副溶血弧菌养殖对虾分离株耐药性及耐药基因分析

文章采用琼脂稀释法检测从养殖患病对虾中分离的36株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)对16种药物的耐药性,并用PCR法检测喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS和qnrVC,酰胺醇类耐药基因cat、optrA、floR和cfr,四环霉素类耐药基因tetA、tetB和tetM,磺胺类耐药基因sul1、sul2和sul3,氨基糖苷类耐药基因strA、strB、aadA和aacA,利福霉素类耐药基因arr,β-内酰胺类耐药基因bla CARB和大环内酯类耐药基因erm的携带状况,分析其耐药表型和基因型之间的相关性。结果显示,36株副溶血弧菌对β-内酰胺类药物氨苄西林耐药率最高(88.9%),其次为磺胺类药物磺胺甲噁唑(66.7%),硫酸新霉素、庆大霉素、头孢曲松和美罗培南呈现100%敏感。多重耐药副溶血弧菌比例高达61.1%(22/36),其中1株对6类抗菌药耐药。喹诺酮类耐药基因qnrVC检出率最高达72.2%(26/36);其次为氨基糖苷类耐药基因srtB,检出率58.3%(21/36);大环内酯类、利福霉素类耐药基因均未检测到。耐药基因检出率与耐药表型没有表现出一一对应的关系,提示副溶血弧菌耐药的复杂性。     

人工培育对虾苗种体内可培养细菌数量及组成分析

采用常规细菌分离、培养与纯化,结合细菌16S rDNA序列分析等方法,调查分析了山东、天津、浙江部分苗种场凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和中国明对虾(Fenneorpenaeus chinensis)苗种体内的可培养细菌总数以及优势菌的种类和数量,并用PCR的方法检测对虾苗种携带病毒情况.结果显示,凡纳滨对虾和中国明对虾苗种体内的可培养细菌总数均在105-107 CFU/g之间,分离出的细菌分属于弧菌属(Vibrio)、发光杆菌属(Photobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、盐单胞菌属(Halomonas)等8个属,其中,弧菌属在对虾苗种体内占绝对优势,达40.0％-90.23％.部分凡纳滨对虾和中国明对虾苗种样品检测为白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,VSSV)和传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)阳性,WSSV检出率为50.0％,IHHNV检出率为37.5％,同时携带两种病毒的检出率为11.11％.只携带WSSV病毒以及同时携带两种病毒的对虾苗种体内的总菌数量在1.23×107-4.14×107 CFU/g之间,显著高于其他批次的样品(P＜0.05),且弧菌数量在107 CFU/g左右,显著高于其他批次的样品(P＜0.05).只携带IHHNV以及不携带病毒的对虾苗种体内的弧菌数量为104-106 CFU/g.研究表明,弧菌属在凡纳滨对虾和中国明对虾苗种体内普遍存在且为优势菌属,携带WSSV可能会引起对虾苗种体内的弧菌数量增长.     

高通量测序法分析两株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响

为分析荚膜红细菌和蜡样芽孢杆菌2株益生菌对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响,本实验对凡纳滨对虾进行为期30 d的养殖饲喂实验,饲喂后期利用高通量测序凡纳滨对虾肠道微生物的16S rDNA V4区,来分析不同益生菌饲喂后凡纳滨对虾肠道菌群的结构特征,并结合对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的宏观指标来进行分析。结果显示：①空白组（CK）、荚膜红细菌组（Rc）和蜡样芽孢杆菌组（Bc）样品OTU范围为374~506,其中CK组对虾肠道菌群OTU数量最低,饲喂益生菌后的2组对虾肠道菌群中OTU数量相对较高;②在门分类水平上,3组的变形菌门数均为最多,CK组主要为变形菌门和少量拟杆菌门,Bc组主要有变形菌门、拟杆菌门、无壁细菌门、厚壁细菌门和假单胞菌,Rc组主要是变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、酸杆菌门、放线细菌、梭杆菌门和蓝细菌;③稀释曲线和Shannon指数结果可见,CK组样品物种丰度和复杂度最低,且Bc组样品丰度和复杂度相对较高;④PCA分析发现,Rc组和CK组样品微生物组成较为接近,结合宏观对虾体质量增加率和攻毒后累计死亡率的结果分析,可见相较于荚膜红细菌,蜡样芽孢杆菌对凡纳滨对虾肠道微生物菌群影响更显著,且益生效果更佳。研究表明,饲喂益生菌可以扩增对虾肠道微生物菌群丰度,并能抑制弧菌属等有害菌群的生长,提高对虾体质量增加率并降低死亡率,从而达到益生效果,其中以饲喂蜡样芽孢杆菌菌株效果更佳。     

