郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因突变位点分析与高效分子标记开发

opaque2突变体材料是最常用的高赖氨酸玉米供体。对已获得的郑58/o2近等基因系研究表明,胚乳发育不同时期22-kDα-醇溶蛋白的积累均明显低于郑58。荧光定量PCR结果表明,α-醇溶蛋白家族基因Z1A、Z1B、Z1C和Z1D的表达均显著低于郑58。郑58/o2胚乳发育不同时期Opaque2基因均正常表达。测序分析发现,郑58/o2中o2基因ATG后713 bp处缺失10个碱基,ORF预测Opaque2蛋白翻译提前终止。针对突变缺失位点开发基因内分子标记o2-indel-1,利用该标记进行回交转育,结果表明,o2-indel-1与o2突变表型完全连锁,错选率为0。opaque2基因突变位点的解析有助于高效分子标记的开发,有效降低错选率,提高优质蛋白鲜食玉米多基因聚合育种的选择效率。     

Opaque2基因对糯玉米子粒品质的影响分析

玉米Opaque2(O2)基因突变显著影响子粒胚乳中蛋白体形成、淀粉含量、氨基酸组成等,其中,赖氨酸含量提高使营养品质大幅度提升。通过回交转育的方法构建17份糯玉米o2近等基因系,对子粒表型、种皮厚度、百粒重和粗淀粉含量等性状分析。结果表明,与对照相比,16个近等基因系子粒明显皱缩、胚乳变为粉质,6个近等基因系种皮厚度增加,11个近等基因系百粒重显著降低,12个近等基因系子粒粗淀粉含量显著降低。由此表明,o2基因的导入对糯玉米子粒表型、产量、淀粉含量等主要起负调控作用,影响程度与导入背景密切相关。     

玉米子粒粉质突变体3901l的图位克隆

粉质胚乳突变体3901l来源于美国种质中心,该突变体胚乳呈现完全不透明表型。生化分析发现,该突变体α-和β-醇溶蛋白剧烈下降,同时伴随着非醇溶蛋白的大幅度升高。通过玉米SNP3072芯片进行基因分型分析发现,3901l基因定位于7号染色体约33 M的区间。通过与o2突变体进行等位测试,确认3901l是o2的等位突变体。进一步研究表明,该突变体的O2转录本缺失了一个61-bp的外显子,造成开放阅读框移码和翻译提前终止。利用O2特异抗体检测子粒总蛋白,发现突变体中O2蛋白完全缺失,不能检测到提前终止的O2蛋白,说明错误翻译的O2蛋白被机体快速识别并降解。     

玉米品质相关的opaque基因研究进展

玉米中的opaque突变体改变了胚乳的蛋白特性,导致胚乳表现柔软且不透明的粉质状。粉质胚乳的高赖氨酸营养特性引起人们的极大关注,研究人员先后发现了13个opaque胚乳突变体,只有o2的分子机理研究较为清楚,对提高赖氨酸含量的作用最大。为了研究胚乳中储藏物质合成、装配、转运的调控机理,从而将这些有益突变基因应用于农业生产,研究人员继而发现了多个胚乳修饰的主效位点及基因(Opm)。本文综述玉米opaque突变体及相关基因的研究进展,对当前育种中利用该类基因培育优质蛋白玉米(QPM)的研究状况进行分析,为高赖氨酸玉米的分子标记辅助选择(MAS)和基因聚合育种提供参考。     

玉米Opaque-2基因在毕赤酵母中的表达

从玉米自交系辽2345授粉后18 d的胚乳中提取总RNA,经反转录后得到第一链cDNA,利用Opaque-2基因的特异引物克隆出该基因的全编码区,将该编码区的全序列以正确的阅读框架利用Infusion同源重组的方法亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9的α因子下游,并置于AOXⅠ启动子控制下,利用pPIC9表达载体上的特异引物进行PCR鉴定,鉴定后的重组质粒用Bgl Ⅱ酶切线性化后,电转化导入甲醇型毕赤酵母菌株GS₁15中,利用MM、MD和菌落PCR的方法筛选出Mut⁺表型,得到的重组子以甲醇诱导表达蛋白。经SDS-PAGE结果显示,Opaque-2蛋白得到表达,其相对分子质量（Mr）约为47 KD。     

