高效产褐藻胶裂解酶菌株产酶条件优化及降解寡糖结构分析

为筛选高效产褐藻胶裂解酶菌株,以褐藻胶作为唯一碳源,在海星Asteroidea sp.内脏中筛选出一株产胞外褐藻胶裂解酶的菌株AlgX2,并进行了菌株鉴定、产酶条件优化及降解寡糖结构分析。结果表明:经过菌株形态、生理生化及16S rRNA基因鉴定,该菌株属于盐单胞菌属,命名为Cobetia AlgX2;以3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定的菌株酶活性为指标,对褐藻胶裂解酶菌株产酶活性进行正交试验显示,产褐藻胶裂解酶的菌株最适产酶培养基成分为褐藻胶14 g/L、硫酸铵4 g/L、NaCl 30 g/L、初始pH 6.0,优化产酶培养条件为培养温度22℃、接种量2%、装液量50 mL/250 mL、转速150 r/min;在最优产酶培养条件下进行10 L发酵罐产酶试验显示,发酵液酶活力最高为0.176 U/mL;利用粗酶液酶解制备褐藻胶寡糖,并对寡糖进行HPLC色谱检测显示,样品的聚合度为dp2～dp5。研究表明,Cobetia AlgX2菌株可用于扩大发酵生产,产酶效率高且褐藻胶裂解效果显著。     

米曲霉葡聚糖酶基因(AoEGLAI)在毕赤酵母中的表达研究及其酶学特性分析

采用PTDS方法人工合成米曲霉葡聚糖酶基因(AoEGLAI),通过电击将其转化到毕赤酵母中表达,并采用DNS法对重组酶的酶学性质进行分析。结果表明:该酶耐酸但不耐热,最适反应温度为50℃,最适pH为3.0,在30—45℃和pH4—8时内切葡聚糖酶可保持90%以上酶活力,在底物CMC存在时其热稳定性有一定的提高。10 mmol/L的金属离子Cu~(2+)、Ca~(2+)、Zn~+、Gr~(3+)、Fe~(2+)和Fe~(3+)对酶有激活作用,Mn~(2+)对酶则起抑制作用。该酶对胰蛋白酶有一定的抗性,对胃蛋白酶抗性相对较差。     

1株产褐藻胶裂解酶海洋细菌的分离鉴定及其酶学性质

利用以褐藻胶为唯一碳源的培养基分离纯化产褐藻胶裂解酶的海洋细菌,通过形态特征、生理生化和16SrRNA基因鉴定菌株,用紫外法分析纯化酶液的pH、温度作用范围及稳定性等酶学性质.结果表明:从青岛近海分离到1株产褐藻胶裂解酶的菌株QZ-4,革兰阴性杆菌,适宜生长温度和NaCl质量浓度范围分别为15～25℃和15～60g/L;16SrRNA基因序列分析显示,该菌与交替假单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)相似性为97%,GenBank登录号为HM130919;该酶具有同时降解高古罗糖醛酸聚合物和高甘露糖醛酸聚合物的能力,其最适作用pH和温度分别为7.5和40℃,Mg2+、Na+、Fe3+、Mn2+等对酶活力有促进作用,Zn2+有抑制作用,1.0mol/L乙二胺四乙酸可完全抑制其活性;由Lineweaver-Burk(L-B)作图法求得该酶的最大反应速度(Vmax)为0.541U/mL,米氏常数(Km)为0.051mg/mL.     

产低温纤维素酶菌株的分离鉴定及产酶特征研究

自东帕米尔高原布伦口湖群湿地10 cm草甸中分离到一株高酶活低温纤维素酶产生菌BLKC2,经16S rDNA序列鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。BLKC2在10℃低温条件下保持繁殖能力,在20℃,pH 7.0条件下发酵72 h,酶活力达到最大值28.7 U/mL。酶学特性显示,BLKC2分泌的粗酶最适催化温度为30℃,对热敏感,最适反应pH8.0左右,在pH 7.0～9.0的偏碱性环境中酶活力较稳定,Mn~(2+)、Zn~(2+)、Mg~(2+)对酶反应有明显激活作用,而Fe~(3+)、Cu~(2+)则抑制了酶反应。     