一株致病性溶藻弧菌的多重耐药与毒力基因分子分析

从发病的凡纳滨对虾中分离并经鉴定得到一株溶藻弧菌(命名为:V_A-76),通过对虾回感实验和药物敏感性实验分别对V_A-76菌株的耐药表型和致病能力进行了研究,并运用PCR方法检测了该菌的毒力相关基因、整合子和耐药基因的携带情况。对虾感染实验结果表明,溶藻弧菌V_A-76能够导致凡纳滨对虾发病死亡。经PCR检测发现,该菌携带8种毒力相关基因:tdh、tlh、tox S、collagenase、fla A、omp W、asp A和fur。药敏结果显示,V_A-76对环丙沙星、氯霉素、链霉素、红霉素、磺胺甲噁唑、复方新诺明和利福平7种药物表现出较高的耐药水平,且该菌包含1类整合子、4类超级整合子SXT和1型插入序列共同区(ISCR1)。此外,该菌携带arr-2、dfr A27、str A、str B、floR、cat和qnrv C耐药相关基因。从上述研究结果可知,菌株V_A-76既具有一定的感染能力,同时对多种抗菌药物表现出较高的耐药水平,提示应对养殖源致病性弧菌的耐药性现状予以更多的关注。     

凡纳滨对虾中发光坎氏弧菌的分离、鉴定及致病性

为研究凡纳滨对虾死亡的致病机理,实验采用TCBS培养基从濒死凡纳滨对虾肝胰腺分离到浅绿色、直径3～7 mm的发荧光菌落;革兰氏染色为阴性短杆菌;经API 20E鉴定,分离株PvL-1与坎氏弧菌参考菌株CAIM249相似度为90％;fitZ序列与坎氏弧菌CP020076相似度为99.31％;gapA序列与坎氏弧菌EF59...     

4株凡纳滨对虾肠道益生菌分离、鉴定及应用研究

为将凡纳滨对虾肠道分离的益生菌用于对虾的养殖,利用乳酸菌培养基分离对虾肠道中的益生菌并对菌株进行初步分类鉴定,利用体外抑菌方法筛选有抗菌活性的菌株,用于考察对虾实验室养殖过程中抗有关致病菌的效果。试验结果显示,自虾肠道分离得到W7、W25、W27、W31菌株,分别属于啤酒酵母、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌沙漠亚种和暹罗芽孢杆菌,它们对致病菌副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有一定的抗菌活性,其中暹罗芽孢杆菌W31抗菌效果最好。将啤酒酵母W7和暹罗芽孢杆菌W31菌体与饲料混合用于对虾的养殖,能够明显增强凡纳滨对虾抵抗弧菌侵染的能力,提高存活率。     

健康和患病凡纳滨对虾幼虾消化道菌群结构的比较

凡纳滨对虾养殖过程中,早期阶段是病害易感阶段,而消化道菌群结构与对虾健康关系密切。因此,探讨幼虾的消化道菌群尤其是弧菌类细菌与对虾发病的关系对病害有效防治具有重要意义。本实验采用Illumina测序研究了凡纳滨对虾健康和患病幼虾的消化道细菌群落结构,并基于纯培养和16S r DNA,rec A和pyr H基因序列比对,分析了幼虾消化道中弧菌的主要种类组成。结果发现,健康幼虾消化道中α-变形菌纲和厚壁菌门丰度较高,而患病幼虾中γ-变形菌纲、拟杆菌门、放线菌门和β-变形菌纲较高,其中放线菌门丰度差异显著。基于科水平的响应比分析,发现患病幼虾消化道中动性球菌科和噬菌弧菌科的丰度显著降低,而弧菌科的丰度显著升高。相似度分析发现,驱动群落变异的OTU主要来源于弧菌属、海洋杆状菌属、冷杆菌属、假交替单胞菌属以及未分类至属的红杆菌科和微杆菌科。健康幼虾消化道弧菌组成以锡那罗亚州弧菌为主,而患病幼虾消化道弧菌组成以坎氏弧菌为主。尽管健康和患病幼虾消化道内细菌群落结构整体差异不显著,但一些重要类群丰度变化显著,其特征与已知的生态功能一致。     

