两株表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力

将H9亚型禽流感病毒（AIV）HA基因插入到具有新复制非必需区的通用型质粒载体pP12LS中构建转移载体pP12LSH9A,再分别转染预先感染不同毒力的2种鸡痘病毒（FPV）282E4株和LP株的鸡胚成纤维细胞,经系列蓝斑筛选纯化,获得了2种重组鸡痘病毒（rFPV）,分别命名为rFPV282—12LSH9A和rFPVLP-12LSH9A。将这2株rFPV在SPF鸡和带有高水平抗H9亚型AIV母源抗体的商品鸡上分别进行免疫效力试验。结果：rFPV282—12LSH9A和rFPVLP-12LSH9A在SPF鸡上的排毒保护率均为100％（10／10）,在商品鸡上的排毒保护率分别为88％（23／26）和92％（24／26）。结果表明获得了2株在带有抗H9亚型AIV高水平母源抗体的商品鸡上免疫效力较好的rFPV。     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒在水禽的免疫效力

利用表达 H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒 ( r FPV- HA)和油乳剂全病毒灭活疫苗分别接种商品鹅 ,评价疫苗在水禽的免疫保护作用。结果发现 ,免疫后 2 1 d,r FPV- HA免疫组 HI抗体检测为阴性 ,灭活疫苗免疫组HI抗体阳性率为 70 % ;用 H5亚型禽流感病毒攻击后 ,与阴性对照组相比 ,r FPV - HA免疫组鹅的口腔和泄殖腔排毒率降低 ,病理变化减轻 ,感染鹅易康复 ,保护率为 80 % ,总体保护效力达到灭活疫苗水平。结果表明 r FPV - HA免疫家鹅可诱导良好保护 ,显示出了良好的应用前景     

禽流感重组禽痘病毒疫苗不同途径及剂量接种的免疫效力

将表达禽流感病毒(AIV)H5 HA和N1 NA基因的重组禽痘病毒(rFPV—HA—NA)以不同剂量分别经翅下刺种、肌肉注射、皮下注射、点眼及滴鼻途径接种于4周龄SPF鸡。结果，该疫苗经翅下刺种、肌肉注射和皮下注射途径接种的SPF鸡，能够诱导其产生血凝抑制(HI)抗体；用100LD50的HPAIVA／Goose／Guangalong／1／96(H5N1)毒株攻击后，免疫鸡无一发病和死亡，免疫保护率为100％。以点眼和滴鼻途径免疫的SPF鸡，大剂量接种能够诱导产生一定水平的抗体，攻毒后的保护率分别为83．3％、66．7％；而小剂量接种则不产生免疫反应，保护率为0。表明rFPV—HA—NA疫苗只有经翅下刺种、肌肉注射和皮下注射途径接种，才能够诱导机体产生高水平的免疫力。     

不同NA亚型H5禽流感疫苗在鸭群的免疫效力及母源抗体对免疫效力的影响

研究以H5N2和H5N1两种油乳灭活疫苗免疫鸭群对高致病性禽流感H5N1 AIV的攻毒保护效力进行了比较。结果表明，在同等免疫剂量下，从发病率、死亡率和泄殖腔排毒规律三项指标综合评价来看，H5N1疫苗免疫组对高致病性禽流感H5N1流行株攻毒的保护效率较H5N2免疫组理想，故针对高致病性禽流感H5N1流行的情况，宜采用H5N1禽流感疫苗。水禽禽流感母源抗体对灭活苗免疫具有一定的干扰作用。     

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗系以高度成熟安全的鸡痘病毒为载体研制的新型基因工程禽流感一鸡痘二联疫苗，该疫苗毒株的研制是采用重组DNA技术，将我国H5N1亚型禽流感病毒早期分离株的HA和NA基因同源重组到鸡痘病毒疫苗株的基因组中，构建重组鸡痘病毒(rFPV—HA—NA)，经体外、体内试验表明该重组鸡痘病毒具有良好的免疫原性。同时经细胞连续传代，证实了重组鸡痘病毒具有良好的遗传稳定性，从而进一步保证了该疫苗的免疫原性。     

