Prd29A启动子在小麦中的诱导表达活性及大肠杆菌海藻糖合成酶基因的转化

以gus基因为报告基因，通过瞬时表达测定了Prd29A诱导型启动子在小麦愈伤组织中的诱导表达活性。结果表明，Prd29A-gus基因的表达水平可在不同浓度NaCl盐的胁迫条件下得到显著提高。由此证实，Prd29A启动子在小麦中具有较强的诱导表达活性。在此基础上，将Prd29A诱导型启动子驱动下的大肠杆菌海藻糖合成酶基因（otsA）采用花粉管途径导入目的小麦品系，经PCR筛选、Southern鉴定及转化后代海藻糖含量的测定，获得了一批otsA转基因植株及株系，为进一步选育耐盐抗旱的转基因小麦新品系奠定了基础．     

斜纹夜蛾核多角体病毒（SpltNPV）碱性核酸外切酶基因的序列分析

斜纹夜蛾核多角体病毒碱性核酸外切酶基因（alk-exo)定位于基因组的XbaI-I片段上，克隆并测序确定了alk-exo全序列：SpltNPV碱性核酸久切酶基因的完整的读码框为1227个核苷酸。编码一长为408个氨基酸的蛋白质。在距起始密码子ATG上游－37位、－80位各有一个启动子基序TATA框，在－28位有杆状病毒晚期基因的启动子基序TAAG，在ORF终止区有加尾信号poly(A)序列AATAAA。根据核苷酸序列推导的蛋白质的分子量为47kD，等电点为8．9，在296－312位氨基酸存在有一预期跨膜区，其中心位于304位的丙氨酸（GFYYSFGALVCVFCMK）。SpltNPV的alk-exo氨基酸序列与其它8种杆状病毒的alk-exo同源性在37％－43％之间，且与疱疹病毒的alk-exo基因有一定的同源性，通过对8种杆状病毒和疱疹病毒的alk-exo序列比较发现了5个保守区。     

高等植物基因上游可译框架（uORF）的分析

真核生物mRNA 5’非编码区上游可译框(uORF)在基因翻译水平上的调控具有重要作用。对植物2200多个cDNA序列5’非编码区的uATG和uORF进行统计分析，结果表明，含uATG的基因高达18％，这一比例比估计的10％要高得多，其中含单个uATG的基因约占50％，含2个uATG的基因占20％左右；大部分uORF属于非交叉uORF，约占85％：编码1～5氨基酸的uORF占30％以上，大部分uORF编码多肽小于20个氨基酸，占77．6％；mRNAORF起始密码子ATG的两边序列有显著的偏爱性，与植物共有序列UAAACAAUGGCU或AACAAUGGC基本一致，但有uATG的mRNA ORF起始密码子ATG的两边序列比不含uATG的mRNA ORF起始密码子ATG的两边序列偏爱性要差。大多数uATG两边序列缺乏植物ORF起始密码子ATG的两边序列的偏爱性。不同种属mRNA5’非编码区uORF氨基酸并不具有显著的同源性，如果植物S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶等少数基因具有非常保守的uORF，氨基酸序列同源性高达75％～100％，显著高于植物S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶之间的同源性。     

山羊IL-2基因cDNA的克隆、鉴定及序列分析

根据GenBank发表的山羊（Capra hircus)IL-2基因序列，设计了一对引物。以ConA刺激的外周血淋巴细胞为材料用RT－PCR的方法。从总RNA中扩增出山羊IL－2基因。琼脂糖电泳显示扩增片段约为500bp。分离纯化片段，克隆入表达质粒pBV220，经酶切鉴定，测序结果显示，克隆的山羊IL－2基因与GenBank上发表的序列一致。该序列与绵羊（Ovis aries)和牛(Bas taurus)的IL－2基因序列同源性最大，在96％以上，氨基酸和抗原性比较分析认为，山羊IL－2与绵羊及牛的IL－2在这两方面有较大的同源性。     

猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因在Hela细胞中的表达及表达蛋白的定位

猪圆环病毒（Porcine circovims，PCV）属于环状病毒属，该病毒无囊膜，基因组为单链环状DNA，大小约为1．7kb，编码2个主要的开放阅读框架：ORF1和ORF2，ORF2编码病毒的核衣壳蛋白（Nawagitgul et al，2000），可能在PCV2病毒致病方面具有重要的作用。PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）．给养猪业带来了巨大的经济损失。分别用ORF2基因的亚单位疫苗免疫猪、核酸疫苗免疫小白鼠，均具有良好的效果（Blanchard et al，2003；Kamstrup et al，2004）。关于PCV2疫苗的研究在我国尚未处报道。本实验在异源启动子CMV下实现了ORF2在真核细胞中的表达。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5基因的融合表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus , PRRSV)ORF5基因的核苷酸序列设计3对特异性引物，从重组质粒pMD- ORF5中扩增去除ORF5基因中包括全部信号肽在内的N端跨膜区(28 residues)和中部跨膜区(60 residues)。改造后的ORF5基因分别命名为ORF5-1和 ORF5-2。将2个基因片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-ORF5-1和pET-ORF5-2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达和SDS-PAGE电泳分析，ORF5-1和ORF5-2基因获得融合表达，表达量分别为12.2%和39%，证明删除双跨膜区能明显提高ORF5基因的表达量。经Western blot分析，融合蛋白具有一定的免疫学活性，表明摘除跨膜区对该蛋白的抗原性影响不大。     

巴西固氮螺菌Yu62glnZ基因及其相邻基因的克隆和序列分析

通过原位杂交从巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense)Yu62的基因组文库中获得glnZ基因的阳性克隆，对该阳性克隆进行亚克隆和序列分析，结果表明glnZ基因位于3.7kb的SaLI片段上，glnZ基因编码区长336bp，编码的产物是Pz蛋白，由112个氨基酸组成，分子量为1.12kD。用Blastax软件对Pz蛋白的氨基酸序列在GenBank数据库中进行同源比较，结果表明Pz蛋白与其它几种固氮菌及大肠杆菌的GlnK蛋白的同源性（identities）达66％以上；与PⅡ蛋白的同源性达64％以上。glnZ基因上游是部分ubiH-like基因，与E.coli ubjH基因（编码辅酶Q，ubiquinone)N－端有31％的同源性（identity）和50％相似性（similarity)；glnZ基因下游是aat-like基因，与E.coli和Bacillus subtilis aat基因（编码天冬氨酸氨基转移酶，aspartate aminotransferase)有同源性和相似性都为26％和42％；aat-like基因下游是部分ftsK-like基因，与E.coli ftsK基因（编码肽聚糖，peptidoglycan)N-端有42％同源性和56％相似性，这几个基因在GenBank中的登录呈是AF279917。     

朝鲜碱茅抗坏血酸过氧化物酶的基因克隆和表达

本研究从朝鲜碱茅叶cDNA文库分离得到序列长1125bp,开放读码框ORF区876bp,编码291个氨基酸的抗坏血酸过氧化物酶基因（PutAPx）全长cDNA。推测的编码蛋白质的相对分子质量和等电点分别为32kD和7．71。同源性比较发现,PutAPx基因与禾本科5个物种（水稻、大麦、小麦、黑麦草和玉米）在氨基酸水平上具有高度（89．7％,94．3％,94．2％,50．7％和79．6％）的同源性。系统发育树显示朝鲜碱茅与大麦、小麦遗传距离最近,跨膜结构与亚细胞定位表明为过氧化物体APX。将该基因构建到酵母表达载体pYES2-PutAPx,并导入酵母IVSCI菌株后在半乳糖的诱导下分析具有抗氧化性。本研究成功克隆了抗坏血酸过氧化物酶基因（PutAPx）编码区,并做了初步分析,为进一步研究逆境诱导的氧化胁迫的作用机理研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的变异分析

从河北、江西猪场中分离到3株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HB-1(sh)／2002、HB-2(sh)／2002和JX-1／2002)。采用RT-PCR方法扩增其完整的ORF5基因片段，进行了序列测定，并与其它5个国内毒株的ORF5基因序列进行了比较和变异分析。所有这些毒株的ORF5基因均编码200个氨基酸，推导的氨基酸相似性在88．2％～99．0％之间。其中BJ4、S1及J1间的相似性较高，在98％～99％之间；HB-1(sh)／2002，HB-2(sh)／2002，JX-1／2002及CH-1a间的相似性为92％～96％之间。根据ORF5基因核苷酸序列的遗传进化距离，这些毒株可分为两个亚群，BJ4、S1和J1为一个亚群，与VR2332及疫苗毒株接近；HB-1(sh)／2002、HB-2(sh)／2002、JX-1／2002和CH-1a为另一个亚群。     