玉米shrunken2突变体中醇溶蛋白合成相关基因的表达分析

利用SDS-PAGE和荧光定量PCR,研究shrunken2(sh2)突变体子粒胚乳发育不同时期醇溶蛋白的积累以及醇溶蛋白合成相关基因的表达情况。结果表明,与郑58相比较,sh2中氨基酸组分变化与opaque2(o2)相似,赖氨酸含量升高,同时谷氨酸和亮氨酸含量下降。SDS-PAGE结果显示,胚乳发育不同时期sh2中醇溶蛋白的积累均明显低于郑58,而且sh2中19-kDa α-醇溶蛋白积累明显减少。荧光定量PCR结果表明,sh2突变体中对于Z1A、Z1B和Z1D家族基因的抑制较为显著。sh2突变体中prolamine-box binding factor (PBF)表达量升高,opaque2(o2)表达下降。因此,sh2突变体同时影响淀粉、氨基酸、贮藏蛋白等的代谢。     

小麦丙氨酸-乙醛酸转氨酶基因（ TaAGT2）的克隆、生物信息学预测及表达分析

光呼吸是植物细胞H_2O_2的重要来源,也是维持细胞氧化还原的重要成分,影响植物对生物和非生物逆境的应答,因此,挖掘与光呼吸有关的基因对提高植物的抗逆性具有重要意义。本研究以耐旱小麦品种青麦6号转录组数据为基础,通过RACE技术克隆得到小麦 AGT2基因的全长cDNA,将其命名为 TaAGT2,并对其进行了生物信息学预测及表达模式分析。结果表明, TaAGT2开放阅读框长1 434bp,编码477个氨基酸。该蛋白属于亲水性稳定蛋白,定位于线粒体中,二级结构以α-螺旋(42.14%)和无规则卷曲(32.91%)为主。 TaAGT2基因包含AAT-I基因族保守区域,与二穗短柄草 AGT2的相似性高达97%。通过qRT-PCR对基因 TaAGT2在不同组织中(根、茎和叶)及4种非生物胁迫(低温、ABA、干旱、高盐)下的表达特性进行分析,结果表明, TaAGT2在根、茎和叶中均有表达,茎中的表达显著高于根和叶,在不同胁迫条件下上调表达,表明该基因可能参与调控植物的抗逆反应。     

小麦品种东农冬麦2号根中TaEXPA7部分同源基因的克隆及表达特性分析

膨胀素(expansin)是植物生长发育过程中诱导细胞壁松弛和伸展的蛋白,包括EXPA、EXPB、EXLA、EXLB四个基因家族,对植物根系的形成及快速发育具有重要作用。本试验以寒地冬小麦品种东农冬麦2号两叶一心期的根为材料,克隆了TaEXPA7基因的3个CDS全长,其氨基酸序列同源性较高,仅信号肽处有两个氨基酸不同,其核酸序列长度均为777bp,编码258个氨基酸,分别命名为TaEXPA7-A、TaEXPA7-B、TaEXPA7-D,且分别定位于2AL、2BL、2DL染色体。蛋白均含有DPBB-1和Pollen-allerg-1两个保守结构域,分子量为27 670.74Da,等电点为8.09,均为疏水性蛋白;与节节麦、二穗短柄草的相似性分别为99%和92%。采用两叶一心期的根进行qRT-PCR分析发现,TaEXPA7-A/B/D三个基因在根尖中的表达量均较高,伸长区和成熟区次之;对冬小麦根进行低温、干旱和激素处理后,这三个基因均下调表达,并且TaEXPA7-B基因的相对表达量较高,TaEXPA7-D的相对表达量较低。由此可见,多倍体小麦不同染色体上的基因在应对不同环境胁迫时,表达以及应答模式存在差异,并且在不同的环境胁迫下,发挥主导作用的染色体也存在差异;此外,该基因在根中的表达可能与低温、干旱以及外源激素的胁迫有一定的关系,可能是促进根系生长的重要基因。     

基于RNA-Seq技术的o2胚乳差异表达分析

Opaque2(O2)转录因子在玉米胚乳的发育进程中起重要作用。o2突变体中赖氨酸含量增加,玉米品质提高,但在很多农艺性状上表现较差。以授粉后18 d的玉米胚乳为材料,使用RNA测序(RNA-Seq)技术筛选到3 051个差异表达基因(DEGs)。通过GO和KEGG富集分析发现,DEGs覆盖了物质跨膜运输、次生代谢物的生物合成、植物激素信号转导、脂质代谢、氮代谢等多方面的功能。由此推测,O2是玉米胚乳发育过程中多种代谢途径的关键性调节因子。     