凡纳滨对虾细菌性红体病病原的分子特征与耐药性

为探明引起凡纳滨对虾细菌性红体病的病原,从病虾肝胰脏分离得到10株优势菌,经回归感染实验证实其为引起此次红体病的病原菌.Vitek与16S rRNA序列分析显示,分离株均为副溶血弧菌.基于dnaE-gyrB-recA-dtdS-pntA-pyrC-tnaA的多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)表明,这些菌株形成3个新序列型(ST),其中1株为ST413,7株为ST414,2株为ST415;ST413包含新等位基因型recA-166与tnaA-121,ST414则含有新等位基因型gyrB-219.MLST结果提示,这些副溶血弧菌分离株并非来自单一克隆,呈现出一定水平的分子多样性.但这些菌株均含有大流行群(PG)的分子标记toxRS与VPA1168,并具有相同的毒力基因构成(tlh+ tdhtrh-T3SS1+T3SS2-)与耐药谱,其tdh与trh的缺失并未影响细菌对凡纳滨对虾的致病力.综上所述,引起此次凡纳滨对虾红体病的10株副溶血弧菌可能为PG的不同变异株.     

凡纳滨对虾肠道铁载体高产菌株筛选与饲料添加应用效果的研究

本研究筛选了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道铁载体高产菌株,并探究了饲料中添加铁载体高产菌株对凡纳滨对虾的生理功效。结果显示,从凡纳滨对虾肠道中筛选出一株铁载体产量高达74.87%的菌株SDVGH3,经鉴定属于泛菌属(Pantoea sp.),产生的铁载体属于异羟肟酸型,该菌株无溶血性,对大部分抗生素敏感;优化了该菌株铁载体产量的培养条件：最适温度为28℃,pH为7.5,盐度为0,装液量为10 mL,Fe3+浓度为0.01 mmol/L;采用滤纸片扩散法检测了菌株抑制病原菌的特性,显示能抑制5种凡纳滨对虾致病菌。通过在饲料中添加SDVGH3菌液,凡纳滨对虾增重率和饲料利用率明显升高,血细胞数量、吞噬率和血浆酚氧化酶、抗菌活性均有不同程度的升高,副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)攻毒后,实验组的死亡率显著低于对照组,1010 CFU/g实验组的死亡率最低,为61.4%;添加107 CFU/g SDVGH3菌液处理组,凡纳滨对虾肠道菌群多样性显著提高,弧菌属(Vibrio sp.)在肠道菌群中所占比例明显下降。研究表明,铁载体高产菌株SDVGH3能明显促进凡纳滨对虾生长、免疫防御能力,增强肠道菌群健康,具有应用于水产养殖中的潜力。     

健康与患病凡纳滨对虾肠道菌群结构及功能差异研究

为探究病害发生后健康与患病凡纳滨对虾肠道菌群结构和功能的差异,并筛选肠道指示菌群来评估宿主健康状况,评价凡纳滨对虾肠道菌落的功能冗余性。实验采集健康和患病凡纳滨对虾样品,通过Illumina高通量测序技术测定肠道菌群组成,并利用PICRUSt进行功能预测,以此比较健康与患病凡纳滨对虾肠道微生物的群落结构和功能差异,并预测功能与群落组成的相关性。结果显示,病害的发生伴随着肠道菌群结构的显著变化,而多样性无显著差异。与健康凡纳滨对虾肠道细菌组成相比,患病凡纳滨对虾肠道中放线菌门(Actinobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)相对丰度降低,而γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)增加。同时,筛选出16个指示细菌科,能够很好地指示宿主健康状况。与健康组相比,患病凡纳滨对虾中参与弧菌侵染的过程显著增加,而溶酶体和过氧化物酶等免疫功能代谢过程显著减弱。此外,肠道微生物群落结构与功能组成呈显著正相关,表明凡纳滨对虾肠道菌群组成具有较低的功能冗余性。研究表明,健康与患病凡纳滨对虾肠道菌群结构存在显著差异,并且由细菌介导的功能随之发生改变,能够用指示微生物评估宿主健康状况。     

