绿色荧光蛋白基因在家蚕的表达研究

将绿色荧光蛋白(GFP)基因导入家蚕蛹(G_0)的睾丸,利用荧光显微镜技术检测到绿色荧光蛋白基因在家蚕卵(G_1)表达的荧光图像。     

丝素缺失突变型家蚕添食罗丹明B制备彩色荧光丝胶的研究

具有高生物相容性和生物活性的荧光材料在创伤修复、药物递送、传感器、生物测定与成像等许多领域因便于示踪或实时监测而备受青睐。对丝素缺失突变型家蚕添食荧光染料罗丹明B,系统地研究添食罗丹明B对家蚕生理指标和茧质的影响,同时研究罗丹明B在家蚕体内的转移,以及添食后丝腺中丝胶液和蚕茧中罗丹明B的含量,制备彩色荧光丝胶纤维支架并分析其细胞相容性。结果表明,添食罗丹明B后家蚕幼虫体色、蚕茧或纤维支架均呈粉红色,随着罗丹明B添加量的增加,罗丹明B在家蚕体内存留量也随之提高,6 mg/mL罗丹明B处理组家蚕丝腺中丝胶液和蚕茧中的罗丹明B含量分别为0.011 mg/mL和0.166 mg/g;添食罗丹明B对家蚕的生命力和茧质均有显著影响,随着罗丹明B添加量的增加,家蚕的生命力和茧质均呈现下降趋势;添食获得的含有罗丹明B的蚕茧或纤维支架具有强荧光特性;添食罗丹明B可获得平整、均一的彩色荧光丝胶纤维支架,且该荧光支架无细胞毒性。综上,对丝素缺失突变型家蚕添食荧光色素是获得新型荧光丝胶材料的可行性途径。     

表达绿色荧光和红色荧光蛋白重组新城疫病毒的构建

试验旨在探究以新城疫病毒为载体进行多联疫苗的构建.通过将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因和红色荧光蛋白(DsRed)基因用T2A肽串联后克隆入嵌合新城疫病毒AI4-2FHN的P和M基因之间,获得重组质粒pAI4-2FHN-GRFP.该质粒与pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个辅助质粒共转染至稳定表达T7 RNA...     

家蚕转基因载体pBacA3EG在家蚕培养细胞中的表达

本研究利用质脂体介导法将构建好的家蚕转基因载体piggyBacA3EG转染家蚕培养胚胎细胞SWAU1-BmE,转染后48h在荧光显微镜下观察到大量的发绿色荧光的细胞, 200h后,仍有部分细胞发绿色荧光.通过细胞爬片观察发现,绿色荧光是由细胞的胞质部分发出的,细胞核不发光.经RT-PCR检测,能在转染细胞cDNA中扩增出EGFP片段,表明该表达载体构建正确,且能在细胞水平进行瞬时表达,可以用于家蚕转基因的下一步研究.     

绿色荧光蛋白研究进展

来源于海洋多管水母属的绿色荧光蛋白(GFP)基因是目前惟一在细胞内稳定表达,在蓝光或长紫外光的激发下,不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光的新型报告基因,无种属、组织和位置特异性,且能监测基因表达、信号转导、共转染、蛋白运输与定位,以及细胞系谱分类等。GFP对细胞无毒性,且检测方法简单,结果真实可靠,目前在多种原核和真核生物研究中得到广泛的应用。文章就GFP的生化特性、GFP的改进及其在分子生物学研究中的应用潜力进行简要阐述。     

组成型表达绿色荧光蛋白的重组干酪乳杆菌的构建

以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)组成型表达质粒p PG-T7g10-PPαT为重组载体,在限制性内切酶SacⅠ和ApaⅠ酶切位点之间,插入增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建重组质粒p PG-T7g10-EGFP,电转化干酪乳杆菌ATCC393(L.casei 393),获得重组菌p PG-T7g10-EGFP/L.casei 393;利用Western blot检测可见约27 ku的重组蛋白特异性反应带;激光共聚焦显微镜下可见重组菌出现特异的绿色荧光;流式细胞术分析可见重组菌出现了明显的荧光信号。结果表明:已经获得组成型表达EGFP的重组干酪乳杆菌。本研究为进一步利用该表达系统表达功能蛋白,拓展乳酸菌的应用提供了参考。     

表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建与鉴定

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。在体外稳定试验中，重组菌经LB固体及液体培养基连续传15代后，单个菌落和菌液均呈绿色；在体内稳定试验中，经ICR小鼠连续传代10次，从肝脏、脾脏中分离的细菌经LB固体培养仍为绿色，证明构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是稳定的。SDS-PAGE结果显示，鼠伤寒沙门氏菌表达的GFP分子量约为27kD，这与预计的分子量大小一致。用免疫剂量的重组细菌接种BALB/C小鼠后，观察1个月未见有异常现象，同时剖栓后也未见脏吕有眼观病变。表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌的构建为减毒沙门氏菌作为活载体的基因工程疫苗的研制提供一个优良模型，为研究沙门氏菌疫苗和沙门氏菌疾病的致病机理的提供了一个有力的工具，同时在相关疾病的免疫防制基础研究中亦有重要应用价值。     

