鳜脑组织细胞系的建立及其病毒敏感性研究

鱼类细胞是开展鱼类病毒分离鉴定、功能基因分析以及生物制品制备等研究的重要物质基础。鳜(Siniperca chuatsi)是深受养殖者和消费者欢迎的养殖品种。随着鳜鱼养殖产量的逐年增加,其病害问题尤其是病毒病问题也日趋严重,但是,可用于鳜鱼病毒分离和基因功能分析的鳜细胞系缺乏。本研究采用组织块消化法,对来源鳜脑组织的细胞进行原代培养,建立了鳜脑组织细胞系,命名为MFB。MFB细胞在28℃含10%胎牛血清的L-15中已稳定传代超过70次,第25代鳜脑组织细胞的染色体众数为56。采用免疫荧光细胞化学技术(β-tubulin和Neu-N)鉴定MFB细胞的神经元纯度,结果显示,培养的MFB细胞为神经元类细胞。病毒敏感性实验结果显示,鳜蛙虹彩病毒(MFRaIV)、大口黑鲈蛙虹彩病毒(LMBRaIV)和大鲵虹彩病毒(GSIV)均可在MFB细胞中产生典型细胞病变效应,病毒滴度分别为108.68±0.12、108.36±0.15、1010.15±1.85 TCID50/mL。使用脂质体Lipofectamine®2000将pEGFP-N1转入MFB细胞,转染效率可达20%。本研究建立的鳜脑组织细胞系不仅对多种蛙虹彩病毒敏感,而且转染质粒效率较高,为鳜病毒性病原的分离及基因功能研究奠定了前期基础。     

水生态因子与鳜的健康关系

应用计算机技术系统研究鳜健康综合指标与6项水生态因子间的关系.实验自2001年7至10月底,面积4.72hm2(16口).采样时间为上午800-900,每两周1次.水生态因子检测依GB11607-89及GB3838-88要求进行.结果表明,在正常养殖条件下,6项水生态因子中鱼塘的水温、水体pH值的变化不大,而溶解氧、铵氮、磷酸盐以及亚硝酸盐等四项水生态因子变化较大,文中求出6项水生态因子间的线性相关系数,为水生态因子的调控提供依据和帮助.研究结果表明,鳜健康指标与6项水生态因子间的关系模型是非线性,如果采用因素幂为3次的模型,回判准确率达89.6%,剩余标准差为12.1,6项水生态因子对鳜健康指标影响程度排序为PO43->NO2->pH>DO>T>NH4+.文中讨论了不同健康指标分段模型判别准确率,并通过该模型求出鳜健康养殖各水生态因子的最佳范围.     

鳜塘水体生态因子的计算机模式识别法应用

应用计算机模式识别技术研究鳜塘水体中溶氧量与九项生态因子间的相互关系。研究表明 ,不同塘或不同时期其生态因子差异较大。在高维空间中 ,高、低溶氧量两类样品点聚集在不同的区域 ,周界清晰、分类十分成功 ,表明池塘水体溶氧量与水中多项生态因子间存在显著规律性。用模式识别优化技术求得维持稳定的高溶氧状态的 9项生态指标值 ,优化生态因子的溶氧预报值大于 8.4mg/L。水体溶氧量与其它九项因子成多元的二次函数关系 ,其模型复相关系数R =0 .97。对测量点溶氧量的回代准确率为 93.9%。     

杂交鳜与鳜鱼、斑鳜肌肉营养成分和氨基酸含量比较

通过测定鳜鱼、斑鳜和杂交鳜的肌肉营养成分和18种氨基酸含量,结果表明：杂交鳜、斑鳜和鳜鱼的肌肉水分、脂肪、灰分的含量无显著差异（P〉0．05）,杂交鳜与斑鳜的肌肉蛋白质含量无显著差异（P〉0．05）,但均显著高于鳜鱼肌肉的蛋白质含量（P〈0．05）;鳜鱼、斑鳜和杂交鳜的18种氨基酸含量及其组成、18种氨基酸总量（TAA）、人体所需8种必须氨基酸总量（HEAA）及4种呈味氨基酸（天门冬氨孽、谷氨酸、甘氨酸和丙氨酸）的总量（FAA）均无显著差异（（P〉0．05）。     

