以Bar为选择标记的遗传转化体系的建立

Bar基因是转基因商品化作物中应用最多的目标基因,也是水稻遗传转化中应用较多的选择标记基因,因此,建立以Bar基因为选择标记的通用和高效的遗传转化体系非常必要。本研究中,以籼型水稻明恢63为受体,Bar基因作选择标记,采用农杆菌介导的遗传转化法,将Bar基因转入其中,获得了一批转化子,初步建立了稳定、高效的水稻遗传转化体系。随后,以此体系为基础,将装有不同基因的两个载体pBar-1C^＊和pBar-1Ab进行了转化,分别从5400块和4800块愈伤组织中获得156个和115个抗性愈伤,其抗性愈伤率分别为2．8％和2．4％,分化率分别为80．7％和87．8％,由此说明,此转化体系相对稳定,且分化率高、抗性愈伤率也较高,可用于同类选择标记的遗传转化,加快水稻转基因育种步伐。     

根癌农杆菌介导的高效水稻遗传转化影响因素

根癌农杆菌介导的水稻遗传转化影响因素主要有农杆菌菌株和载体、水稻基因型、转化受体、共培养条件、选择标记基因和转化程序等。对影响农杆菌介导水稻基因转化效率的以上各种因素进行了综述,并对转化过程中存在的问题进行了讨论。     

影响农杆菌转化水稻的主要因素

文章概述了影响农杆菌转化水稻的主要因子：外植体、培养基、农杆菌菌株和载体、选择标记基因、水稻基因型、及Vir区基因诱导因子。     

水稻叶色突变体研究进展

光合作用是水稻生长发育的生理基础,叶片是水稻进行光能转化的主要组织,水稻叶色突变在一定程度上间接影响水稻产量。创制水稻新的叶色突变体,解析其基因突变的分子机制对水稻的功能基因组学研究和杂交水稻育种具有重要意义。本研究从已定位和克隆的部分叶色基因综述了水稻叶色突变体分类、产生、基因突变的分子机制(包括叶绿素合成与代谢途径,叶绿体发育途径以及其他途径)、水稻叶色突变体的应用与展望,并归纳了部分叶色基因在突变体中的表达情况,将有助于研究水稻光合作用途径和机制。     

一种水稻真空渗透转化装置及方法的研究

探究适用于水稻的真空渗透转化装置及方法,旨在解决目前水稻转基因效率低、转化体变异多、周期长等问题。以抽穗期的‘云资粳41号’幼穗作为受体,应用自制的水稻真空渗透装置对其短暂抽真空渗透浸染导入外源基因。本试验共计转化水稻30株,收获19860粒T0代种子。研究发现不同浓度除草剂对T0代种子的萌发影响不显著,但对T1代材料的生长发育却具有明显抑制作用,因此选择苗期喷施法进行抗性转化子筛选,最佳筛选浓度为20 mg/L。经除草剂抗性筛选,获得抗性苗135株。经PCR分子检测,最终获得阳性苗114株,表明外源DNA已成功导入到受体水稻基因组中。本研究首次应用真空渗透法快速实现了水稻外源基因的转化,为水稻及其他作物的基因转化提供了一种快速、有效的新装置和新途径。     

利用共转化方法创制携带Pi9抗稻瘟病基因的无选择标记转基因水稻

水稻稻瘟病是由子囊菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻灾害性病害。培育抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的措施之一。水稻Pi9抗稻瘟病基因来源于小粒野生稻并已被克隆和应用于转基因育种。为了提高无选择标记转基因植株的选择效率,将绿色荧光蛋白(GFP)用作可视遗传标记,对双菌株共转化系统进行改良:目的基因载体携带Pi9抗稻瘟病基因;标记基因载体用潮霉素磷酸转移酶(HPT)作为植物转化选择标记,用GFP作为负选择标记,筛除标记基因分离植株。两种载体的农杆菌转化株混合,分别与水稻品种‘浙恢414’、‘浙粳22’、‘浙11B’、‘日本晴’、‘空育131’和‘粤泰B’的愈伤组织共培养,然后从5%~38.3%的起始愈伤组织筛选获得了转化愈伤组织(HPT+GFP+)。对T0植株进行Pi9基因PCR检测,11.8%~77.8%的T0植株为共转化植株(HPT+GFP+Pi9+)。对共转化植株T1代进行绿色荧光检测,筛选阴性植株(GFP-),再通过PCR筛选Pi9+植株。根据13个T1群体的研究结果,61%的共转化植株在T1代分离出无选择标记转基因植株(HPT-GFP-Pi9+)。转Pi9的无选择标记植株和后代株系对水稻稻瘟病呈抗病反应。因此,本研究通过GFP标记提高了双菌株共转化系统的选择效率,转Pi9的无选择标记水稻株系为水稻抗稻瘟病育种提供了有用的遗传资源。     