opaque-2突变基因(o2)对玉米产量和产量配合力的影响

利用18个o2近等基因系(o2-NILs)与18个普通玉米自交系,配制33对杂交组合,在北京、新乡两个试验点进行产量和配合力鉴定。结果表明,不同基因型间的产量、一般配合力(GCA)效应值、特殊配合力(SCA)效应值差异均极显著;两个类型间的产量差异极显著,GCA效应值、SCA效应值差异不显著。o2-NILs组合的平均产量在北京和新乡两个试验点分别较普通玉米组合分别低8.06%和9.64%,平均低8.85%。在产量较高的组合中,有5对为o2-NILs与同型普通玉米的组合,分别是CAL58×丹598(o2/normal)、196×辽2345(o2/normal)、196×803(o2/normal)、CAL58×吉477(o2/normal)、CA156×196(o2/normal),说明这5对组合产量没有受o2影响。两个类型自交系GCA均为正值的为313(o2/normal)、吉63(o2/normal)、辽2345(o2/normal)、丹598(o2/normal)和196(o2/normal),表明o2基因对产量有一定影响,但在不同的遗传背景下o2基因的影响不同。     

转小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥植株的主要抗旱性研究

核氧还蛋白（nucleoredoxin,NRX）可通过还原目标蛋白的二硫键来调控其生物活性,在植物的生长发育和抗逆境胁迫中发挥着重要作用。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）、h型硫氧还蛋白（h-type thioredoxin,TRXh）和蛋白磷酸酶2A催化亚基（protein phosphatase 2A catalytic subunit,PP2Ac）是小麦核氧还蛋白TaNRX1的互作蛋白。为了明确TaNRX1互作蛋白的抗旱性功能,本研究在拟南芥中过表达了小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因,对野生型和转基因拟南芥的表型和抗旱相关生理指标进行了鉴定。结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的根长、存活率、脯氨酸含量均大于野生型,离体叶片失水率、丙二醛（MAD）含量均小于野生型。二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）对H₂O₂组织定位染色结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的H₂O₂含量均低于野生型。上述结果说明,TaNRX1的互作蛋白基因 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D增强了拟南芥对于干旱胁迫的抵抗能力。本研究可为小麦抗旱育种提供候选基因和理论基础。     

小麦木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21的克隆及赤霉病菌诱导下的表达分析

木瓜类半胱氨酸蛋白酶（PLCPs）作为一类重要的蛋白水解酶,在植物生长发育以及胁迫应答过程中都发挥着重要作用。本研究从抗、感赤霉病小麦品种差异表达基因谱中获得1个注释为RD21 Cysteine proteases的EST（表达序列标签）,以此序列检索小麦最新基因组数据库并设计引物,从小麦中克隆到3个基因,分别命名为TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D,属于PLCPs RD21家族。序列分析表明,3个基因的开放阅读框长度分别为1 410、1 428和1 419 bp,分别编码469、475和472个氨基酸。序列比对发现,3个基因的序列相似性为89.3％,所编码蛋白的氨基酸序列相似性为95.6％。系统进化分析表明,TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D蛋白的同源性较高,且与乌拉尔图小麦TuRD21A蛋白聚为一类。qRT-PCR分析表明,3个TaRD21基因均受水杨酸(SA)、乙烯利(ETH)以及赤霉病菌诱导表达;感病品种中,TaRD21-2A对SA和赤霉病菌的响应更迅速,且表达量较高;抗病品种中,TaRD21-2B和TaRD21-2D基因对ETH的响应更迅速。     

滨麦蔗糖:果聚糖6-果糖基转移酶(6-SFT)基因全长cDNA的克隆与生物信息学分析

为了挖掘和利用滨麦(Leymus mollis,2n=4x=28,JJNN)的优良基因,以拓宽小麦非生物胁迫抗性基因资源,以滨麦为材料,利用RT-PCR结合RACE技术从滨麦叶片中克隆到6-SFT基因cDNA的全长序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明,其cDNA全长为2 086bp,开放阅读框为1 866bp(命名为Lm-6-SFT),编码621个氨基酸;其推导的蛋白分子量为69.1kDa,理论等电点(pI)为5.18,属于酸性蛋白。保守结构域分析表明,该基因推导的氨基酸序列含有SDPDG、RDP和EC结构域。多序列比对及进化树分析表明,滨麦6-SFT与冰草6-SFT在氨基酸水平具有高度的序列相似性。     

