陕农138小孢子发育过程中蛋白表达差异的比较分析

为了寻找小麦单核中晚期愈伤组织诱导率较高的原因,探讨小麦花药发育的蛋白质代谢机制,本试验利用双向电泳技术对陕农138小麦小孢子单核中晚期和双核期的全蛋白分析表明,在等电点4~7之间可识别约450个以上清晰的蛋白质点,检测到差异点26个,对其中14个质量较好、重复性较高的差异表达的蛋白质点采用基质辅助激光解吸分离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行肽指纹图谱分析,并利用Mascot软件在NCBInr数据库搜索,鉴定出11个蛋白质点,另3个蛋白质点未得到有意义的鉴定,11个蛋白质点分别被鉴定为UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(1个蛋白点)、叶绿素抗体结合蛋白(1个蛋白点)、pentatricopeptide重复蛋白PPR566-6 (1个蛋白点)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(1个蛋白点)、泛素(1个蛋白点)、S-腺苷-L-半胱氨酸水解酶(2个蛋白点)、放氧增强蛋白(2个蛋白点)和假定蛋白(2个蛋白点)。这些蛋白质点的功能涉及到糖代谢、蛋白质降解、细胞防卫等代谢过程。     

烟草细胞质雄性不育系及其保持系的花蕾差异蛋白质分析

为探讨烟草雄性不育的分子遗传机理,对烟草细胞质雄性不育系和保持系进行差异蛋白质组学研究。采用固相pH梯度SDS-PAGE双向电泳,对烟草细胞质雄性不育系MSK326及其保持系K326雄蕊原基分化期、四分体时期及单核时期花蕾蛋白质进行分离,经考马斯亮蓝染色,获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱。使用PDQuest软件分析蛋白质图谱,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱分析,然后用Mascot软件对NCBInr数据库搜索。在分子量14.4~97.6 kD、等电点4~7线性范围内,检测到约365个蛋白点,其中7个蛋白质点在保持系中出现, 在不育系中缺失,分别被鉴定为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶、多酚氧化酶、Patatin homolog蛋白、PSI 9 kD蛋白4类蛋白,推测不育系MSK326雄性不育性可能与营养代谢紊乱、间接抑制雄性器官发育、养分供给不足、免疫能力低和能量转移受到抑制等有关。     

小麦生理型和遗传型雄性不育系及其保持系小花完整叶绿体蛋白质组分比较研究

采用固相pH梯度SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳技术,以小麦遗传型雄性不育系ms(S)-1376、杀雄剂SQ-1诱导的生理型雄性不育系ms(A)-1376,以及对应的保持系(A)-1376 (杀雄剂诱导前的正常可育系)所构建的等基因和等生理差异系为试材,比较分析了2种分离纯化完整叶绿体的方法。在确立了一套适用的技术方法的基础上,研究了三者在花粉小孢子萌发单核早期小花完整叶绿体蛋白之间的差异。采用30%、45%和60%的不连续蔗糖密度梯度离心的方法能够获得完整且纯度较高的叶绿体,经TCA-丙酮提取蛋白质后,PDQuest软件分析,在分子量14.4~66.2 kD,等电点4~7的线性范围内可分辨出2-DE图谱上239个较为清晰的蛋白质点,对其中的6个差异表达蛋白质点进行MALDI-TOF肽质量指纹图谱分析,从生物信息学数据库检索鉴定出6个差异蛋白质点分别是酰基辅酶A脱氢酶结构域蛋白、钙调结合蛋白磷酸酶、多催化功能肽酶、热休克蛋白60、光受体蛋白2及1个未知功能的表达蛋白质。这些蛋白质在供试小麦叶绿体物质能量代谢、叶绿体防卫抵御机制、叶绿体细胞内信号转导及植物极性生长等生理应答反应中起调控作用,它们能在本研究供试两不育系和对应可育系中差异表达,可能与雄性不育相关。     

小麦V-CMS和杂种F1代线粒体蛋白质组表达差异

本研究以V型小麦恢复基因的近等基因系为基础材料,运用蛋白质组学技术对V-CMS及杂种F1黄化苗和幼穗时期线粒体蛋白质表达图谱进行了比较,分析了差异蛋白质点与CMS的关系.主要结果如下:(1)比较了黄化苗和幼穗线粒体蛋白质的表达图谱,鉴定了10个差异表达的蛋白质点,包括与能量代谢有关的F0-F1ATP酶复合物的亚基和一些...     