鲍疱疹病毒原位LAMP检测方法的建立与初步应用

为精确定位鲍疱疹病毒(HaHV-1)在宿主不同组织器官中的分布,明确HaHV-1的组织亲嗜性和侵染进程,实验基于环介导等温扩增技术(LAMP)和原位杂交技术建立了HaHV-1的原位LAMP检测方法。利用该方法研究了HaHV-1人工感染实验不同时间节点,病毒在杂色鲍主要器官的分布规律和组织亲嗜性。并对已报道的HaHV-1 LAMP扩增引物进行优化,实现对载玻片上原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,筛选最佳显色时间等原位杂交反应条件,最后通过免疫酶标技术分析HaHV-1在组织样本内的分布情况。结果显示,HaHV-1原位LAMP检测方法最适显色时间为60 min。利用该方法对攻毒后24、36、48、60和72 h,HaHV-1在杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺和腹足神经节4种样本的组织分布情况进行检测和分析。病毒阳性信号最早于36 h出现在腹足神经节,48 h在部分外套膜样本中观察到病毒阳性信号,分布局限于外周神经中。在感染实验后期,病毒阳性信号出现在肝胰腺结缔组织中。病毒阳性信号出现的部位常有大量细胞渗出和浸润,渗出的细胞中可见被病毒感染的血淋巴细胞。本研究建立的HaHV-1原位LAMP检...     

罗氏沼虾不同养殖模式对水体浮游生物的影响

通过围隔实验比较罗氏沼虾不同养殖模式对水体浮游生物的影响。实验设置6种养殖模式:罗氏沼虾单养(MP)、罗氏沼虾+浮萍(水面覆盖率5%)(PP)、罗氏沼虾+鲢(PF)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+鲢(PMF)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+浮萍(PMP)、罗氏沼虾+背角无齿蚌+浮萍+鲢(PMPF)。养殖64 d后,测定不同模式中浮游植物和三大类浮游动物(轮虫、枝角类及桡足类)的种类和数量。结果显示,上述6种模式中浮游植物共同优势种有4种,但优势度指数最大的浮游植物不同,MP组是锥囊藻属,有浮萍的PP和PMP组均为细小平裂藻,混养鲢的PF、PMF和PMPF组均为针杆藻。不同养殖模式无共同的浮游动物优势种。养殖模式对浮游生物密度具有显著影响,PF组浮游植物密度最高,MP组浮游植物密度最低,PF组浮游植物密度比MP、PP和PMP组分别高78%、53%和61%。相反,浮游动物密度MP组最高,PF组最低。混养鲢的PF、PMF和PMPF组浮游动物密度显著低于其他3组。研究表明,罗氏沼虾养殖中混养鲢可增加浮游植物密度而降低浮游动物密度,浮萍和鲢影响池塘优势种。     

青鱼和鲇肠道排泄物对养殖水体铜绿微囊藻休眠体复苏的影响及作用途径

为探讨养殖水体底栖鱼类肠道排泄物对铜绿微囊藻休眠体复苏的影响,将青鱼和鲇肠道排泄物与铜绿微囊藻休眠体用野外养殖水域沉积物(底泥)混匀包埋,在10、15和20°C梯度温度下进行休眠体复苏实验.结果显示,铜绿微囊藻休眠体主要复苏期为第3～15天,在10和15°C条件下,青鱼排泄物组(MP)、鲇排泄物组(SA)和青鱼-鲇排泄...     