根癌农杆菌介导水稻遗传转化研究进展及展望

自1994年建立了农杆菌介导的粳稻高效遗传转化体系以来,在短短十几年里取得了飞速发展。概述了农杆菌介导水稻遗传转化的研究历史和原理、影响农杆菌介导水稻转化体系的重要因素、转基因水稻的特点和外源基因的稳定性,并探讨了农杆菌介导水稻遗传转化研究中存在的问题与对策。     

农杆菌介导遗传转化在水稻基因工程育种中的应用

随着生物技术的发展，水稻基因工程育种在水稻育种中发挥着越来越重要的作用。在诸多的转基因方法中，农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，以其独特优点而倍受重视。本文概述了农杆菌介导转化水稻的原理，农杆菌介导转化水稻的优点并且介绍了农杆菌菌株、受体材料和培养基成分的不同对农杆菌介导转化水稻的影响。另外对农杆菌介导遗传转化在水稻抗虫基因工程育种、抗病基因工程育种、抗逆基因工程育种、优质基因工程育种、耐除草剂基因工程育种及提高水稻光合效率和延缓衰老方面的研究进展进行了综述。最后对农杆菌介导遗传转化在水稻基因工程育种中存在的问题和发展前景做了简要说明。     

利用CRISPR/Cas9技术定向编辑水稻过氧化氢酶基因OsCAT

过氧化氢酶(catalase,CAT)作为重要的抗氧化酶,可催化细胞内过氧化氢的分解,为了研究水稻过氧化氢酶基因OsCAT2的功能,首先根据在线软件http://crispr.mit.edu/搜寻向导sg RNA序列,选择OsCAT2基因第三外显子上的"GTGGAGAACCGAACAATAACTGG"作为目标靶序列,然后构建了OsCAT2的CRISPR/Cas9载体BGK03-OsCAT2,将目的载体转化水稻粳稻9522后共获得了7个独立的转基因株系,其中包括在PAM附近发生编辑的独立转基因株系2个,编辑方式主要表现为缺失和错配。与野生型相比,转基因植株较矮、分蘖数增加、叶片呈明显的病叶状、成熟时期育性明显降低,这为深入研究水稻OsCAT2基因的作用机制提供了帮助。     

农杆菌介导McCHIT1基因遗传转化水稻茎尖研究

为了提高农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化效率,笔者以贵州特有的地方水稻品种‘平塘黑糯’茎尖为材料,以含有Ubiqutin启动子驱动苦瓜几丁质酶基因McCHIT1表达的植物表达载体p Cambia-UbiMcCHIT1为转化载体,采用正交试验设计,系统研究了菌液OD600值、真空处理时间和真空渗透压强对水稻茎尖遗传转化效率的影响。结果表明:在3个因素中,真空处理时间是影响水稻转化效率和死亡率的最关键因素。农杆菌介导‘平塘黑糯’茎尖遗传转化的最优条件为农杆菌菌液浓度OD600为1.0、真空处理时间为7 min、真空渗透压强为15 k Pa。GUS组织化学染色和PCR分子鉴定表明,通过本研究优化的农杆菌介导水稻茎尖遗传转化体系,已将苦瓜的几丁质酶基因McCHIT1已整合到水稻基因组中,获得转McCHIT1基因‘平塘黑糯’新种质。     

农杆菌介导贵州平塘黑糯茎尖转化获得转McCHIT1基因水稻研究

为了提高农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化效率,笔者以贵州特有的地方水稻品种‘平塘黑糯’茎尖为材料,以含有Ubiqutin 启动子驱动苦瓜几丁质酶基因McCHIT1 表达的植物表达载体pCambia-Ubi-McCHIT1 为转化载体,采用正交试验设计,系统研究了菌液OD600值、真空处理时间和真空渗透压强对水稻茎尖遗传转化效率的影响。结果表明：在3 个因素中,真空处理时间是影响水稻转化效率和死亡率的最关键因素。农杆菌介导‘平塘黑糯’茎尖遗传转化的最优条件为农杆菌菌液浓度OD600为1.0、真空处理时间为7 min、真空渗透压强为15 kPa。GUS组织化学染色和PCR分子鉴定表明,通过本研究优化的农杆菌介导水稻茎尖遗传转化体系,已将苦瓜的几丁质酶基因McCHIT1 已整合到水稻基因组中,获得转McCHIT1基因‘平塘黑糯’新种质。     

