一株产紫杉醇云南红豆杉内生真菌分离和筛选

紫杉醇是临床上所用的非常重要的天然抗癌药物.从云南丽江塔城地区分离的云南红豆杉中采用无菌技术分离得到110株内生真菌,经过PDA液体培养基发酵后用TLC、紫外分光光度法、HPLC、质谱等方法检测,发现其中有1株的胞外分泌物中含有紫杉醇,标记为G7-B1.经过形态学鉴别,属于拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis sp.),紫杉醇产率为360.75 μg/L.该种菌具有进一步研究的价值.     

东北红豆杉内生真菌的多样性

自东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb．et Zucc．)根、茎、叶中分离获得78种内生真菌,经形态学和ITS分析,确认分别属于子囊茵亚门的3个属和半知茵亚门的23个属,表明东北红豆杉内生真菌具有丰富的物种多样性,其中有4个菌种能产紫杉醇。     

两株东北红豆杉内生真菌的生理特性

采用接种法,对两株东北红豆杉内生真菌散囊菌（Eurotium sp.,1001)和曲霉（Aspergillus sp.,1003)在不同温度、pH、碳源、氮源、培养基及糖质量浓度下进行了生理实验研究。结果表明：温度对两种菌株的生长和孢子的产生具有明显的影响;pH6－7时菌株生长良好,且可以保持较高的菌液质量浓度;两种菌株均以蔗糖为主要碳源,菌丝干质量与培养基质量浓度呈正向关系。     

番茄内生真菌的分离和拮抗生防菌的筛选

采用内生菌常规分离法对健康番茄植株体内的内生真菌进行了分离和筛选。结果表明: 番茄的不同品种不同部位内生真菌的数量有所不同, 同一品种茎部比根部种类多。经初步鉴定, 除1种属于子囊菌外, 其余均为半知菌。拮抗结果表明: 无孢菌、曲霉对灰霉和菌核病菌均有较强的抑制作用, 产生明显抑菌带。其它部分菌株对病原菌均有不同程度的抑制作用。无孢菌Fq72菌株培养滤液活性测定结果表明: 其培养滤液对6种病菌均有不同程度的拮抗作用, 尤其对菌核病菌和灰霉病菌抑制率最高, 而且其培养滤液高温处理后活性不丧失, 对病菌仍有较强的拮抗作用, 因此其具有一定的生防潜能。     

中国红豆杉内生真菌的分离鉴定及其产紫杉醇的特性

为筛选出微生物工业化发酵生产紫杉醇类药物的优良菌株,采用高效液相色谱(HPLC)及液质联用(HPLC-MS)等方法,对秦巴山区中国红豆杉进行了内生真菌的分离鉴定及其紫杉醇含量测定。结果表明:分离到1株内生真菌(H-21),为极细孢枝孢霉(Cladosporium tenuissimum);其代谢产物中存在紫杉醇,含量为163.5μg/L。     

两种近缘植物内生真菌的分离鉴定及次生代谢物的初步研究

自贵州扎佐地区同一生境中采集近缘植物篦子三尖杉与南方红豆杉的枝叶,从中分离获得内生真菌58株。采用形态学和ITS-5.8S rDNA分子系统发育分析,确认所获内生真菌分别属于8目、9科、9属。经薄层层析(TLC)初筛与高效液相色谱(HPLC)进一步分析发现,从南方红豆杉中分离到的菌株ZZ-HJ-13可产与紫杉烷类化合物10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ特征相似的物质。     

红豆杉内生菌的分离及抗植物病害活性物质的初步筛选

以云南红豆杉的根、茎、叶为材料,从中分离出内生菌163株,其中细菌91株,真菌48株,放线菌24株;以棉花枯萎、小麦赤霉、番茄叶霉等11种病原真菌作为靶标菌,研究红豆杉内生菌的抗菌活性,筛选出了有较高抗菌活性的3株内生真菌、11株内生细菌和5株内生放线菌。     

月季内生真菌分离及抗黑斑病活性菌株的筛选

[目的]分离并筛选具有抗黑斑病活性的内生真菌。[方法]从陕西省西安、咸阳、宝鸡、渭南4个地点采集各种类型的健康月季品种,从茎和叶组织中分离内生真菌并通过转接2～3次进行纯化,采用改良的打孔法筛选对黑斑病病原菌有拮抗作用的内生真菌。[结果]共分离获得月季内生真菌67株,其中咸阳采集的样品内生菌的定殖率和分离率最高;月季的茎段内生真菌的定殖率和分离率明显高于叶片。从67株内生真菌中筛选出3株具有抗黑斑病活性的内生菌菌株,并且全部来自宝鸡。[结论]为进一步筛选生防真菌的候选菌株及环境友好型真菌生物防治奠定了基础。     