欧洲鳗短钩拟指环虫病及其鳃组织病理

报道了患短钩拟指环虫病欧洲鳗的症状、流行状况和鳃显微组织病理.游动和呼吸频率异常、鳃丝浮肿和鳃上粘液增多为该病的主要症状.该病尽管在冬季也有发生,但水温在26℃以上的春末、夏季和秋初是最易发病的流行季节,流行出现明显的季节性变化.患病欧洲鳗鳃的组织病理变化主要表现出5种类型,其一是鳃小片上皮细胞增生,使邻近的鳃小片相连;其二是鳃小片粘液细胞增生,同样使鳃小片连成一片,增生的粘液细胞经阿利新蓝(Alclan blue)和过碘酸雪夫氏(Periodic acid schiff)二者联合染色后呈蓝紫色的染色反应,属于Ⅳ型的粘液细胞;其三是鳃小片肿大,但单层扁平上皮细胞无肿大现象,上皮细胞层与毛细血管相分离,鳃小片上皮细胞坏死,上皮细胞层破裂,血细胞外溢,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,失去鳃小片原有的结构;其四是鳃小片肿大同时伴随单层扁平上皮细胞肿大,进一步发展,鳃小片上皮细胞坏死脱落后,鳃小片同样失去原有的结构;其五是鳃小片毛细血管严重充血扩张,比原毛细血管扩张几倍到十几倍,形成充满红细胞的棒状到球状的动脉瘤.结果表明鳃上皮细胞增生、粘液细胞增生、鳃小片肿大、上皮细胞坏死脱落和严重充血成动脉瘤等病理变化都可导致患病欧洲鳗呼吸困难,轻者影响其生长,重者最终因呼吸衰竭而死亡.     

珠江口海域双胞旋沟藻赤潮对卤虫幼体、鱼苗和虾苗的急性毒性

为研究2009年10月下旬在广东珠海海域爆发的双胞旋沟藻赤潮对养殖鱼类及水体中其它生物的影响,实验以卤虫幼体、金鼓鱼苗和凡纳滨对虾苗作为受试生物,在赤潮现场测试双胞旋沟藻对卤虫幼体、鱼苗和虾苗的急性毒性效应。结果显示,24 h双胞旋沟藻对卤虫幼体的LC₅₀(半致死浓度)为9.55×10⁴/mL,藻密度为2.5×10³/mL的双胞旋沟藻对卤虫幼体的LT₅₀(半致死时间)为48.5 h。60 h内该赤潮水体对鱼苗和虾苗的存活无不利影响,卤虫幼体和金鼓鱼苗均可摄食双胞旋沟藻,卤虫幼体对双胞旋沟藻的摄食率低。研究表明,双胞旋沟藻赤潮水体对卤虫幼体有一定的毒性作用,但在低藻密度条件下,卤虫幼体能以该藻为食并维持其生命,双胞旋沟藻对金鼓鱼苗和凡纳滨对虾苗无急性毒性作用。     

大菱鲆高温胁迫应答主效QTL候选基因的表达特性分析

为研究大菱鲆高温胁迫下相关应激基因的表达影响,采用Real-time PCR对本课题组已定位到的大菱鲆高温胁迫应答主效QTL中的4个候选基因(p53、UBE2H、ZNF469和MAGI2基因)在不同温度胁迫下的肝脏、鳃、脾脏、皮肤4个组织中的表达量进行检测。以大菱鲆正常生活水温14°C为对照组,20°C、23°C、25°C和28°C为实验组,进行数据分析。结果显示,4个基因在各个组织中均有表达,且表达量具有组织和温度特异性。其中UBE2H的表达量在4个组织中均呈现出先上升后下降的趋势,在肝脏、脾脏、皮肤组织中20°C时急剧上升并达到峰值且差异显著;在鳃组织中23°C时达峰值,差异显著。p53在4个组织中的表达量均有先上升后下降的趋势,但在鳃和皮肤组织中28°C时表达量急剧升高达到峰值且差异显著。ZNF469和MAGI2在4个组织中均在20°C时大量表达,并远高于其他温度。研究表明,在大菱鲆高温胁迫应答过程中p53基因与DNA修复和细胞凋亡密切相关,而UBE2H基因参与的泛素-蛋白酶体途径对p53基因具有反馈调节作用,是维持细胞稳态的关键基因;ZNF469和MAGI2在作为鱼类应答高温胁迫的生物标志物方面具有重要研究价值。     