绿色荧光蛋白的真核表达及其单克隆抗体制备

【目的】构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的重组猪痘病毒(recombinant Swinepox virus, rSWPV),制备抗GFP单克隆抗体。【方法】首先合成3′-端含His标签的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列EGFP-His,用双酶切方法将其插入到基础质粒载体pSW中,构建重组转移载体pSW-EGFP-His;采用脂质体转染的方法使该载体与SWPV(SWPV-JX20G株)同源重组,经蚀斑纯化获得rSWPV-EGFP-His。重组病毒进行PCR和SDS-PAGE鉴定,扩增并纯化EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌抗GFP特异性抗体的杂交瘤细胞,制备腹水,对抗GFP单克隆抗体进行效价及特异性鉴定。【结果】PCR和SDS-PAGE结果显示,成功构建并纯化到rSWPV-EGFP-His,该病毒感染PK15细胞可稳定表达EGFP-His蛋白,蛋白大小约27 ku,为可溶性表达,镍柱纯化的EGFP-His蛋白溶液呈明显的绿色。EGFP-His蛋白免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠血清抗体...     

利用家蚕细胞表达重组蝎毒素蛋白及其杀虫效果分析

用天然毒素蛋白杀灭害虫是农林病虫害防治的一个重要发展方向。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)多角体蛋白基因的部分序列与蝎毒素蛋白基因(BmK ITa1)融合表达,SDS-PAGE分析通过融合表达策略构建的含有蝎毒素蛋白基因的重组病毒具有较高的蝎毒素蛋白表达水平,重组病毒vBmBac(polh-)PH5B/35B-BmK ITa1.6His,在家蚕BmN细胞内的BmKITa1蛋白表达水平分别为0.4、0.2 mg/mL。以家蚕和棉铃虫为供试昆虫,探讨融合蝎毒素蛋白的杀虫效果,结果表明:经口添食含融合蝎毒素蛋白的BmN细胞液对不同龄期家蚕幼虫均具有毒性,尤其对低龄幼虫的毒性较强,蚁蚕添食后的死亡率达80%;给1龄期的家蚕和棉铃虫幼虫经口添食含有不同剂量融合蝎毒素蛋白的BmN细胞破碎液,当添食剂量在2.8μg/头时,家蚕的死亡率即达100%,棉铃虫的死亡率达74%。研究结果提示:BmNPV多角体蛋白编码基因的部分序列与蝎毒素蛋白基因融合表达,可提高蝎毒素蛋白的表达水平,且重组病毒表达的蝎毒素蛋白具有较好的杀虫活性,在较低剂量下即可对低龄昆虫产生良好的杀灭效果。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠胚胎成纤维细胞的分离和培养

研究了不同胎龄、消化液、培养液对转绿色荧光蛋白(GFP)基因小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)分离和培养的影响,并对其生长形态进行观察。结果表明,在实验室条件下,12.5～14.5d胎龄的GFP-MEF分离效果最好,0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA所用时间短,消化后培养细胞贴壁率高;GFP-MEF形态以小梭形为主,呈漩涡状、鱼群状生长;最佳培养液为DMEM添加10%胎牛血清。研究获得了实验室分离制备GFP-MEF的方法,为制作饲养层和进一步构建转基因动物奠定基础。     

利用转基因家蚕在蚕丝中表达重组人表皮生长因子

人表皮生长因子(human epidermal growth factor,hEGF)具有刺激细胞增殖的强大能力,是伤口愈合的关键因子.利用转基因技术,在家蚕后部丝腺利用丝素轻链基因(fibroin light chain,FibL)启动子驱动FibL-hEGF融合蛋白的表达.借助piggyBac转座子将FibL-hEGF融合基因导入到家蚕基因组,利用荧光检测总共获得8个转基因阳性卵圈,转基因阳性率为36.36％.PCR和反向PCR检测证明外源融合基因FibL-hEGF已被成功整合到家蚕基因组中,且随机插入到家蚕染色体的5个位点.Western blotting检测表明FibL-hEGF融合蛋白在家蚕后部丝腺中表达且成功分泌到蚕茧中,进一步证实了转基因家蚕的产生.本研究中利用piggyBac转座子介导的转基因技术成功获得了转基因家蚕并得到重组hEGF蚕丝,该蚕丝可用于制造伤口敷料.     