禽痘病毒感染对禽流感重组禽痘病毒疫苗免疫效力的影响

表达禽流感病毒 (AIV)HA和NA基因的重组禽痘病毒rFPV_HA_NA能够诱导鸡体产生 10 0 %抵抗高致病性禽流感病毒 (HPAIV)H5N1的攻击。而当鸡群已进行禽痘疫苗免疫或者感染了禽痘病毒的情况下 ,此重组疫苗的免疫效力如何 ?首先用禽痘病毒S_FPV_0 17人工感染SPF试验鸡 ,既而在感染后的不同间隔时间接种重组疫苗 ,免疫后检测鸡群的HI抗体水平 ,同时用 10 0LD50 的HPAIVH5N1进行攻击。结果重组疫苗免疫与禽痘病毒人工感染时间间隔在 4周 (或以上 )时 ,预先感染禽痘病毒对重组疫苗的免疫效力不构成影响 ,对禽流感的保护力为 10 0 % ,而间隔时间在 1、2、3周时 ,重组疫苗的免疫保护效力则受到不同程度的影响。     

H7亚型禽流感病毒血凝素基因重组鸡痘病毒活载体疫苗免疫原性评估

本研究以细胞感染-转染技术构建了一株表达H7亚型禽流感病毒(AⅣ)血凝素(HA)基因的重组鸡痘病毒rFPV-HA.以5×105PFU的rFPV-HA经翅下刺种免疫8周龄SPF鸡,免疫后第3周用100 CID5o的HA基因同源AⅣ A/Arfi St/eng-Q/983/79(H7N1)进行人工感染,1周后采集泄殖腔棉拭子进行病毒分离.免疫后第三周及攻毒后第1、2周对所有动物进行静脉采血,检测血凝抑制(HI)抗体和免疫沉淀(AGP)抗体.结果,攻毒前部分rFPV-HA免疫鸡可检测到HI抗体,但检测不到AGP抗体,野生型病毒(F017)接种组和空白对照组HI抗体和AGP抗体均为阴性.攻毒后rFPV-HA免疫组的HI抗体上升速度明显高于野生型病毒接种组和空白对照组.rFPV-HA免疫组有6/8的鸡为流感病毒分离阴性,野生型病毒接种组和空白对照组的试验鸡病毒分离全部为阳性.结果表明rFPV-HA可诱导鸡产生有效的免疫保护反应,阻止或降低消化道病毒排泄.rFPV-HA的成功构建为研制开发H7亚型禽流感活载体疫苗奠定了良好的基础.     

H5亚型高致病性禽流感疫苗的免疫效力

利用表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)的重组鸡痘病毒(rFPV-HA)和全病毒灭活疫苗免疫商品鸡，比较两种疫苗的保护效力。结果发现，利用10^3PFU和10^6PFU的rFPV-HA免疫无母源抗体商品鸡和含母源抗体商品鸡，HI抗体应答水平均低于灭活疫苗免疫组。利用H5亚型禽流感病毒经肌肉注射攻毒后，rFPV-HA免疫的无母源抗体商品鸡获得了完全保护(100％)，高于灭活疫苗保护率(94.7％)；但rFPV-HA免疫含母源抗体商品鸡诱导的保护率(11.4％～15.8％)低于灭活疫苗免疫组的保护水平(68.4％)。结果表明，rFPV-HA诱导HI抗体的能力低于灭活疫苗；但rFPV-HA免疫无母源抗体商品鸡的保护率完全达到灭活疫苗保护水平，显示出了良好的应用前景；灭活疫苗和rFPV-HA均受到母源抗体的干扰，不适于在母源抗体处于高峰期时使用。     

3株表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒的免疫效力比较

作者旨在探讨鸡痘病毒ORF073或ORF214基因缺失后,在母源抗体存在情况下对重组病毒免疫效力的影响。将构建好的在ORF073或ORF214基因插入H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-△73LRH5A、rFPVLP-△214LRH5A)及单表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒(rFPVLP-12LSH5A)分别免疫SPF鸡和商品鸡,检测重组疫苗诱导的免疫效力。结果:3种重组鸡痘病毒在SPF鸡产生较高的HI抗体效价及100%的免疫保护;在HI母源抗体效价为2.45的商品鸡体内基因缺失株重组病毒比rFPVLP-12LSH5A易于清除,抗体上升缓慢而且免疫28 d后HI抗体效价较低,免疫保护率低,分别为16.7%和23.3%;在母源HI抗体效价为0的商品鸡体内基因缺失株重组病毒免疫后产生的抗体效价高,免疫28 d后分别达到3.50和3.17。结果表明在商品鸡体内母源抗体影响下,缺失ORF073或ORF214基因的重组鸡痘病毒的免疫效力降低。     