盐胁迫下棉花叶片差异蛋白表达的分析

以耐盐的陆地棉品种中07为研究材料,在其生长的三叶期,用未处理和0.4%NaCl胁迫处理24h的幼苗,分别提取其叶片全蛋白。通过等电聚焦和第二向SDS-PAGE技术获得完整的棉花叶片总蛋白图,利用ImageMaste-2DElite5.0软件分析各个差异蛋白在对照和0.4%NaCl胁迫24h后棉花叶片中的相对表达量,并选取质量好、实验重复性高的10个特异的差异表达蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)鉴定。结果表明,从对照和盐胁迫处理的双向电泳图谱中共检测到24个差异蛋白质点,这些差异蛋白质点的等电点分布集中在5.0～6.5之间,分子量分布集中在40.0～110.0kD之间;进一步质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)分析鉴定的10个差异蛋白质点,其中4个蛋白质点获得了鉴定结果,这4个差异表达蛋白质点分别为1,5-二磷酸核酮糖羧化/氧化激酶α2(编号4)、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶大亚基(编号5)、未知蛋白产物(编号19)和OEE2(编号32)。我们初步推测OEE2和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/氧化酶可能与棉花耐盐胁迫特性有关。     

西瓜根系蛋白质双向电泳体系的建立及优化

为建立高效、稳定的西瓜根系蛋白质双向电泳技术体系,对西瓜根系蛋白质样品等电聚焦(IEF)条件、样品上样量、IPG胶条p H值范围、染色方法等参数进行优化。结果表明,采用TCA/丙酮法提取西瓜根系总蛋白,裂解液组成为7 mol/L Urea、2 mol/L Thouirea、4%CHAPS(m/V)、1%Cocktail(V/V)、65 mmol/L DTT、2%p H值4~7 IPG Buffer,上样量为800μg,p H值4~7 IPG(13 cm)胶条、IEF条件为48 000 Vh,分离胶浓度为12.5%,CBB-R250染色时,可获得分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,该技术条件为适合西瓜根系蛋白分离的较优双向电泳体系。     

草原龙胆雄蕊发育特定阶段差异蛋白质组学的初步研究

在高等植物发育过程中,会发生许多形态学和生理学特征上的改变。为了更好地研究草原龙胆特定发育阶段雄蕊内蛋白质组的差异,以草原龙胆栽培品系49号为试材,利用荧光差异双向电泳技术(2D-DIGE)研究了草原龙胆孢原细胞与小孢子母细胞的差异表达蛋白质组,分析了差异表达蛋白质在草原龙胆雄蕊发育过程中的可能作用。结果表明:利用De Cyder软件分析获得了72个主要差异蛋白质点,其中表达上调点为35个,表达下调点为37个。使用MALDI-TOF-TOF质谱仪对胶上消化后的差异蛋白点进行质谱分析,可信度达到90%以上的蛋白质点为15个,分别为5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基转移酶、S-腺苷甲硫氨酸合成酶、33 kDa光系统Ⅱ放氧复合体、核酮-1,5-二磷酸羧化酶、质体分裂环状蛋白、34 kDa的线粒体外膜膜孔蛋白、70 kDa热激蛋白、磷酸甘油酸激酶、蛋白水解酶复合体β6型亚单位、天冬氨酸蛋白酶、对ATP和Zn~(2+)依赖型金属蛋白酶和未知功能蛋白等。因此,在草原龙胆雄蕊发育的特定阶段由于蛋白质组的差异表达,导致雄蕊在形态学和生理学特征上发生改变。     