影响池养鳜健康的关键水生态因子

池塘生态系统是一个动态、多因素、非典型的复杂系统,用单因素统计法难以研究池塘养殖中的生态问题.在16口鳜养殖塘进行试验(总面积为4.7 hm2),每两周采样一次,获取鳜健康指标和pH、铵氮、硝酸盐氮、二氧化碳、总碱度、镁和细菌总数等17项水生态因子的87组监测数据,并对数据进行数理统计,研究探讨用权重因子、偏回归平方和、F检验值和相关系数等统计量优化进入鳜健康模型的因子.在满足一定准确度条件下,优选出用pH、铵氮、硝酸盐氮、二氧化碳、总碱度、镁浓度和细菌总数等7项因子为自变量,利用回归技术,求出它们与鳜健康指标(y)的关系模型为的非线性模型,模型的预报准确率为92.4%.借助所得模型进一步推导出对鳜健康指标影响由大到小的因子是细菌总数、二氧化碳、pH、铵氮,他们的最佳取值范围依次为(13～27)×104 cfu·L-1、小于3 mL·L-1、7.5～8.0、0.5 mL·L-1.     

大眼鳜与翘嘴鳜正反交及其正交子代自交的胚胎发育观察

对大眼鳜(Siniperca kneri)(♀)×翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)(♂)正交F1(DQ)、翘嘴鳜(♀)×大眼鳜(♂)反交F1(QD)、大眼鳜(♀)×翘嘴鳜(♂)正交F1的自交F2(F2)的胚胎发育进行观察, 详细记录了受精卵、分裂期、囊胚期、原肠胚期、胚体形成期、破膜期6个胚胎发育时期的卵径、孵化破膜时间、初孵仔鱼大小以及胚胎发育特征。大眼鳜受精卵卵径为(1.231±0.057) mm, 翘嘴鳜卵径为(1.197±0.052) mm, 显著大于正交F1雌鱼的卵径(1.723±0.0519) mm(P<0.05)。DQ受精卵在水温25.5~27.7℃经过37 h孵化破膜, QD受精卵在水温27.5~28.7℃经过30 h孵化破膜, F2受精卵在21.6~24.1℃经过40 h 57 min孵化破膜。DQ、QD、F2初孵仔鱼大小分别为(4.1±0.4) mm、(4.0±0.2) mm、(3.5±0.2) mm。鳜属鱼类中翘嘴鳜与大眼鳜胚胎发育各时期特征基本一致, 3种杂交鳜胚胎发育特征与其父母本也基本一致。经过比较发现, 其色素的形成与运动有鳜属的特异性: 在胚孔封闭后, 黑色素开始形成并逐渐扩散覆盖整个卵黄囊, 中期黑色素呈现星芒状, 并在油球处有集中现象, 后期色素则逐渐出现在眼和头部。水温21.6~28.7℃时3种杂交鳜的胚胎发育时间都偏向与翘嘴鳜的胚胎发育时间一致, 在水温23~26.5℃时DQ、F2与大眼鳜的胚胎发育时间有较大差别。

     

pH对大眼鳜和翘嘴鳜蛋白酶活性的影响

研究了不同pH值对大眼鳜消化道不同部位蛋白酶活性的影响及在最适pH条件下与翘嘴鳜消化道蛋白酶活力的差异。结果表明,大眼鳜消化道不同部位蛋白酶的活性强弱顺序为:幽门盲囊>胃>前肠>后肠,其最适pH分别是:10.4、2.8、9.5、10.1。翘嘴鳜的胃和幽门盲囊蛋白酶活力明显高于大眼鳜(P<0.01),而肠的蛋白酶活力略低,差异不显著(P>0.05)。     