表达H5亚型AIV HA和NA基因重组鸡痘病毒的构建及在高母源抗体商品鸡的免疫效力试验

母源抗体的干扰是重组鸡痘病毒(FPV)活载体基因工程疫苗至今未能得到推广应用的主要原因,本试验使用FPV新的复制非必需区构建的载体pP12-18构建在高母源抗体商品鸡具有较高免疫力的基因工程疫苗.将H5亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因和神经氨酸酶(NA)基因定向插入鸡痘病毒转移载体pP12-18中,H5A和NA基因的启动子分别为PS和PE/L,获得用不同的启动子启动不同的外源基因且两基因盒方向为背向串联的重组转移载体p12LSH5HANA.将p12LSH5HANA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中.p12LSH5HANA与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV-12LSH5HANA.通过在含X-Gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑,获得纯化的重组病毒.经传代证实该重组病毒具有良好的遗传稳定性.用105PFU的rFPV-12LSH5HANA免疫无特定病原体(SPF)鸡,能激发机体产生有效的血凝抑制(HI)抗体.初步的动物试验表明,该重组病毒能使经滴鼻点眼攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为100%.在高母源抗体的商品鸡上,rFPV-12LSH5HANA与原有载体构建的重组疫苗rF-PV-11SH5HANA的免疫效力有显著差异,保护率分别为81.4%和45.4%.结果表明,选择FPV合适的复制非必需区构建载体是提高重组FPV在高母源抗体商品鸡免疫效力的有效策略之一.     

鸡痘母源抗体对重组鸡痘疫苗免疫效果的影响

为了检测抗鸡痘病毒母源抗体对喉气管炎重组鸡痘疫苗的影响,孵化一批来自禽痘病毒高免母鸡的雏鸡,采用ELISA方法检测鸡痘疫苗免疫鸡后代的血清抗体。检测结果表明,雏鸡自孵出2d开始,血清鸡痘病毒抗体水平就开始缓慢下降,到15日龄时下降至临界值,已有部分鸡开始出现抗体阴性反应;到21日龄时,全部被检血清抗体水平均转为阴性。分别于不同日龄对试验雏鸡免疫接种重组鸡痘疫苗,结果只有当鸡体内的鸡痘病毒母源抗体全部为阴性(21日龄)后免疫时才能产生可靠的保护作用,保护率达到80％以上。这说明鸡痘病毒母源抗体对重组鸡痘疫苗的效果有一定的影响,因此重组疫苗合理的首免时间应选择在3周龄以后。     

高效表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及免疫效力试验

将禽流感病毒血凝素 H9A基因克隆入插入载体 p FG11S中 ,通过酶切鉴定获得了正向转移载体 p FG11SHA;将其与禽痘病毒疫苗株 (w FPV)共转染鸡成纤维细胞 (CEF) ,通过蓝白斑筛选纯化得到重组病毒 r FPV- Ps- HA;以间接免疫荧光法证实 HA基因得到了表达。将该病毒经颈部皮下免疫 1日龄 SPF鸡 ,免疫后 15 d以 H9亚型禽流感病毒 F株翅静脉攻毒 ,攻毒后第 5天采集泄殖腔棉拭子样品进行病毒分离。将此重组病毒与以痘苗病毒 P7.5启动子表达相同基因的重组病毒 r FPV- P7.5 - HA作比较 ,结果表明 ,r FPV- Ps- HA相对于 r FPV- P7.5 - HA明显抑制了病毒的排出 ;攻毒后第 2、5、7、9、11天分别对 r FPV- Ps- HA、油乳剂灭活苗免疫鸡进行泄殖腔、气管排毒规律的检测 ,发现疫苗组均能很好地抑制排毒 ,攻毒对照组泄殖腔的排毒率明显高于气管排毒率     