核糖体DNA在厦门白姑鱼和大黄鱼染色体上的比较定位

为了探究石首鱼核型微观结构上的变化,实验利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)比较定位了厦门白姑鱼和大黄鱼18S rDNA和5S rDNA的分布特征。结果表明,厦门白姑鱼与大黄鱼在宏观核型以及18S rDNA和5S rDNA染色体分布等3个方面均存在较大差异。厦门白姑鱼的核型公式为2n=48t,臂数FN=48;单对18S rDNA信号分布于1号染色体臂间;单对5S rDNA信号分布于3号染色体近着丝粒区域。大黄鱼的核型公式为2n=2sm+4st+42t,臂数FN=50;单对18S rDNA信号分布于18号染色体短臂端部;5S rDNA信号9~11对,除一对分布于臂间外,其余全部分布于着丝粒端或短臂端部。综合其他石首鱼核型数据可以推断:厦门白姑鱼呈现原始核型特征,而大黄鱼核型是原始核型经染色体重排和/或转座衍生的特化核型;石首鱼宏观核型和18S rDNA分布模式总体保守,仅少数物种存在变化,而5S rDNA位点的分布模式存在高度的种间变化。本研究首次揭示了石首鱼物种间核型微观结构的变化,为进一步开展石首鱼分子细胞遗传学研究奠定了基础。     

二氧化锗对共培养萱藻丝状体和硅藻生长的影响

为抑制萱藻丝状体保存和扩增过程中出现的小伪菱形藻与碎片菱形藻的生长,本实验应用实验生态学方法,分别建立了丝状体与小伪菱形藻、丝状体与碎片菱形藻、丝状体与小伪菱形藻和碎片菱形藻的共培养体系,研究了1.00～4.00μg/mL二氧化锗(GeO_2)对共培养条件下丝状体生长发育及附生硅藻生长的影响。结果显示:(1)处理萱藻丝状体和硅藻共培养体系的适宜GeO_2浓度为1.00～2.50μg/mL,各实验组14 d的硅藻抑制率均高于67.33%±5.18%,且丝状体生长发育良好,2.00μg/mL为最适浓度,此浓度下丝状体日均增长率最高,在各培养体系中均大于11.00%,且诱导后孢子囊枝比例和孢子囊直径分别为57.47%±5.31%和(24.55±1.01)μm,与对照组差异不显著;(2) 3.50和4.00μg/mL GeO_2虽对硅藻抑制效果更佳,但同时也会抑制丝状体生长和后期孢子囊的形成与发育,其中4.00μg/mL GeO_2可导致丝状体死亡;(3)碎片菱形藻较小伪菱形藻对GeO_2更敏感。实验14 d,各浓度GeO_2对碎片菱形藻的抑制率为(82.10%±2.40%)～(96.35%±0.79%),均高于同浓度GeO_2对小伪菱形藻的抑制率;同时在丝状体与小伪菱形藻和碎片菱形藻的共培养体系中,碎片菱形藻占硅藻比例随GeO_2浓度升高而相应下降。     

实时荧光定量PCR扩增特异性vapA基因检测杀鲑气单胞菌

为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.8345x+42.535,相关系数R~2为0.998,最低检测限为34拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约1000倍。应用建立的方法检测人工感染的虹鳟病样,15个被检样品呈阳性反应,与细菌常规鉴定方法结果一致。研究表明,所建立的基于实时荧光定量PCR技术的杀鲑气单胞菌检测方法快速、特异、灵敏,可用于临床诊断和疫病监测。     

团头鲂tf和tfr1a基因启动子克隆及转录调控分析

为探索鱼类转铁蛋白基因tf和转铁蛋白受体基因tfr1a的转录调控机制,本实验以团头鲂为研究对象,在其全基因组数据库中获取tf和tfr1a基因序列,对2个基因候选启动子区转录因子结合位点及CpG岛进行预测,通过PCR方法克隆得到tf和tfr1a基因近端启动子区不同长度片段,连接至pGL3-Basic/pEGFP-1载体,瞬时转染入Hela细胞,并采用双荧光素酶报告基因检测系统进行检测。结果发现,团头鲂tf基因启动子区无CpG岛位点,而tfr1a基因启动子区有2个CpG岛位点。成功构建9个tf和10个tfr1a不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶报告基因系统检测发现,tf启动子核心区域为-268～+56 bp,且-1 308～-1 102 bp片段可能存在正调控该基因表达的转录因子结合位点;tfr1a启动子核心区域为-224～+48 bp,且+48～+92 bp可能存在抑制该基因转录的负调控元件,而-1 229～-1 219 bp区域可能存在促进tfr1a基因表达的正调控转录因子结合位点。