温度对鳜体表黏液细胞及黏液免疫因子的影响

鱼类体表黏液细胞分泌大量黏液,构成机体防御的第一道防线。为探明不同温度条件(10、20、30℃)对鳜体表黏液细胞类型和黏液免疫因子的影响,以体质量(19.0±3.2)g、体长(11.0±1.5) cm鳜为试验对象,利用阿辛蓝-过碘酸雪夫染色法观察试验开始72 h时3种温度对体表黏液细胞分布与类型变化的影响。结果显示：鳜体表黏液细胞含有4个类型,头部单位面积皮肤所含有的黏液细胞数量最多,躯干部黏液细胞数量次之,尾部数量最少;相较于10℃组,20℃组和30℃组体表Ⅱ型黏液细胞增幅最大,Ⅳ型次之,Ⅰ型呈略减趋势,Ⅲ型变化无规律。于试验开始后第0、36、72 h采集皮肤组织和体表黏液,分别通过实时荧光定量PCR和双抗体夹心酶联免疫法检测皮肤免疫因子IgM、IL-1β、Hepcidin基因表达量变化和体表黏液中酸性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶活性变化,结果显示：IgM、Hepcidin基因表达量均随温度升高而上调,相较于10℃组,20℃组IL-1β基因表达量显著上调,而30℃组表达量下调;30℃组中,酸性磷酸酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶活性显著高于10℃组和20℃组。试验结果表明,环境温度显著影...     

翘嘴鳜、斑鳜和杂交鳜鱼体营养成分和氨基酸、脂肪酸组成的比较分析

为更好地了解杂交鳜及其亲本的鱼体营养状况,比较了翘嘴鳜、斑鳜和杂交鳜的鱼体营养成分及氨基酸、脂肪酸组成。试验结果:杂交鳜的干物质质量分数最高,为31.8 %,灰分质量分数最低,为13.5 %;斑鳜全鱼的蛋白质质量分数最高,为60.8 %;翘嘴鳜的干物质和脂肪质量分数最低,分别为29.4 %、10.8 %。翘嘴鳜和杂交鳜肌肉中的饱和脂肪酸(SFA)、多不饱和脂肪酸(PUFA)以及n-3、n-6系列PUFA质量分数相近,分别约为30 %、29 %、10 %和19 %,且均高于斑鳜。斑鳜肝脏中PUFA及n-3、n-6系列的PUFA则高于翘嘴鳜和杂交鳜。斑鳜肌肉中总氨基酸(TAA)、必需氨基酸(EAA)和非必需氨基酸(NEAA)质量分数最高,分别为80.03 %、39.26 %、40.77 %。杂交鳜肝脏中TAA、EAA和NEAA含量高于翘嘴鳜而低于斑鳜。3种鳜鱼肌肉中呈味氨基酸的含量相近。试验结果表明,杂交鳜总的营养价值较高,属于高经济价值的鱼类。     

大眼鳜和斑鳜消化道组织结构的比较研究

大眼鳜(Siniperca kneri)和斑鳜(Siniperca scherzeri)的标本于2010年3-6月采集于嘉陵江合川段,用组织学方法和H.E染技术比较研究了大眼鳜和斑鳜消化道的组织结构。结果表明:消化道由黏膜、黏膜下层、肌层和浆膜组织所构成,食道上皮主要为复层扁平上皮、单层柱状上皮和少量杯状细胞组成。大眼鳜的消化道较斑鳜的发达,如食道的黏膜下层及杯状细胞、胃黏膜下层的厚度、幽门盲囊绒毛密集程度。两种鱼消化道变化的基本规律为从食道到胃黏膜层和黏膜下层逐渐增厚,从胃到前肠厚度减少。大眼鳜肠前段、中段和后段的杯状细胞密度、肠绒毛上皮的杯状细胞的大小及形态的发达程度都大于斑鳜。同时由于大眼鳜的肠道形态结构较斑鳜发达,以至在物理消化上也较斑鳜强。该研究为大眼鳜和斑鳜的保护和养殖提供一定的理论依据。     

鳜脑神经元的原代培养与鉴定

目前鱼类神经细胞模型极少,物种间的差异性使鳜在细胞水平上的研究具有极大的局限性,为建立一种简单易行的鳜脑神经元细胞模型进一步研究鳜神经系统,本实验取3月龄鳜,联合胶原酶消化法和机械吹打法分离出鳜脑细胞,用含20%FBS的L15培养液制成细胞悬液接种在细胞培养瓶内,于28°C无CO₂培养箱中培养,3 d后更换培养基,待细胞贴壁长满瓶底后进行传代培养;采用Neu-N和β-tubulin免疫荧光细胞化学技术鉴定鳜脑细胞神经元纯度。结果显示,鳜脑细胞分离培养2 d后贴壁状态较好,随着时间延长,贴壁细胞增多,细胞突起相互连接,培养5 d后神经元胞体丰满,细胞数量明显增多,突起相互间形成了明显的神经网络。经Neu-N和β-tubulin免疫荧光细胞化学技术鉴定鳜脑神经元细胞纯度可达95%以上。研究表明,该鳜脑细胞的分离培养方法简单易行,且可获得高纯度的鳜脑神经元细胞。     