提高红豆杉内生真菌及紫杉醇含量的途径分析

近年来,利用植物内生真菌发酵法生产紫杉醇含量普遍偏低,国内外学者也正在不断探索能够提高内生真菌产紫杉醇产量的途径,分析研究表明,寻找高产菌株、优化发酵条件及研究代谢调控将是提高紫杉醇产量的有效途径。     

云南红豆杉内生菌的分离及拮抗植物病害菌的筛选

[目的]为从与红豆杉共生的内生菌或其代谢物中寻找其他新型防治植物病虫害药物提供基础依据。[方法]以云南红豆杉为试验材料,从其根、茎、叶中分离内生菌;以棉花枯萎病、小麦赤霉病、番茄叶霉病等11种病原真菌作为供试菌株,研究红豆杉内生菌的抗菌活性,从中筛选出有较高抗菌活性的内生菌。[结果]从云南红豆杉根、茎、叶中分离出内生菌152株,其中细菌80株,真菌48株,放线菌24株;从中筛选出了有较高抗菌活性的11株内生细菌、5株内生放线菌和3株内生真菌,分别占分离得到的内生细菌、内生放线菌和内生真菌总数的13．75％、37．50％和20．83％。[结论]云南红豆杉组织内存在丰富的内生菌,不同组织内生菌的数量、种类有一定差异,在具有抑菌活性的菌物中,放线菌占的比例最高。     

东北红豆杉种子休眠机理与解除技术探讨

采用酶联免疫吸附分析法测定了东北红豆杉种子内源激素 (赤霉素、脱落酸、玉米素、吲哚乙酸 )含量 ,并结合形态解剖、变温层积、种子吸水性和种皮透气性等试验 ,探讨了东北红豆杉种子的休眠机理及解除休眠的技术 .秋季采收的东北红豆杉种子 ,虽然种胚结构完整 ,但体积小 ,不具备萌发能力 ,需要后熟 .风干种子形成大量脱落酸(ABA) ,种皮角质化、坚硬 ,阻碍了水气交换 ,幼小种胚被迫进入深度休眠状态 .解除休眠的技术是 ,机械磨损种皮 ,可通气、透水和减少萌发障碍 .流水冲洗 1周 ,将种子内的ABA含量降低到可以萌发的程度 .用赤霉素或赤霉素与细胞分裂素混合处理种子 ,可提前萌发 ,提高发芽率 .变温 (15～ 2 0℃ 3～ 5℃ )层积 ,可缩短种子休眠时间 ,层积前期暖温可加速胚的发育 ,低温是萌发成苗的必要条件 .经过 4～ 6个月暖温和 3～ 4个月低温层积 ,种子萌发     

中国境内东北红豆杉天然群体紫杉醇含量变异规律

利用高效液相色谱仪（HPLC）检测了中国境内东北红豆杉天然群体和同一群体内不同单株的紫杉醇含量,以及不同树龄或不同季节的紫杉醇含量变化。 结果表明,不同群体之间紫杉醇含量存在显著差异,群体间差异高达2.7倍; 群体内个体间紫杉醇含量的变异与群体间相当,同一群体（汪清）内不同单株之间紫杉醇含量差异高达4.3倍. 说明紫杉醇含量变异来自于群体间和群体内,其变异组成是群体间为84.6%,个体间为15.0%, 并且东北红豆杉紫杉醇含量的广义遗传力(H[[sup]]2[[/sup]])为82%。 因此,群体选择或单株选择可望获得较大的遗传增益。 同时,紫杉醇含量随着树龄的增大而升高;在生长旺季植株内紫杉醇含量较低,进入休眠期含量较高。 紫杉醇含量与生长量、积温、无霜期、降雨呈负相关（－0.646 8、－0.479 6、－0.240 5、－0.119 2）,与针叶长度显著正相关（0.717 7）,与经度和纬度正相关（0.277 8和0.332 1）。 随着纬度升高,生长量降低,紫杉醇含量呈现增加的趋势。      