水稻种子萌发过程中胚蛋白质差异表达分析

采用IEF-SDS-PAGE双向电泳技术,对金稻1号水稻种子未萌发和萌发1-4d胚进行蛋白质分离。发现金稻1号水稻种子未萌发和萌发1-4d胚在PDQuest图像分析软件可识别的蛋白质点约215、201、187、162、132个,其中表达量变化2.5倍以上的蛋白质点有22个。选取表达量变化2.5倍以上的12个差异蛋白质点进行胶内酶解,并进行肽质量指纹图谱及其生物信息分析,初步鉴定出6个蛋白质,分别为硫氧还蛋白; 热休克蛋白;ATP合酶;LEA蛋白12;核苷二磷酸激酶;乙二醛酶。对这些蛋白质在水稻种子萌发过程中的作用进行了讨论。     

水稻种子蛋白双向电泳方法的建立和质谱初步分析

为了建立适用于水稻(Oryza sativa L.)种子蛋白质组分析的双向电泳方法,本研究比较了三氯乙酸/丙酮法和改良的酚提取法对水稻种子蛋白的提取效果,不同蛋白提取液上样量、不同p H梯度(p H 3~10和p H 4~7)IPG胶条对水稻种子蛋白的分离效果。结果表明:在目前的双向电泳体系下,采用改良的酚提取法,24 cm p H 4~7线性IPG胶条,上样量1 200~1 500μg的条件可以获得分辨率高、重复性好、胶内蛋白点适用于后续质谱分析的双向电泳图谱。最后本实验通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)对10个随机挑选的胶内蛋白质点进行了初步蛋白质鉴定分析,进一步确定了改良的酚提取法可以适用于水稻种子蛋白质双向电泳分析。     

盐胁迫条件下耐盐番茄叶片差异蛋白表达分析

以导入红海榄总DNA的耐盐番茄及其野生型番茄为材料,于3~4片真叶期分别用调和海水(约1%盐度)和自来水进行灌溉,处理14 d后,采用BPP法提取番茄叶片的全蛋白质,通过等电聚焦和第二向SDSPAGE电泳得到清晰的番茄叶片全蛋白质双向电泳图谱。利用Image Master 2D platinum 6.0软件对海水处理及对照条件下耐盐番茄及野生型番茄差异表达的蛋白进行分析发现,蛋白质双向电泳图谱大约有800个蛋白点,共检测到123个差异蛋白点,每张图谱的匹配率达90%。海水处理下的耐盐番茄与野生型番茄的叶片全蛋白质图谱中共检测到82个高丰度的差异蛋白点,其中42个蛋白点的表达量为上调,40个蛋白点的表达量为下调。对差异表达的蛋白质点进行了基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)鉴定,得到了相关的差异蛋白质信息,为揭示耐盐番茄的耐盐机理、为克隆相关耐盐基因提供了帮助。     

白菜型冬油菜温敏不育系PK3-12S育性转换的差异蛋白质组学分析

为揭示温敏不育系PK3-12S育性转换机制,本研究以白菜型冬油菜温敏不育系PK3-12花药为材料,采用2-DE和LC-MS/MS质谱鉴定等差异蛋白组学方法,分离鉴定了PK3-12在不育/可育条件下花药差异表达蛋白质,并对差异表达蛋白进行了生物信息学分析;进而采用RT-PCR检测了PK3-12在不育/可育条件下花蕾发育进程中差异蛋白编码基因表达量变化。结果表明,高温不育条件下, PK3-12花药形态瘪小,药室有少量败育花粉,育性转换受1对隐性基因控制,表达变化量在2倍以上差异蛋白质点31个,其中增量表达蛋白质点6个,减量表达蛋白质点11个,表达完全抑制蛋白点12个,不育花药特异表达蛋白点2个。质谱鉴定出15个差异蛋白质,参与信号转导通路、二羧基乙醛酸代谢、糖酵解代谢、次生合成代谢、氨基酸生物合成、分支酸生物合成、碳代谢途径等细胞过程。Rubisco亚基连接蛋白编码基因BrrbcL开放读码框(open reading frame, ORF)长度为1095 bp,编码364个氨基酸;与可育花蕾相比,发育进程中不育花蕾BrrbcL基因、膜联蛋白基因(ANN)、BetVI过敏原家族基因(BetVI)表达明显下调,表明上述基因可能参与了温敏不育系PK3-12S育性的转换。     