鳜视觉和侧线感觉调控捕食行为的动态观察

鳜（Siniperca chuatsi）具有独特的捕食习性。为研究鳜捕食行为相关主要感觉——视觉和侧线感觉调控的捕食行为特征,利用高速摄像与感官抑制技术对鳜的独特捕食行为进行了分析,将实验鳜分为4组：G_C（对照组,视觉与侧线感觉均具备）,G_V（只有视觉）,G_L（只有侧线感觉）和G_DS（视觉、侧线感觉均不具备）4组。对各组鳜投喂饵料鱼,并利用高速摄像技术对单位时间内鳜的捕食行为进行动态观察与分析。结果表明,鳜在捕食行为中表现出5种捕食模式：直接攻击型、跟踪-弹射型、跟踪-偏移型、弹射型、偏移型,其中,直接攻击型、跟踪-弹射型、弹射型捕食模式主要由视觉控制,跟踪-偏移型、偏移型主要由侧线感觉控制。在视觉、侧线感觉均具备时优先利用视觉捕食,捕食行为趋于简化,相反,鳜仅利用侧线感觉捕食时,捕食行为变得复杂而多样;鳜在捕食时所表现出的各种捕食行为模式是其具有独特摄食习性的重要原因。上述研究为解读鳜特殊捕食行为的形成机制提供了重要资料。     

鳜T细胞表面受体CD4分子的克隆与表达分析

克隆了鳜T细胞表面受体CD4分子的cDNA序列并对其在组织/器官的表达进行了分析。鳜CD4分子的cDNA序列全长为2 356 bp,编码469个氨基酸。该CD4分子由4个免疫球蛋白样结构域(V1C1V2C2)构成的胞外区、一个跨膜区和一个包含保守的CXC基序的胞内区组成。系统进化分析表明,鳜CD4分子与同属于鲈形目的鲈CD4分子聚为一支,与鲈的相似性最高(57%),与鲤的相似性较低(34%)。序列比对分析显示,CD4分子胞外区存在多个保守性位点,如:C1结构域中的WTC基序、V2和C2结构域中的N糖基化位点等。同鸟类和哺乳类不同的是,鳜CD4分子在V1结构域中缺少由半胱氨酸(Cys)残基对形成的二硫键,而在V2结构域中存在一个额外的二硫键,这可能会改变CD4分子的空间构象,进而影响到CD4与MHC Ⅱ的结合以及后续的抗原诱导的T细胞活化等。荧光定量PCR分析表明,CD4 mRNA在鳜的胸腺中表达量最高,在脾脏中表达量最低。脂多糖腹腔注射8 h后,CD4 mRNA在鳜的胸腺、脾脏和头肾中都呈显著的上调表达(P<0.05)。     

基于CPB细胞扩增体系的鳜弹状病毒增殖条件的优化

为获知鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)QY株在体外培养细胞中最适增殖条件,以鳜脑细胞系(Chinese perch brain cell line,CPB)为增殖体系,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)技术所测病毒拷贝数为判断指标,比较同步接毒和异步接毒2种接种方式以及病毒接种量、血清浓度等培养条件对病毒增殖的影响,确定SCRV-QY株在CPB细胞中的最适增殖条件。结果显示,单位体积病毒增殖量方面,异步接毒法优于同步接毒法,以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10将病毒接种长满单层的CPB细胞中,28°C吸附1.5 h,用含2%胎牛血清的L15培养液于28°C培养时,病毒增殖量最高,为5.59×10~(10)拷贝/mL;而从单位成本所获病毒量考虑,同步接毒法筛选出的4种增殖条件单位成本所获的病毒产量优于异步接毒法,其中当MOI=0.03、胎牛血清终浓度为6%时,同步接种对数生长中期的CPB细胞,28°C恒温培养70 h后收获病毒液,单位成本所获病毒量最高,为4.88×10~(13)个拷贝/元。综上所述,本研究以病毒增殖量和培养基成本作为考量,优化SCRV-QY株的增殖条件,可为SCRV疫苗低成本、规模化生产提供理论依据。     