丽江塔城地区云南红豆杉内生真菌的多样性研究

为了探悉云南红豆杉内生真菌的多样性,研究了云南丽江维西地区云南红豆杉(Taxus yunnanensisCheng et L.K.Fu)内生真菌的种类组成及数量。从云南红豆杉根、茎、叶中分离获得115种内生真菌,经过形态学和ITS分析结果表明,这115种内生真菌分属于21属,其中分布最广的类群是芽枝霉属(19种),其次是黑孢属(17种)和拟茎点霉属(14种),说明云南红豆杉不同部位内生真菌的数量、分布、种群及其组成存在差异,具有丰富的物种多样性。经初步检测,其中有4个菌种能够产生紫杉醇。     

中国红豆杉中产紫杉醇内生真菌的分离与鉴定

为了开发生产紫杉醇的新途径,以中国红豆杉根、茎、叶为试验材料,对其中产紫杉醇的内生真菌进行分离和鉴定。结果表明:从中国红豆杉中共分离出10株内生真菌,在PDA液体培养基中发酵后经薄层层析法检测,出2株能够产生紫杉醇,对产紫杉醇的菌株进行形态学鉴定表明,其中一株为青霉属,另一株为芽枝霉属。     

东北红豆杉种胚形态发育调控技术和育苗研究

以东北红豆杉(Taxus cuspidata Sieb.et Zucc.)果实成熟后的种子为供试材料,通过多因子交叉重复试验对影响东北红豆杉种胚发育的主要因素及其水平进行了探讨,旨在筛选并确定调控东北红豆杉种胚形态发育的主要因素及其适宜水平。结果表明,东北红豆杉种胚发育的调控方法和主要因素及其水平为以饱和碳酸钠溶液浸泡种子20~30 min除油脂后用粗沙去除部分种皮,再用1.80 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、2.20 mg/L赤霉素(GA3)和0.30 mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)混合溶液浸泡36 h,将种子与河沙(1∶3)混合,进行155 d的变温处理,变温幅度和时间:白天温度为(23±2)℃,处理10 h,夜间温度为(15±2)℃,处理14 h,子叶胚完全分化率98.0%,种子发芽率95.0%以上。     

东北矮紫杉组织、细胞培养及其紫杉醇生成的研究

 东北矮紫杉系灌木型东北红豆杉人工栽培品种 ,其株形矮、分枝多、生长快 ,可采收大量红豆杉枝条 ,也是园林常绿观赏树种 ,但其繁殖困难。本研究通过茎段腋芽培养建立了试管苗再生体系 ,为快速繁育红豆杉苗木创造条件。从茎、叶诱导出愈伤组织 ,建立了细胞悬浮培养系 ,为生物反应器生产紫杉醇打下基础。实验中对矮紫杉茎、叶、愈伤组织及细胞悬浮培养物中的有效成分进行薄层层析和高效液相色谱检测 ,发现它们中均有紫杉醇存在 ,而且细胞培养物中的含量高于茎、叶。该研究结果表明 ,东北矮紫杉是理想的解决紫杉醇来源的红豆杉人工栽培品种 ;研究还观察到 PVP是组培中解除培养物褐化的较好抗氧化剂     

东北红豆杉RAPD反应体系的优化

[目的]研究东北红豆杉RAPD反应体系的优化条件。[方法]以东北红豆杉叶片为材料,用改进CTAB法提取DNA,分别从模板DNA浓度、引物浓度、dNTP浓度,Taq DNA聚合酶量及镁离子浓度5个方面对东北红豆杉RAPD扩增效果的影响进行分析。[结果]通过各因子的比较分析,建立了东北红豆杉RAPD优化体系：20μl PCR反应总体积中含模板DNA 10 ng,Mg^2＋2.0 mmol/L,引物15pmolμ/l,dNTPs 0.2 mmol/L,Taq DNA聚合酶1.0 U,10×buffer缓冲液2μl,以双蒸水补充至20μl。[结论]为进一步探索与东北红豆杉性别鉴定相关的研究提供技术支持。     

东北红豆杉抗寒性分析

[目的]分析东北红豆杉在引种地新疆石河子的抗寒性。[方法]通过5个低温处理试验,测定叶片叶绿素含量、丙二醛(MDA)、游离脯氨酸(Pro)、超氧物歧化酶(SOD)活性、质膜透性、可溶性糖(SS)指标。[结果]随着温度降低,东北红豆杉叶片内叶绿素含量和SOD活性依次降低,而质膜透性、Pro、MDA和SS含量递增。[结论]东北红豆杉对-30℃低温具有较好的抗逆性。