金针菇菌糠中木聚糖酶的分离纯化及其酶学性质研究

废弃食用菌栽培料(SMC)中含有一定活性的木聚糖酶,作者以金针菇菌糠为材料,采用盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE C-52离子交换层析等技术,对SMC中的木聚糖酶进行分离和纯化,并进行酶学性质研究。结果表明,该酶经SDS-PAGE电泳鉴定为电泳纯,分子量为37.8 KDa,酶比活力达到946.67 U/mg,纯化倍数为12.74;酶的最适温度和pH分别为50℃和pH 6.0,Fe~(2+)、Zn~(2+)对木聚糖酶有激活作用,Ca~(2+)、Mn~(2+)、K~+有促进作用,Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)有抑制作用,反应动力学参数V_(max)和K_m分别为15.43μg/mL/min、9.61 mg/mL。     

海刺猬消化腺褐藻胶裂解酶的制备及其酶学性质的研究

以海刺猬Glyptocidaris crenularis为原料,利用丙酮沉淀法制备褐藻胶裂解酶,并对其酶学性质进行分析。结果表明:最佳提取条件为原酶液与丙酮体积比为1∶1.4;酶反应的最适温度和pH为30℃和8.5。酶促反应结果表明:此酶的热稳定性及耐酸碱性较强,受多种金属离子的影响;EDTA对酶活力的影响较小。酶促动力学曲线表明,vm ax=5.928 U/mL,Km=9.001 mg/mL。     

重组褐藻胶裂解酶基因工程菌超声波破碎条件研究

褐藻胶裂解酶是制备褐藻胶寡糖的重要工具酶,利用工程菌进行褐藻胶裂解酶基因的克隆与高效表达是提高酶活的主要途径之一。工程酶位于胞内,需采取有效破碎手段获取。对重组褐藻胶裂解酶基因工程菌E.coli TOP10采用超声波破碎,分析了超声波破碎强度、总工作时间、NaCl浓度对菌体破碎程度及酶活力的影响。通过单因素试验和正交试验得出重组大肠杆菌的最佳破碎条件为:菌液浓度40 mg/mL,菌液体积50 mL,超声波工作时间4 s,间歇时间8 s,超声波破碎强度50%,总工作时间6min,NaCl浓度为0.15 mol/L。在该条件下获得褐藻胶裂解酶粗酶液的酶活为21 U/mL。     

三唑磷农药降解酶的定位及酶学性质研究

采用超声波破碎法破碎三唑磷农药降解菌芽孢杆菌TAP-1,研究不同细胞组分对三唑磷农药的降解率,应用液相色谱法研究三唑磷农药降解酶的酶学性质。结果表明,胞外酶、胞间粗酶液和胞内酶对三唑磷的降解率分别为2.8(±0.34)%、12.8(±2.44)%和84.4(±6.71)%。菌株TAP-1降解三唑磷农药的主要活性物质位于降解菌细胞内,属于胞内酶组分。该酶最适作用pH值为6.5~7.0,在pH 5.0~7.5之间,酶活力均能保持在最高酶活力的68%以上。最适反应温度为30℃,在25~40℃温度范围内能保持75%以上的降解活性。不同化学试剂和金属离子对酶活性产生不同的影响。巯基修饰剂、EDTA、Hg~(2+)和Mn~(2+)对酶活性有抑制作用。Mg~(2+)、Co~(2+)和Fe~(3+)对酶活性有促进作用。该降解酶米氏常数(Km)为23.02μmol/L,最大反应速度(Vmax)为0.738μmol/mg·min。     

一株产纤维素酶菌株的筛选及酶学性质

以羧甲基纤维素钠为惟一碳源,从土壤中筛选出一株产纤维素酶的菌株XW-13,其摇瓶培养液的CMC酶活力为15.05 μg/mL,滤纸酶活力为15.13 μg/mL.酶学性质试验表明,该酶的最适反应pH 7.0,在pH 5.0～9.0时有较好的稳定性,酶活力保持60％以上.该酶的最适反应温度为40℃,在温度为20℃时基本稳定,保温2h仍有80％以上的活力.在化合物浓度为0.2 mg/mL.的条件下,NH4+、Na+、Fe2+、K+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+和Li+对酶活力有增进作用,Hg+和Cu2+对酶活力有抑制作用.     