黏类小麦育性相关基因SSH文库的构建

为了深入研究黏类小麦雄性不育的分子遗传机制, 利用抑制差减杂交技术构建了黏类小麦育性相关基因的cDNA文库。文库质量检测表明, 差减杂交效率较高, 质量较好。在不育和可育cDNA文库中随机挑选120个阳性克隆进行测序, 获得100余条高质量的表达序列标签(EST)。对序列进行BLAST比对及功能注释, 比较了不育和可育cDNA文库的基因表达谱, 发现在可育cDNA文库中参与能量代谢的基因出现频率较高, 在不育cDNA文库中检测到了与花发育调控相关的MADS-box转录因子、细胞凋亡相关的泛素结合酶及阻遏淀粉合成的腺苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶等相关基因。这些基因很可能与育性相关。     

甘蓝型油菜NCa CMS育性相关候选线粒体基因及其受恢复基因的转录调控

用10个线粒体基因为探针, 对NCa不育系、保持系和可育F₁幼蕾的线粒体RNA进行了Northern检测。结果表明，atp6、atp1、cox1、cox2、cob、rrn5S和rrn26S等7个线粒体基因探针在不育系、保持系、可育F₁中的转录没有差异；只有orf222、orf139和atp9等3个探针检测到转录本的差异。orf222和orf139分别在不育系和可育F1中产生相同大小和丰度的转录本，但是在保持系中没有检测到转录本；orf222检测到的3条转录本分别为1.1、0.9和0.6 kb，orf139检测到0.8和0.6 kb 2条带。atp9探针在不育系和保持系中都检测到1条0.6 kb转录本，而在可育F₁中检测到0.6和1.2 kb的转录本。NCa CMS不育的形成可能与orf222、orf139和atp9基因的表达有关；讨论了恢复基因在F₁育性恢复过程中对育性相关候选基因的可能调控方式。     

RFLP analysis of cytoplasmic male-sterile lines of pigeonpea [Cajanus cajan (L.) Millsp.] developed by interspecific crosses

Total DNA from three putative cytoplasmic male sterile (CMS) progenies derived from crosses between the wild species Cajanus sericeus and the cultivated species Cajanus cajan, five C. cajan, one accession of C. sericeus and two genetic male sterile lines of pigeonpea were compared for their RFLP patterns using maize mitochondrial DNA (mtDNA) specific probes. Three putative cytoplasmic male sterile (CMS) progenies from the multiple cross genome transfer of pigeonpea lines (CMS 7–1, CMS 12–3, and CMS 33–1) showed hybridization patterns identical to that of C. sericeus when DNA was digested with EcoRI and HindIII and probed with maize mtDNA clones. The results suggested that these putative CMS progenies have the mitochondria of the female wild species parent. The hybridization patterns of the three male parental lines used in the development of the CMS progenies were similar in all the restriction enzyme-probe combinations except HindIII-atp6. The genetic male sterile lines, MS Prabhat and QMS 1 differed from each other in their hybridization pattern. The genomic DNA hybridization pattern of HindIII digested DNA from ICPL 87 differed from the other pigeonpea lines when probed with the maize mtDNA clones. The cluster analysis of the hybridization data suggested the occurrence of variation in the mitochondrial genome even among the cultivated species. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

玉米2C型丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(PP2C)活性与耐旱性的关系

在先期研究的基础上, 结合运用电子克隆和反转录PCR技术克隆玉米PP2C基因的全长cDNA序列, 再分别应用实时荧光定量PCR和非放射性标记法, 测定干旱胁迫条件下耐旱性不同的自交系PP2C基因的mRNA表达差异和酶活性差异, 以探讨PP2C酶活性与玉米耐旱性的关系。结果表明, 我们克隆的全长cDNA序列为玉米PP2C基因家族的新成员, 开放阅读框长1 164 bp, 编码388个氨基酸残基。将这一基因命名为ZmPP2Ca, GenBank注册号为EF195257。在干旱胁迫条件下, 该基因在耐旱自交系中下调表达, 使PP2C酶活性降低; 在不耐旱自交系中上调表达, 使PP2C酶活性升高。ZmPP2Ca基因的差异表达以及由此引起的PP2C酶活性差异, 可能与干旱胁迫条件下玉米细胞的信号传导有关。     