小麦LEAsm基因及其启动子的克隆与功能研究

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)是一个小的高亲水性的蛋白家族,该蛋白家族在逆境胁迫下大量积累,保护植物免受逆境胁迫。LEA蛋白可分为7组,其中重复的11-氨基酸基序是第3组LEA蛋白的特征。为深入分析第3组LEA蛋白在小麦响应逆境胁迫中的作用机制,利用芯片技术从小麦表达谱中筛选出一个渗透胁迫诱导表达的第3组LEA蛋白基因TaLEAsm,然后根据该基因序列设计引物筛选石麦15的BAC文库,获得1个含有该基因的BAC单克隆,以该BAC单克隆质粒为模板,通过BAC延伸测序克隆了TaLEAsm基因及其启动子序列,并对TaLEAsm序列特征、表达模式和启动子功能进行了初步分析。结果表明,TaLEAsm基因序列仅含有1个105bp的内含子,其开放读码框长675bp,编码224个氨基酸。TaLEAsm含有10个11-氨基酸重复序列,属于第3组LEA蛋白。低温、高盐和渗透胁迫均诱导TaLEAsm基因上调表达,但在根和叶中表达模式不同。在TaLEAsm基因起始密码子上游1 500bp序列中,预测含有14个逆境响应顺式元件。在拟南芥中,TaLEAsm基因启动子能够启动GUS基因表达,渗透胁迫诱导GUS基因明显上调表达。以上结果表明,TaLEAsm为小麦脱水响应基因,其启动子为渗透胁迫诱导启动子。     

玉米耐旱相关基因dbf1的序列变异分析

玉米dbf1 基因在干旱胁迫下的编码产物与DIP₁蛋白相结合,调控植物激素脱落酸（ABA）响应基因rab17 的表达,从而提高耐旱性。以B73的dbf1 基因组序列为模板,对104个玉米自交系的dbf1 基因进行测序,研究玉米dbf1 基因的序列多态性。多态性分析表明,在全长为2 118 bp的序列中共发现48个SNP和12个InDel。尽管大部分变异位点集中在非编码区,但编码区的1个InDel和3个非同义突变位点的变异可以产生氨基酸序列改变。玉米dbf1 基因的全长序列和编码区序列的变异位点可以分别将该基因划分成33和11种单倍型,并且编码7种蛋白质。在供试材料中,dbf1 基因至少经历了9次重组,中性检测表明,该基因的进化没有偏离中性选择。     

小麦TaDHN2基因及其启动子的克隆与功能研究

为给深入研究Ta DHN2基因在小麦抗旱机制中的作用机理奠定基础,并为进一步丰富小麦DHN基因研究内容提供参考,本研究通过筛选石麦15基因组BAC文库和BAC克隆测序方法克隆了Ta DHN2基因及其启动子,并对Ta DHN2基因序列特征、表达模式和启动子功能等进行了分析和探讨。结果表明,Ta DHN2基因含有1个88 bp的内含子,开放读码框长为696 bp,编码1个含有231个氨基酸的脱水素蛋白。Ta DHN2蛋白具有Y-segment、S-segment和K-segment结构域,属于YSK2类型脱水素蛋白。此外,该蛋白含有明显的核定位信号序列S-segment和基序RRKK。Ta DHN2基因受渗透胁迫诱导表达,在根和叶中表达模式类似,叶中表达量显著高于根中。Ta DHN2基因启动子序列长为2 025 bp,预测含有9个脱水响应顺式元件。在转基因拟南芥中,Ta DHN2基因启动子能够启动GUS基因表达,并在渗透胁迫下诱导GUS基因上调表达。以上结果说明,Ta DHN2基因为脱水响应基因,其启动子为渗透胁迫强诱导启动子。     

野生二粒小麦根中干旱响应蛋白的分离与鉴定

为了解野生二粒小麦响应干旱胁迫的调控机制,分析了干旱胁迫下小麦根的相对含水量、丙二醛、脯氨酸和过氧化氢含量,采用双向电泳(2-DE)结合MALDI-TOF-TOF-MS方法分离和鉴定了野生二粒小麦根中干旱响应蛋白的变化。结果表明,随着干旱处理时间的延长,野生二粒小麦根的相对含水量下降,脯氨酸含量先上升后降低,过氧化氢含量和丙二醛含量上升;复水后的野生二粒小麦根的相对含水量、脯氨酸含量有所升高,但未达到对照的水平。通过对干旱处理6d后根系的总蛋白进行双向电泳分离和MALDI-TOFTOF生物质谱鉴定,成功鉴定出26个差异表达蛋白,13个上调表达,13个下调表达。26个差异表达蛋白的功能主要涉及信号传导、氧化解毒、碳代谢、能量代谢、蛋白质生物合成及细胞骨架稳定。推测野生二粒小麦为适应干旱胁迫,通过根部感应胁迫信号,并传导至细胞内,影响小麦根中蛋白质的生物合成、氨基酸代谢、碳水化合物代谢、细胞骨架形成;通过抗氧化酶系统和抗氧化物质的作用,将过多活性氧加以清除;通过增加胞内脯氨酸含量,降低根中水分损失。