毕赤酵母表达罗氏耶尔森氏菌(Yersinia rohdei)植酸酶和酶学特性研究

按毕赤酵母偏爱密码子,将来自Yersinia rohdei的植酸酶基因(YrAPPA)进行了化学合成,并成功在毕赤酵母GS-115中异源分泌表达,重组植酸酶分泌量能达到72μg/mL。酶学特性研究结果表明:酶比活达到1 500 U/mg,重组植酸酶的最适反应温度和pH分别为55℃和4.5;纯化的重组植酸酶能耐受60℃高温,且pH 3—7.5范围内重组植酸酶有良好的稳定性;Cu~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)对植酸酶活性有抑制作用;重组植酸酶有抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解特性。     

新型植酸酶基因YkAPPAS在毕赤酵母中的表达及其酶学特性分析

根据密码子的偏好性,采用PTDS方法化学合成了一个来源于Yersinia kristesenii的新型植酸酶基因(YkAPPAS),并且作为外分泌蛋白在毕赤酵母GS115中成功表达。重组植酸酶YkAPPAS的蛋白分泌量可达到106.73μg/mL。对重组植酸酶的酶学性质研究表明:该酶的比活力为2 330 U/mg;最适pH为4.5和6.0;最适温度为45℃;100℃处理5 min后其剩余活性为47.55%;90℃处理5 min后其剩余活性为56.75%;在pH 3—12时的活性均在30%以上。Li~+、EDTA对酶活有一定的激活作用;Zn~(2+)、Cu~(2+)对酶活有一定的抑制作用。重组植酸酶还具有良好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的特性。     

块菌菌根土壤产酸性几丁质酶放线菌Streptomyces omiyaensis SCPW03的筛选及其几丁质酶酶学性质研究

【目的】开展具有优良酶学性质的酸性几丁质酶放线菌研究为几丁质原料的高效转化提供重要的微生物资源。【方法】以四川攀枝花地区偏酸性块菌菌根土壤为材料,采用稀释平板法分离筛选、16S rDNA基因鉴定产酸性几丁质酶放线菌,并分析高产菌株的酶学性质。【结果】从分离到的17株降解几丁质放线菌中筛选到8株产酸性几丁质酶菌株,经16S rDNA序列测序分析表明均为链霉菌属(Streptomyces)。对其中的高产菌株Streptomyces omiyaensis SCPW03(30.2 U/mL)进行酶学性质表明,该菌所产酶分子大小约为54 kDa,最适反应温度和pH分别为35℃和4.0;该酶在温度25～35℃、pH 6.0的条件下保温60 min较稳定,酶活力保持在90%以上;酶活性受化学抑制剂EDTA、SDS及β-巯基乙醇和金属离子Cu~(2+)、Zn~(2+)、Ca~(2+)、K~+、Na~+的影响较小,而Fe~(2+)、Mn~(2+)则能够显著促进几丁质酶活性。【结论】研究表明四川攀枝花地区偏酸性块菌菌根土壤中含丰富的产酸性几丁质酶放线菌,菌株S.omiyaensis SCPW03具有高产酸性几丁质酶能力且所产酶具有较多的优良特性。     

Bacillus paralicheniformis左聚糖蔗糖酶基因克隆表达及酶学性质研究

[目的]从耐热菌株中克隆表达左聚糖蔗糖酶基因,以获得热稳定性较好、底物耐受性高的重组酶,为左聚糖蔗糖酶催化机理及生产应用研究提供技术基础.[方法]从市售菌肥中筛选耐热菌株并克隆其左聚糖蔗糖酶基因,以pSE380为载体构建重组质粒并转化至大肠杆菌诱导表达,随后通过镍亲和层析获得电泳纯的重组左聚糖蔗糖酶并研究其酶学性质.[结果]分离到耐热菌株LN-05,经16S rDNA序列分析鉴定为Bacillus paralicheniformis.克隆表达的B.paralicheniformis左聚糖蔗糖酶与已公布地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)RN-01的左聚糖蔗糖酶存在19个氨基酸残基差异.重组酶催化水解反应最适pH为6.0,最适温度为45℃,于40和45℃保温3 h后残余酶活力分别为89%和78%.Mn2+、Ag3+和Cr2+对重组左聚糖蔗糖酶的水解活力有明显抑制作用,Co2+和Al3+对水解活力具有一定促进效果;Ba2+、Mg2+和Mn2+对聚合活力有明显抑制作用,Ag3+、Cu2+和K+对聚合活力具有促进作用.EDTA对重组酶水解活力和聚合活力均具有抑制作用.在最适条件下,重组左聚糖蔗糖酶的最大反应速率(Vmax)=74μmol/(min·mg),米氏常数(Km)为7.57 mmol/L.催化聚合反应的最适温度随着底物蔗糖浓度而变化,当蔗糖浓度为50%时,最适温度为40℃;最适聚合反应pH为5.0;当酶浓度为0.9 U/mL,在最适条件下反应24 h,左聚糖产糖量达183.00±1.73 g/L,蔗糖转化率为(36.76±1.84)%.[结论]B.paralicheniformis左聚糖蔗糖酶的热稳定性较好,左聚糖产量高,具有转化蔗糖生产高附加值左聚糖的应用潜力.     