共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒免疫抗体消长规律及免疫效力研究

为评价共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒(rFPV-AIH5AIL6)的免疫抗体消长规律及免疫效力,将重组病毒通过颈部皮下注射和翅部皮下注射2种不同的免疫途径来免疫鸡群,结果发现,2种免疫途径中,重组鸡痘病毒对鸡体质量增加均无影响,而野生型鸡痘病毒均可抑制鸡体质量增加。翅部皮下注射疫苗组能够产生较高的血凝抑制(HI)抗体水平,免疫21d后抗体水平达到高峰,28d后开始下降,49d时仍保持在一定的水平。免疫SPF鸡21d后攻毒,表明该重组病毒能使经滴鼻攻毒的SPF鸡抵抗H5亚型AIV的致死性攻击,保护率为95%,与油苗组相同,与单表达H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒组(40%)差异显著;攻毒后3、5、7d采集喉头、泄殖腔棉拭子检测排毒情况,结果发现第3天排毒率最高,其中rFPV-AIH5AIL6免疫组排毒率为最低,显示IL-6在rFPV-AIH5IL6免疫过程中起到了免疫佐剂的作用,这为研制新型的禽流感重组鸡痘病毒疫苗奠定了基础。     

禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达

为克服禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)仅诱导机体产生亚型特异性免疫应答的不足,本研究拟将病毒核蛋白(NP)基因与HA基因在重组禽痘病毒中实现共表达。首先构建转移载体,从测序质粒pUCNP中切下目的基因克隆到载体pSY538早晚期启动子LP2EP2的下游,再将含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2的NP基因片段亚克隆到已有的AIVHA基因重组禽痘病毒转移载体中,即得到同时含有HA和NP两种基因的重组转移载体pSY(HA NP)。将转移载体脂质体转染已感染禽痘病毒亲本株S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞。根据报告基因β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达,蓝白斑法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及West-ern-blot分析,结果表明所获得的重组病毒能高效表达AIVHA及NP两种蛋白。此研究为进一步研制更为有效的禽流感基因工程活病毒载体疫苗奠定了基础。     

共表达H5亚型AIV HA 基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒的构建

以鸡痘病毒(FPV)疫苗株为载体,将H5亚型AIV血凝素基因(HA)和鸡白细胞介素18(IL-18)基因分别插入到鸡痘病毒表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子(ATI-P7.5×20)和单一启动子(P7.5)下游,构建了携带AIV HA基因和鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-H5HA-IL18.将H5亚型AIV HA基因插入到鸡痘病毒表达载体pUTA2复合启动子(ATI-P7.5×20)下游构建了携带H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTA2-H5HA.应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株鸡痘病毒共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在BrdU药物加压下进行3次蚀斑筛选.以不同代次细胞的mRNA为模板,利用H5亚型AIV HA基因和鸡IL-18基因特异引物进行RT-PCR和蛋白印迹检测,筛选出能共表达H5亚型AIV HA基因与鸡IL-18基因和单独表达H5亚型AIV HA基因的重组鸡痘病毒rFPV-H5HA-IL18和rFPV-H5HA,这些重组鸡痘病毒的构建为AIV活载体疫苗的研制奠定了基础.     

H5亚型禽流感疫苗变异候选株的构建

本文就2008年在江苏某鸡场分离到的一株发生抗原变异的H5N1亚型禽流感病毒A/chicken/Huadong/4/2008(wt-DT株)开展如下研究:利用反向遗传技术,删除wt-DT株病毒血凝素(HA)基因多碱性氨基酸序列,使之成为低致病特征,再与wt-DT株的神经氨酸酶(NA)基因组合,结合鸡胚高产病毒PR8株的6个内部片段骨架,构建针对此种变异H5亚型禽流感的疫苗株,结果成功拯救出重组病毒rH5N1/PR8.病毒在鸡胚和MDCK细胞上均具有较好的繁殖能力,相对于wt-DT株,rH5N1/PR8在MDCK细胞上的繁殖能力明显提高.rH5N1/PR8对SPF鸡和鸡胚无致病性,在鸡体内的免疫保护效果良好,符合疫苗候选株的标准.     

H7亚型禽流感病毒灭活疫苗的研制及其免疫效果研究

以H7N3亚型禽流感病毒接种鸡胚,收取鸡胚液为抗原研制禽流感病毒灭活疫苗,并对制苗抗原以及疫苗的物理性状、安全性、免疫效力、免疫剂量和保护期等进行了试验,结果表明,该灭活疫苗安全性好,对28日龄鸡的最佳免疫剂量为0.5 mL/只,抗体临界保护值为5log2,免疫后6周HI效价达到高峰值9.4log2,以后逐渐下降,第20周抗体仍能维持较高水平。此外,交叉免疫保护试验表明,同一亚型之间具有良好的免疫保护作用,而亚型间缺乏坚强的交叉保护作用。