抗水稻黑条矮缩病RNA干扰载体的构建及遗传转化

水稻黑条矮缩病是由水稻黑条矮缩病毒引起的水稻病害,该病可导致病株生长迟缓、矮化、抽穗结实困难,严重影响了水稻的生产。在水稻黑条矮缩病毒基因组不同双链RNA序列的基础上,分别设计了5对特异性引物,通过RT-PCR获得了相应片段,结合基因沉默的方法,分别构建RNA干扰载体,并进一步将发夹结构构建入以玉米泛素Ubi为启动子、以bar基因为选择标记的改造后的植物双元表达载体pCA1300-Ubi中,经农杆菌介导对黄淮稻区主栽水稻品种圣稻13进行遗传转化,成功获得了5个含有水稻黑条矮缩病干扰片段的植物双元表达载体,经农杆菌介导获得了部分水稻转化植株。旨在为下一步对水稻黑条矮缩病的研究及抗病水稻新品种的培育提供材料。     

除草剂抗性基因bar导人烟草叶绿体

将编码Phosphinothricin acetyltrans ferase的bar基因与水稻叶绿体psbA基因的启动子和终止子构建成表达盒,连同烟草叶绿体基因组同源片段rpl2-trnH-psbA和trnK-ORF509A以及选择标记基因aadA一起构建成烟草叶绿体转化载体pTZBA。基因枪法转化烟草叶片,经壮观霉素筛选获得转化再生植株。分别以1.0 kb的叶绿体同源片段trnK-OR     

水稻常用的遗传转化技术及应用现状

1988年，三个独立的研究小组 率先报道获得了转基因水稻植株（Toriyama等,1988，Zhang,等,1988，Zhang等, 1988）。 十多年来，基因转移技术体系的建立一直是转基因水稻研究的重点。 在遗传转化技术应用方面，前期以采用原生质体为材料的PEG法和电激法为主，但原生质体 培养及再生对基因型依赖很大，转基因株育性较低；中期基因枪法得到了很大发展，迄今还 是单子叶植物首选的基因转化方法之一；而自90年代中期以来，农杆菌介导法在水稻基因转 移中日趋成熟，Hiei等（1994）创造的高效转化技术，首次证实了利用农杆菌转化水稻的 可行性，之后该法得到了广泛的应用。目前，水稻转化中应用比较普遍的方法有基因枪介导 法和农杆菌介导法。     

CRISPR/Cas9介导靶向敲除水稻过氧化氢酶基因OsCAT

过氧化氢酶(catalase,CAT)作为重要的抗氧化酶,可催化细胞内过氧化氢的分解。为了研究水稻过氧化氢酶基因OsCAT3的功能,选择目的基因第二外显子上的"CTCGTTCAACGGCCCGCTGTGG"作为目标靶序列,构建了OsCAT3的CRISPR/CAS9载体,将目的载体转化水稻粳稻‘9522’后获得在PAM附近发生编辑的独立转基因株系,编辑方式主要表现为缺失和错配。与野生型相比,转基因植株呈现生长矮小、不分蘖、叶片呈明显的病叶状表型,这为深入研究水稻OsCAT3基因的作用机制提供了帮助。     

CRISPR/Cas9技术编辑RMS2基因及其利用

水稻雄性不育是杂交水稻杂种优势利用的基础。为了推动粳型第三代杂交水稻育制种技术的发展,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对普通隐性核雄性不育基因RMS2进行定点编辑。根据CRISPR/Cas9基因编辑原理,以RMS2作为靶标基因,在基因第一和第二外显子分别选择正反向靶位点,在NCBI数据库利用BLAST工具分析靶位点特异性,最终构建一个双靶点的CRISPR/Cas9敲除载体。以粳稻品种‘中花11’作为受体,使用农杆菌遗传转化法转化受体获得21株T0代转化苗,通过对潮霉素抗性基因进行检测获得17株阳性苗。对17株阳性苗的2个靶位点分别进行测序分析,有13株在靶位点1发生编辑,突变频率为76.4%。全部植株都在靶位点2被成功编辑,突变频率为100%。不同靶位点发生的突变样式有较大差异。设计InDel标记用于重点株系10的分子标记辅助选择育种,最终获得无T-DNA成分的普通粳稻核不育系。本研究创制的新的rms2突变体和不含转基因成分的rms2粳稻不育系,不仅丰富了rms2的突变类型,也为进一步研究GDSL脂肪酶功能和粳型第三代杂交水稻创制了重要的材料。     