鳜胃蛋白酶原A、胃质子泵基因cDNA全长的克隆与细胞表达定位

利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了鳜全长1 322 bp的胃蛋白酶原(pepsinogen,PG)A2 cDNA序列,含1 131 bp的开放阅读框(ORF),共编码376个氨基酸,氨基酸序列包含信号肽、激活肽和胃蛋白酶3部分,胃蛋白酶部分含有2个天冬氨酸活性位点和3个二硫键。鳜胃蛋白酶 A2与A1在序列组成、理化性质、功能位点、空间结构上存在明显差异,表明它们可能具有不同的催化功能。胃质子泵(gastric H⁺/K⁺-ATPase)是胃酸分泌的关键性酶,研究克隆获得了鳜全长3 581 bp和1 669 bp的胃质子泵α、β亚基cDNA序列。序列相似性分析显示,胃质子泵α亚基具有高度保守性,含多个功能位点,而β亚基具有相对可变性。原位杂交(in situ hybridization,ISH)结果显示,鳜PG A1、PG A2和胃质子泵α亚基mRNA均在胃腺的同一类型细胞中表达,该细胞兼有分泌PG和胃酸的功能,鳜胃腺分泌细胞属于泌酸胃酶细胞。     

鳜下丘脑神经元细胞培养

为了建立可行、高效的下丘脑神经元细胞技术,本研究通过分离鳜下丘脑组织,用Ⅰ型胶原酶将组织消化成单细胞悬液,并用完全培养液进行培养,在培养的第3、4、5和6天观察细胞的形态。结果显示,培养第3天时细胞贴壁量少,胞体小并且呈单个分布;在培养第4天,细胞的数量显著增多,且具有典型的神经元的形态,胞体饱满;第5天神经元胞体的融合度进一步增大,突起增长增粗,许多分支互相交错连接而形成密集的神经纤维网络;第6天细胞活性减弱,开始凋亡。使用CCK-8法检测细胞活性,结果显示,在培养第5天,细胞活性最高;采用荧光定量PCR(RT-PCR)法和免疫荧光鉴定法对神经元细胞进行鉴定,经RT-PCR检测发现,培养的下丘脑细胞可以表达神经元特异基因noggin,经免疫荧光鉴定,下丘脑神经元细胞纯度为95.9%。研究表明,通过此培养方法能够获得纯度较高的鳜下丘脑神经元细胞,为进一步在细胞水平研究鳜的摄食与能量代谢相关机理奠定基础。     

肖四海湖五种渔具的鳜渔获结构特征及其对鳜资源的影响

为评估不同渔具对鳜资源的影响,于2007年5月和12月对长江中游浅水湖泊肖四海湖刺网、延绳钓、网簖、电拖网和电捕仪5种渔具捕获的鳜渔获物结构特征进行了调查分析.结果发现,共采集鳜样本359尾,全长分布范围为92 ～600 mm,优势全长集中于251～350 mm;体质量分布范围为10～3 380 g,优势体质量集中于300 ～500 g.种群由5个年龄组构成,2～3龄为优势龄组,占总数的74.6％.刺网、延绳钓和网簖对鳜有较强的捕捞选择性,网目大小为80 mm和100 mm刺网的鳜渔获物中2龄及以上成熟个体占总数的93.3％,个体平均体质量466 g,“标鳜”(0.4 ～0.75 kg)个体占总数量的57.0％;延绳钓捕获的鳜渔获物中2龄及以上成熟个体占总数的86.9％,“标鳜”个体占总数量的43.5％;网簖捕获的鳜渔获物中90％以上为1龄的未成熟个体.电拖网和电捕仪捕获的鳜全长范围明显较大,其渔获物以1龄和2龄个体为主.综合分析表明,刺网适于作为鳜捕捞的主要渔具,延绳钓可以作为一种鳜捕捞的辅助渔具.网簖对鳜补充群体有较大危害,不适于作为鳜的捕捞网具.电拖网和电捕仪均属于违法渔具,对鳜资源危害巨大,应该加大监管力度,严禁使用.     

