNYVV CP基因的克隆及载体构建

以甜菜丛根病根或病叶总RNA为模板，经反转录PCR扩增合成编码BNYVV CP的全长cDNA，将其克隆于pUCm-T载体上，获得了重组质粒pUCm-T／CP。经序列分析，此cDNA为一个567bp长的开放阅读框架，编码由188个氨基酸组成的病毒外壳蛋白。又将CP基因构建到植物双元载体pROKII中。最后通过三亲融合，得到了融合农杆菌LB4404。     

灰飞虱共生菌groEL基因的克隆、生物信息学分析及其植物双元表达载体构建

本研究克隆了江苏南京地区灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallén)体内共生菌Wolbachia的groEL基因全长序列。序列分析表明,其开放阅读框为1659bp,编码552个氨基酸残基,分子量为58.884kD,等电点为5.01。序列比对发现克隆的groEL基因与已登录的groEL基因(登录号:EF468716)起始密码子下游424bp处存在一个核苷酸的差异,与另一groEL基因(登录号:DQ356890)完全一致。利用PROTEIN DATA BANK在线软件对灰飞虱的groEL蛋白立体结构进行预测,结果表明灰飞虱的groEL蛋白为同型寡聚复合物,具有分子伴侣功能。本研究进一步构建了含该groEL基因和潮霉素基因的双元表达载体,为下一步转化水稻奠定了基础。     

PpDREB2基因植物表达载体的构建

以p3301-BI121质粒为基础,通过中间载体pGEX-KG,构建了由CaMV35S启动子调控的PpDREB2基因植物表达载体p3301-BI121-PpDREB2,选择标记为PPT(Phosphinothricin),通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌EHA105, 为通过根癌农杆菌介导法将PpDREB2基因导入植物奠定基础。     

番茄ACC氧化酶基因cDNA的克隆及三种植物表达载体构建

乙烯在植物生长发育过程中发挥着重要的作用.ACC氧化酶是乙烯生物合成途径的限速酶.通过反义基因工程调控ACC氧化酶基因的表达,进而起到调控乙烯的生成是乙烯研究的主要途径.本研究采用RT-PCR方法获得番茄ACC氧化酶基因cDNA序列1 018 bp,构建该基因的正义、反义、RNAi表达载体,通过电转化法导入农杆菌LBA4404中.     

含双边界序列植物双价表达载体的构建

转基因植物的安全性是基因工程改良作物的一个重要问题.构建含双边界序列（双T-DNA区）载体,将选择标记基因和目标外源基因分开在不同的T-DNA区,通过转基因植株有性杂交及后代分离,可在转基因后代中获得无选择标记的转基因安全植株.将2个外源基因置于同一载体上,可以提高其共转化的效率.本研究构建了1个中间载体pAHC17-PTA和1个含双边界序列的植物双价表达载体pDB13PS.pAHC17-PTA含有由Ubiquitin启动子引导的具有抗虫效果的半夏凝集素基因（PTA）.pDB13PS含2个独立的T-DNA区,在其中一个T-DNA区,含两个目的基因的完整的表达盒,一个是由Ubiquitin启动子引导的半夏凝集素基因（PTA）,另一个是由水稻胚乳特异表达启动子（Glutelin-B1 promoter）驱动的马铃薯高赖氨酸蛋白基因的cDNA（SB401）.pDB13PS的成功构建,为提高PTA和SB401的共转化效率和获得无选择标记的转基因后代植株奠定了基础.     

phaC1、phaC2基因双价植物表达载体的构建及其转基因烟草的获得

利用聚合酶链式反应(PCR)技术，从类产碱假单胞菌YSl(Pseudomonas psuedoalcaligenese YSl)染色体DNA中扩增并克隆了调控短链与中链PHA生物合成的两个关键酶基因：phaCl、phaC2基因。同时利用套叠PCR技术对phaCl基因进行了改造，经过基因拼接构建了植物表达载体pC3C1(嵌合phaCl)、pC3C2(嵌合phaC2)和pC3C1C2(嵌合phaCl和phaC2双基因)。将构建好的嵌合phaC1和phaC2双基因的植物高效表达载体pC3C1C2，用冻融法转入根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens EHAl05)并且通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tobacum Honghuadajinyuan)。2个月后获得了一批卡那霉素抗性烟草植株，抗性植株大田生长表型正常，生长速度相对缓慢。抗性植株经过PCR、PCR-Southern、Southern检测初步确定有32％烟草稳定整合了phaCl和phaC2。用氯仿一次氯酸钠直接从部分Southern检测阳性转化植株中抽提纯化得到PHA，在产物合成水平确证有25．6％的转基因植株。     