无选择标记基因的优质香稻新品系培育

香味是稻米食味品质的主要性状之一,为培育无抗性选择标记基因的优质香稻新品系,以携带有超双元载体OSBADH2-RNAi的农杆菌菌株EHA105介导,将OSBADH2基因的RNA干扰结构和潮霉素抗性选择标记(HPT)基因同时导入优质粳稻武育粳3号成熟胚来源的愈伤组织中,经过在含有潮霉素的培养基上筛选和分化,获得了54个独立转化子,其中36个转化子同时含目的基因和HPT基因,共转化频率为66.7%;从这些转化子的后代中共筛选获得25个去除HPT基因的转化子,去标记频率为69.4%;通过KOH法等4种方法进行香味的鉴定,获得15个具有香味的株系。实时定量PCR分析结果表明,具香味株系中的OSBADH2基因的表达受到了明显抑制,进一步证明了香味的产生是由于OSBADH2基因被干扰而引起。农艺性状调查表明,抑制OSBADH2基因的表达对水稻产量相关性状,包括株高、千粒质量、穗粒数和结实率影响不明显。     

利用CRISPR/Cas9技术获得水稻恢复系Bsr-d1基因突变体

为研究水稻抗稻瘟病基因Bsr-d1在杂交水稻恢复系中的功能,我们利用CRISPR/Cas9定点基因编辑方法,设计2个敲除靶标位点,构建了Bsr-d1基因编辑载体,并通过农杆菌介导的方法转化水稻恢复系品种‘GH998’,成功获得了转基因植株,并在T1代筛选到4个无转基因成分的纯合突变株系。纯合突变株系有4种突变类型,包括第199号碱基处缺失17个碱基、第212号碱基处缺失4个碱基、第216号碱基处插入1个碱基、第216号碱基处插入2个碱基突变类型。通过蛋白序列分析,发现纯合突变株系都存在移码现象导致氨基酸变化并提前终止翻译。本研究成功利用CRISPR/Cas9基因编辑方法敲除水稻恢复系‘GH998’中Bsr-d1基因,获得无转基因成分的纯合突变株系,为进一步研究Bsr-d1基因在杂交水稻上的功能提供了理论依据和品种资源。     

无抗性选择标记转基因软米和糯稻新品系的选育及中间试验

直链淀粉含量是影响稻米品质的最重要因素之一。为培育直链淀粉含量较低的软米和糯稻新品系,在经共转化法获得的转反义Wx基因水稻自交后代中筛选获得国不含抗性选择标记基因的纯合体.对这些纯合转基因水稻的分析表明,其未成熟种子胚乳中Wx基因表达水平和成熟种子中Wx蛋白量较未转化对照有不同程度的降低。转基因水稻成熟种子中直链淀粉含量较未转化对照有不同程度的下降,2个转基因系降低至10%左右,相当于软米的直链淀粉含量,1个转基因系降到了2%以下,形成了糯稻新品系。转基因稻米中直链淀粉含量降低后,其胶稠度相应变软,而糊化温度未发生明显改变。田间试验结果表明,转基因水稻的大部分农艺性状与受体品种武香粳9号无显著差异。因此,本研究成功培育了无抗性选择标记且淀粉品质改良的转反义Wx基因水稻新品系。     

稻瘟病抗性位点Pik-InDel分子标记开发及其在育种上的应用

水稻Pik位点含有至少6个抗病基因,它们都包含在该位点功能区域中。因此,有效区分出功能区域是鉴定该基因座功能基因的首要条件。本研究通过对水稻抗稻瘟病Pik基因座上已克隆的功能基因,包括Pik、Pi-k~p、Pi-k~h、Pi-1、Pi-k~m和Pi-k~s及非功能基因序列的相互对比,鉴定到Pik基因座特异的核苷酸差异,开发了基于PCR技术的Pik基因座的插入/缺失(insert-deletion, InDel)标记,能有效地将Pik上功能基因与其它非功能基因的基因座区分开。利用Pik基因座的分离群体进行标记选择与接种鉴定,结果表明Pik-InDel标记能精确的选择出Pik功能基因座。用Pik-InDel标记对20份重要水稻不育系进行分子检测,该标记能准确地将抗性基因座与其它非抗病基因座区分开来,这为筛选水稻稻瘟病抗性种质资源,以及抗性标记辅助抗病育种提供了便利。