家蚕核型多角体病毒gp41基因的融合表达及功能鉴定

为了研究家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedro virus,BmNPV)中GP41蛋白的包装功能,从BmNPV基因组中克隆了gp41基因,并将其克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1-gfp中,构建重组转移载体pFastBac1-gp41-gfp,再利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)筛选重组杆状病毒,在家蚕BmN细胞系中进行融合表达和定位分析。SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,经重组杆状病毒r-gp41-gfp感染的BmN细胞新增一条大小为65 kD左右的蛋白条带,证明该融合蛋白在BmN细胞中成功表达。用激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光充满于细胞质中,不能形成聚集体。与野生型BmNPV混合感染的实验也表明荧光出现的位置与多角体无关,说明GP41-GFP蛋白不能附着在多角体表面,融合表达可能影响了GP41蛋白与多角体的结合。     

国内首例绿色荧光蛋白“转基因”克隆猪问世

在紫外线照射下的转基因克隆猪显示出明显的绿色荧光蛋白的特征。[第一段]     

口蹄疫病毒3ABC绿色荧光蛋白载体构建及表达

将O型口蹄疫病毒Akesu／58株适应细胞培养。用RT—PCR技术从适应细胞株中克隆了3ABC基因,将其克隆入pGEM-T载体,测序鉴定。然后将目的基因与线性化的绿色荧光蛋白（PEGFPNl）栽体连接筛选阳性质粒命名为PEGFPN1-3ABC。将阳性质粒转入JM109大肠埃希茵增殖。提取PEGFPN1—3ABC质粒转染入BHK细胞,在荧光显微镜下直接观察表达结果。     

家蚕丝心蛋白轻链基因的克隆及品种间的比较

从蚕品种浙蕾×春晓的蛹中提取基因组DNA ,用PCR的方法克隆出家蚕丝心蛋白轻链基因 3’端 ,包含第 2到第 7外显子区 5 5kb的DNA片段。经测序并与蚕品种J- 139丝心蛋白轻链基因相同区域的比较表明 ,蚕品种间丝心蛋白轻链DNA序列同源性为 95 6 % ,氨基酸序列同源性为 98 8%。     

家蚕丝素基因表达水平的定量分析

采用实时定量RT-PCR方法,对丝素轻链基因(fib-L)、丝素重链基因(fib-H)、P25基因在家蚕幼虫不同组织和不同发育时期的表达进行了定量分析。结果发现3种丝素基因除主要在5龄幼虫的后部丝腺中表达外,在其它组织如脂肪体和中部丝腺中也有一定程度的表达;在4龄眠期的后部丝腺中3种丝素基因也有一定的表达水平,其中fib-L在这一时期的表达量较高。同时发现在5龄第3天和第5天的后部丝腺中,fib-H、fib-L与P25在mR-NA水平上的摩尔比分别为9∶18∶1和19∶32∶1,推测丝素基因的表达可能具有转录后调控,此结果说明家蚕丝素基因的表达可能具有更加精细的调控机制。     

绿色荧光蛋白基因标记嗜水气单胞菌的研究

嗜水气单胞菌广泛存在于水体环境中,可引起人和动物发病,尤其是引起鱼类的败血症。本文构建了pWSK129-gfp重组载体,并分别导入到嗜水气单胞菌强毒株J-1和无毒株4332中。在荧光显微镜下观察,菌体呈现绿色荧光。稳定性试验表明,Ah4332GFP传至70代,质粒稳定率可达100%;而AhJ-1GFP在同样条件下培养10代后,质粒的稳定率仅为15.1%。绿色荧光蛋白基因的导入为研究嗜水气单胞菌与宿主的相互关系提供了一种简单而直观的方法。     

利用转基因家蚕丝腺生物反应器生产重组蛋白的应用前景

家蚕丝腺拥有较强合成丝蛋白的能力,通过利用这一能力,使其能够大量生产有价值的蛋白,人们开始引入转基因家蚕,使它能够在丝腺中合成重组蛋白并分泌到蚕茧中。获得的重组蛋白可在生物学、生物技术,和药学领域中得到广泛应用。我们通过控制合成蛋白在丝腺中的定位,在后部丝腺(PSG)中表达重组蛋白使其定位在不能溶解的丝素中,在中部丝腺(MSG)中表达则定位于亲水外层的丝胶层中。本文主要讨论将转基因家蚕丝腺生物反应器作为优良工具,应用于大量生产药用蛋白和在工业化水平生产相关重组蛋白的可能性,以及生产重组蛋白过程中所面临的挑战和未来的应用前景。     

家蚕丝素蛋白H链基因启动子区域的克隆及活性分析

家蚕(Bombyxmori)丝素蛋白H链基因(fib-H)具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。为利用其时空调控机制,通过PCR扩增方法克隆fib-H启动子片段,并进行序列分析,进而构建由fib-H启动子控制报告基因DsRed的重组载体pSK-FH-DsRed-PolyA,通过家蚕BmN细胞和丝腺进行瞬时表达。结果表明:克隆的fib-H启动子序列具有典型的丝腺特异性表达启动子的特征,并可以驱动DsRed报告基因在BmN细胞和家蚕后部丝腺组织中瞬时表达。     

家蚕荧光茧色的研究进展

从家蚕荧光茧色品种选育、荧光茧色遗传学研究、荧光色素研究和荧光茧色与蚕茧解舒、蚕茧质量关系研究等方面,总结了家蚕荧光茧色及荧光色素的研究现状,探讨了进一步研究家蚕荧光茧色及荧光色素的实用意义。