鄱阳湖翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)的生物学参数及资源量的估算

研究基于鄱阳湖渔业资源调查数据,运用软件FiSAT II对翘嘴鳜的生物学参数及其资源量进行了初步估算。结果显示,鄱阳湖翘嘴鳜体长范围为77-526 mm;体长和体重的关系式为W = 1.888´10-5L3.042(R2=0.951, n=577),von Bertalanffy生长方程的各参数为: 渐进体长L∞ = 551.25 mm,生长系数K = 0.210,理论生长起点年龄t0 = -0.601。总死亡系数Z=1.06/a,自然死亡系数M=0.44/a,捕捞死亡系数F=0.62/a,最适开捕体长为150 mm。鄱阳湖翘嘴鳜开发率E = 0.58,处于资源过度利用状态。鄱阳湖翘嘴鳜的初始资源量估算高达1.92´104 t,最大可持续产量MSY为4384.93 t。鄱阳湖翘嘴鳜群体中补充群体和低龄剩余群体的比例明显增加,低龄化和小型化趋势凸显,资源衰退问题突出,但生长潜力依然存在。应采取降低对鄱阳湖翘嘴鳜繁殖群体的捕捞强度、保护产卵场等积极措施来保护这一珍贵的渔业资源。     

鳜IRAK4基因的克隆、组织表达及病毒感染后表达分析

为了研究鳜IRAK4生物学特性及其在抗病毒免疫应答中的作用,根据鳜转录组数据中筛选出的IRAK4 unigene序列设计引物,利用SMART-RACE技术克隆得到CDS全长为1389 bp的c DNA(命名为Sc IRAK),编码462个氨基酸,含有1个N端死亡结构域和1个保守的中央蛋白激酶结构域。采用荧光定量RT-PCR方法分析了Sc IRAK4在健康鳜各组织中的表达差异及病毒感染后在脾脏中的表达变化,结果显示,健康鳜中Sc IRAK4在肝脏中表达量最大,与其他组织差异显著,而在血液、脑和胃中表达量最低;传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)感染鳜后Sc IRAK4的表达量呈现下调趋势,24 h脾脏中的表达量达到最低,为对照组的45%;而鳜弹状病毒(siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)感染鳜后Sc IRAK4的表达量呈现上调趋势,12 h脾脏中Sc IRAK4的表达量达到最高,为对照组的8.17倍,表明Sc IRAK4在抗ISKNV和SCRV的免疫应答中可能发挥不同的作用。本研究为进一步揭示Sc IRAK4的抗病毒免疫反应机制提供了依据。     

中华鳑鲏皮肤细胞的分离及其细胞系的建立

采用对传统酶消化法稍进行改进建立了中华鳑鲏皮肤细胞的分离方法,获得RSDCs株(系)以便用于后续关于中华鳑鲏体色细胞研究。结果显示,对中华鳑鲏抑菌暂养8~24 h后,0.25%胰酶—EDTA消化处理3~5 min,用手术刀片顺鳞片方向刮除鳞片,在体式显微镜下解剖获得鱼类皮肤,采用IV型胶原酶—胰酶联合消化皮肤获得单细胞;获得的RSDCs于28°C,5%CO_2条件下进行培养,采用血球计数板计数法测定绘制了RSDCs生长曲线;采用RT-PCR的方法检测RSDCs F_0、F_5和F_(10)上皮标记物(Keratin 18和Vinculin A)和内皮标记物(Collagen I)的表达情况。成功分离获得RSDCs细胞株(系);RSDCs以1×10~4个/cm~2接种,倍增时间为30 h左右,呈典型的"S"型,与贴壁细胞的体外增殖行为一致;RT-PCR结果显示,随着传代次数的增加上皮标记物表达呈现下降趋势,而内皮标记物表达呈上升趋势。研究表明,改良的酶消化法能够成功分离获得RSDCs株(系);获得RSDCs体外培养生长曲线呈典型的"S"型,与贴壁细胞的体外增殖行为一致;分离获得RSDCs由上皮细胞和内皮细胞构成,但随着传代次数的增加,上皮细胞所占的比重越来越小。