一个与小麦雄性不育育性转换相关的MADS-box转录因子基因

为了揭示YS型小麦温敏雄性不育育性转换的基础, 构建了该类型不育系A3017的不育和可育幼穗正、反杂交的两个SSH-cDNA文库。经文库比较, 在不育文库中筛选出一个与MADS-box基因同源的EST序列(GenBank登录号: 36925702)。以该EST序列的同源性比对和拼接结果为依据, 设计引物对该基因在可育和不育幼穗中的表达进行了RT-PCR分析, 结果表明, 该基因在不育幼穗中表达量较高, 可育幼穗中表达量很低。对不育幼穗中扩增出的cDNA片段进行克隆测序, 获得了666 bp的cDNA序列。序列分析表明, 该片段编码160个氨基酸, 具有MADS-box转录因子的典型结构域K-box, 被定名为TaMS-MADSbox, 与一个小麦MADS box转录因子基因WAG的氨基酸序列的相似性为94%。进一步以3种不同类型的小麦雄性不育系和保持系的幼穗cDNA为材料, 利用半定量RT-PCR对该基因的表达模式分析发现也存在类似差异, 该基因在不育系幼穗中表达量较高, 而保持系幼穗中表达量较低。以上分析表明, 该MADS-box转录因子基因的表达与小麦雄性不育系的育性转化相关, 表达量高时表现雄性不育, 表达量低时表现雄性可育。     

水稻OsVDAC2基因的克隆及亚细胞定位分析

VDAC（电压依赖性阴离子通道）又称作线粒体孔蛋白,在调节线粒体的代谢和能量功能以及线粒体介导的凋亡中都发挥重要作用。但水稻中VDAC家族的亚细胞定位及其生物学功能尚未清楚。依据NCBI公布的水稻OsVDAC2的ORF序列设计引物,从水稻品种日本晴叶片cDNA中扩增得到目的片段。构建OsVDAC-GFP融合瞬时表达载体,转化水稻原生质体对其进行亚细胞定位。激光共聚焦观察结果表明：水稻OsVDAC2蛋白主要存在于细胞质,为进一步研究其功能奠定了基础。     

花粉致死基因ZmAA1对玉米遗传转化的研究

为了研究花粉致死基因ZmAA1的功能,进而创制转ZmAA1基因玉米不育新材料。在Gen Bank中找到花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47,并在目的片段的上下游设计増加酶切位点,基因合成构建到克隆载体puc57上,采用传统酶切连接的方法构建了植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar,并利用农杆菌介导法转化优良玉米自交系郑58萌动胚。成功构建植物表达载体pCAMBIA3300-Pg47-ZmAA1-35S-bar;共获得94株除草剂抗性植株,其中47株目的片段PCR呈阳性反应,对温室中表现为花粉败育的PCR阳性植株进行目的片段及筛选标记bar基因RT-PCR与蛋白免疫学试纸条检测,结果表明,花粉致死基因ZmAA1及启动子Pg47已经整合到玉米基因组并表达。     

红莲型水稻不育系和保持系线粒体基因组BAC文库的构建

以红莲型(HL)细胞质雄性不育系和保持系为材料, 构建了水稻线粒体基因组的BAC文库. 每个文库保存约2300个菌落, 外源插入片段介于9～25 kb之间. 以线粒体基因为探针对文库进行菌落原位杂交验证, 均筛选到了阳性克隆. 构建的两个文库为进一步研究水稻线粒体基因组的结构特点, 为克隆与红莲型水稻细胞质雄性不育相关的线粒体基     

带遗传标记的玉米基因雄性不育的发现及遗传和利用研究

1992年在玉米族远缘杂交组合3402F3(丹340×403-2)中首次发现带标记性状的基因雄性不育(GMS)材料。 遗传分析结果表明, 不育性受一对隐性基因控制。 当不育株(A)与可育株(B)进行兄妹交, 育性分离比例接近1∶1; 而可育株(B)自交的后代, 可育株与不育株的分离比例为3∶1。 连锁遗传分析结果证明, 不育基因(ms°)与标记性状