基因工程菌漆酶降解2-氯苯酚的研究

利用基因工程菌甲醇毕赤酵母(PMAD16/pMET(A-Lcc1)培养产生的重组漆酶,研究了重组漆酶对降解2-氯苯酚的影响。结果表明:重组漆酶对2-氯苯酚降解的最佳pH值为6.0,温度为50℃,当溶液中漆酶活力为1.2 U/mL时,在最适脱色条件下作用6 h,粗漆酶和纯化漆酶对2-氯苯酚(250 mg/L)的降解率分别为91.3%和88.2%,重组漆酶可有效地降解2-氯苯酚。     

产脂肪酶菌株的筛选、鉴定以及酶学性质的研究

【目的】筛选高产脂肪酶菌株并鉴定其种属,研究脂肪酶的酶学性质.【方法】以橄榄油为唯一碳源对富含油污土壤中产脂肪酶微生物进行富集培养,用中性红平板进行初筛,结合改进铜皂分光光度计法测定酶活力;对筛选的高产脂肪酶菌株进行形态学观察和相关生理生化实验,再结合16S rDNA序列分析确定其种属;确定该菌株所产脂肪酶的最适作用温度和pH值,并研究金属离子、有机溶剂以及表面活性剂对酶活的影响.【结果】筛选得到一株高产脂肪酶菌株LZ-5,其所产脂肪酶的酶活力为4.78 U/mL;菌种鉴定为表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis).该酶最适作用温度为40℃,最适pH值为9.0;Ca~(2+)、Mg~(2+)对酶活力有促进作用,Fe~(2+)、Zn~(2+)、EDTA、SDS、甲醇和乙醇对酶活力有抑制作用,对Na~+、K~+、丙三醇的耐受力较高.【结论】成功分离一株表皮葡萄球菌高产脂肪酶菌株.     

重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化及部分酶学性质研究

[目的]研究重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质。[方法]由重组大肠杆菌制备重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵液,经乙醇分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析分离纯化后进行SDS-PAGE纯度鉴定,最后分析纯化后重组酶的酶学性质。[结果]SDS-PAGE分析表明纯化后得到了较纯的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶,比活力达13 437 U/mg,纯化倍数为19.85倍,回收率为20.60%,分子量约30 kDa。纯化后重组酶的最适pH值为6.0,pH值4.5~6.0较稳定;最适温度为50℃,40~50℃较稳定;Cu2+和Fe2+对其活力有显著的抑制作用,Mg2+、Zn2+和Mn2+对其活力有抑制作用,比较适合在啤酒酿造上使用。[结论]该研究为重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的工业化应用奠定了基础。     