小麦puroindoline基因高效植物表达载体的构建

籽粒硬度是决定小麦品质优劣的重要性状,控制硬度的主效基因为pinA和pinB(统称为puroindoline基因)。本研究利用含有能促进外源基因高效表达的Ω序列、Kozak序列和poly(A)序列的pG4AB及含有Ubi启动子和筛选基因bar的pAHC25,成功构建了含有puroindoline基因的单子叶植物高效表达载体pUBPa和pUBPb。目的是将来通过转基因植物研究,进一步明确pinA和pinB的功能,为通过基因工程方法快速改良我国现有小麦优良品种的籽粒硬度奠定基础。     

Pina~m-Pinb~m-Gsp~m串联三基因表达载体的构建及其在普通小麦中的转化

籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状之一,主要由5D短臂上的Hardness(Ha)位点的两个主效基因,即Puroindoline a(Pina-D1)和Puroindoline b(Pinb-D1)控制,同时受基因Grain Softness Protein-1(Gsp-1)的影响。本研究以一粒小麦(T.monococcum)DV92作为Pinam、Pinbm和Gspm基因的供体,将三基因各自完整的表达盒串联连接到载体pGEM-TEasy上,构建Pinam-Pinbm-Gspm三基因串联的表达载体。利用基因枪介导的转化方法转化普通小麦科农199幼胚,共轰击5608个小麦幼胚愈伤,经Biolaphos(化学除草剂)筛选,获得933株再生植株,经PCR检测,鉴定出11株阳性植株,有关转基因小麦的籽粒硬度还需进一步实验验证;本实验实现了串联三基因在普通小麦中的遗传转化,为利用基因枪介导的遗传转化方法改善小麦籽粒硬度提供了可行性。     

水稻抗白叶枯病基因及其抗病机理的研究进展

水稻白叶枯病是由Xanthomonasoryzaepv．oryzae致病菌引起的全球性水稻病害。到目前为止,已有26个抗病基因被发现,有10个基因已在染色体上被定位,包括显性基因Xa1、Xa4、Xa21andXa26(t)等和隐性基因Xa5、Xa13等。对大部分抗病基因的抗病机制了解还不是很清楚。利用标记辅助选择(MAS)进行抗病育种是防治白叶枯病的有效途径。在此,综述了已发现的抗水稻白叶枯病基因的种类、分子标记、抗病机制和在抗病育种中的应用。     

适于植物转基因体系优化的绿色荧光蛋白表达载体构建及其瞬时表达验证

在建立和优化植物的转基因体系时,通常期望转化载体同时具有适用植株范围广、尺寸较小、具有多重选择标记或报告基因等优点。为此,通过Gateway技术,构建了含有绿色荧光蛋白基因GFP的植物表达载体pGWB14-GFP,并经PCR鉴定和测序验证了序列的准确性。利用基因枪转化法,将该载体转入洋葱表皮和小麦叶片中,通过荧光显微镜检测,发现绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞和小麦叶片表皮细胞中均能瞬时表达,表明pGWB14-GFP在双子叶和单子叶植物中都能正常发挥功能。本载体在双子叶和单子叶植物植物中都可使用,大小低于17 kb,含有GFP报告基因,具有两套卡那霉素和潮霉素选择标记基因,用于在细菌和植物中筛选,为植物转基因体系的构建和优化提供了功能强大的转化载体。     

本生烟脂质转移蛋白基因克隆及VIGS沉默载体和过量表达载体构建

非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer proteins,nsLTPs)是植物中大量存在的小分子脂类结合蛋白,具有多种生物学功能。为研究nsLTPs在调控植物应答生物与非生物胁迫的反应中起的作用,本研究以本生烟(Nicotiana benthamiana)为材料,成功克隆非特异脂质转移蛋白NbLTP1全长基因,其开放阅读框序列为360 bp,编码119个氨基酸,分子重量为12.44 kD,为疏水性蛋白,等电点为7.45。对NbLTP1蛋白质三级结构进行了预测和分析,并进一步构建了烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的病毒诱导的基因沉默载体TRV:NbLTP1。荧光定量PCR结果表明通过VIGS可以显著抑制NbLTP1基因的表达。此外还通过In-Fusion克隆技术快速成功构建了pCAMBIA1305-NbLTP1-3*HA过量表达载体。本研究为下一步遗传转化、后续研究NbLTP1调控植物防御生物与非生物胁迫的分子机理、培育新种质提供理论依据。