海参组织蛋白酶K的部分酶学性质及其对海参自溶的影响

采用特异性荧光底物法检测海参体壁组织蛋白酶K(CTSK)的酶学性质并初步探讨其对海参自溶的影响。结果表明:CTSK的最适pH为5.0,最适温度为50℃,在20~40℃之间酶活力稳定性较好;Zn~(2+)、Fe~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)均对CTSK产生一定抑制作用,抑制率均超过60%;而Ca~(2+)和Mn~(2+)对其活性影响不大,Mg2+可增强该酶活性、CA-074、Z-Leu-Leu-Leu-H(ZLLL)、碘乙酸、E-64、抗痛素、PMSF对CTSK的抑制率均在85%以上,EDTA和1,10-菲啰啉对该酶的抑制率分别为39.7%和16%,而DTT和L-Cys可将该酶活力分别提高至127.46%和238.3%。在海参匀浆物中分别加入特异性抑制剂CA-074和ZLLL,25℃水浴加热使其发生自溶,并通过SDSPAGE检测CTSK对海参蛋白降解的影响。结果显示ZLLL能够在一定程度上抑制海参蛋白的降解。CTSK是一种巯基氨基酸含量较高的半胱氨酸蛋白酶,具有一定的金属离子依赖性,但又易被多种金属离子抑制;CTSK有可能直接参与海参自溶过程中蛋白质的降解。     

碱性脂肪酶产生菌的发酵条件及酶学性质研究

研究1株碱性脂肪酶产生菌L198发酵条件及酶学性质.结果表明,产酶发酵培养基为(;):豆饼粉1.0,玉米浆1.0,葡萄糖1.0,K2HPO4 0.5,NaNO3 0.5.500 mL三角瓶装液50 mL,30℃,180 r/min摇床培养40 h.酶学性质研究:最适反应温度为40℃,最适pH 9.0;在pH 8～10稳定.其热稳定性较好,在20～40℃放置6 h后仍可以保持较好酶活力.金属离子Na+、 K+对酶活有显著激活作用,而Cu2+对酶活有显著抑制作用,而K+、Mg2+、Fe+对酶活有抑制作用.     

一株产α-淀粉酶菌株的分离、鉴定及酶学特性分析

【目的】筛选α-淀粉酶高产菌株,并对其酶学性质进行研究.【方法】从富含淀粉的土壤中筛选出1株高产淀粉酶的菌株,命名为LZ-1.通过观察菌落形态、表征生理生化特性、测定16SrDNA序列及构建系统发育进化树对其进行鉴定.采用硫酸铵盐析、DEAE-52阴离子交换法纯化蛋白,SDS-PAGE检测蛋白相对分子质量.【结果】LZ-1鉴定为土生拉乌尔菌(Raoultella terrigena),所产淀粉酶最大酶活力为40.6U/mL,纯化后的淀粉酶比活力为121.3U/mg,纯化倍数为6.4,回收率为69.3%,相对分子质量为43ku.菌株LZ-1所产淀粉酶最适温度为50℃,在50~70℃其稳定性较高;最适pH值为7.0,在pH 5.0~7.0的条件下稳定性较高;Ca~(2+)、Mg~(2+)、Na~+、K~+对淀粉酶有激活作用;EDTA、Fe~(2+)、Zn~(2+)对淀粉酶有抑制作用.【结论】该菌株所产α-淀粉酶稳定性较高,具有一定的应用前景.     

南极磷虾羧肽酶的分离纯化及酶学性质

南极磷虾生活在极寒环境,其体内特殊的蛋白酶系统是其维持正常新陈代谢的关键因素。羧肽酶是南极磷虾蛋白酶系统中一类主要且关键的蛋白酶,酶学性质研究对其后续基础研究开展及商业利用都具有指导意义。本研究以南极磷虾为原料,采用缓冲液提取、硫酸铵分级盐析,DEAE-琼脂糖凝胶FF阴离子层析和Sephadex G-100凝胶层析,从南极磷虾匀浆液中分离纯化出一种羧肽酶,SDS-PAGE结果显示其分子量为30 ku。酶学性质研究结果显示:该酶最适温度为30℃;最适pH为8.0。热稳定性较差,即使在4℃下保温超过2 h酶活性会急剧下降。金属离子Ni~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)和Mg~(2+)具有激活作用,且激活作用依次增强;而Ca~(2+)、Fe~(3+)和Cu~(2+)起抑制作用,Cu~(2+)抑制效果最明显。对巯基有修饰作用的抑制剂DTT和β-巯基乙醇对其有抑制作用,推测该酶活性中心存在二硫键;金属蛋白酶抑制剂EDTA和1,10-菲罗啉对该酶活性有明显的抑制作用,说明了其具有金属蛋白酶特性;而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该酶抑制作用并不强烈。以脲酰-L-苯丙氨酸为底物溶液,测得该酶K_m为0.005 9 mg/mL、V_(max)为4.909 1 U/min。