水稻黑条矮缩病毒玉米分离物基因组S8和S9的序列分析及其原核表达

通过RT-PCR获得了玉米粗缩病病毒湖北分离物(Hbm)基因片段S8和S9的全长cDNA克隆，并测定了它们的全序列。S8全长1936bp，其编码链只含1个ORF，编码1个由591个氨基酸组成、分子量约为68kD蛋白；S9全长l900bp，含有两个非重叠的ORF，分别编码由347个和209个氨基酸组成、分子量分别约为40kD和24kD蛋白。序列分析表明，Hbm-S8和S9与水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)中国不同分离物之间的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94．4％～98．9％和96．0％~99．0％，且与日本RBSDV的序列同源性高于与玉米粗缩病毒相应片段的序列同源性，进一步证明了引起我国玉米粗缩病的病原为RBSDV。SDS-PAGE分析表明，经IPTG诱导，RBSDV8和9编码的蛋白可在大肠杆菌(Escherichia coil)中高效表达。以这些蛋白为抗原，制备了抗血清。用Western blot方法在感病的玉米(Zea mays)植株中可检测到RBSDV-Hbm S8和S9 ORF1编码的蛋白。     

Speciation of thermotolerant Campylobacter isolates involved in foodborne disease by means of DNA restriction analysis and molecular probes

The molecular identification of several strains of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli involved in foodborne disease was carried out by investigating the restriction profiles of their chromosomal DNA and by DNA/DNA hybridization. Cleavage with EcoRV allowed the visualization of a 3 kb DNA fragment characteristic of C. jejuni, whereas restriction with ClaI allowed the identification of a 9.3 kb DNA fragment, also characteristic of C. jejuni, and a DNA duplet of 9.5-10 kb, specific to C. coli.Restriction analysis with enzyme BglII allowed the visualization of DNA fragments of 3.5, 4, and 6.7 kb, characteristic of C. jejuni. C. jejuni subsp. doylei strains investigated shared a higher genetic homology among themselves-as determined by DNA/DNA hybridization-than with C. jejuni subsp. jejuni. A DNA probe, initially designed by Korolik et al. (Korolik, V.; Coloe, P. J.; Krishnapillai, V. J. Gen. Microbiol. 1988, 134, 521-529), including a DNA fragment encoding an antigenic membrane protein of 31.5 kDa in C. jejuni, when used as probe, allowed the specific identification of all strains of C. jejuni through the detection of strong hybridization signals in two BglII DNA fragments of 2.3 and 2.5 kb, which were not observed in C. coli. Cleavage of chromosomal DNA with BglII-either alone or coupled with probing assays with specific probes-proved to be a valuable tool for the speciation of Campylobacter isolates involved in foodborne disease.     

鹅细小病毒vp1基因片段的原核表达及抗血清的制备

利用PCR技术扩增了鹅细小病毒(Goose parvovirus , GPV)HG5/82株vp1基因5'端长662 bp的基因片段，将其克隆到pMD18-T Simple载体后，转化入大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α细胞。筛选阳性质粒，并通过BamHⅠ和Hind Ⅲ将外源基因定向克隆到原核表达载体pPROEXTMHTb，所得的阳性重组质粒经序列测定，证明外源片段正确插入到pPROEXTMHTb的预期位置。将转入外源基因的工程菌经0.6 mmol/L IPTG诱导，SDS-PAGE电泳表明， 外源基因表达，融合蛋白分子量约为32 kD。通过薄层扫描分析显示，融合蛋白表达量占工程菌菌体总蛋白的22.8%。经诱导后的工程菌用6 mol/L盐酸胍裂解，再经超声处理后离心，用镍离子亲和树脂对裂解产物的上清进行纯化。纯化所得的融合蛋白免疫白兔，制备了兔抗鹅细小病毒结构蛋白的抗血清。Western blot结果表明，抗血清与表达的融合蛋白及亲本病毒的VP1和VP2都具有反应性。     

Cloning of Heart-type Fatty Acid-binding Protein (H-FABP ) Gene of Swine and Difference of Its Expression at Different Stages

从1, 30, 50, 70和90 kg左右的杜长大猪肌肉组织中提取基因组RNA，用RT-PCR扩增猪心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP）基因，获得1条211 bp的片段，以pGEM-T 为载体，将该基因片段克隆到大肠杆菌(Escherichia coli ) DH5α中。从筛选到的阳性克隆中分离出脂肪酸结合蛋白基因，测定其序列。分析表明,该片段为脂肪酸结合蛋白基因cDNA的部分序列，与已报道的猪肌肉组织中的H-FABP cDNA部分序列同源性达到99%。以H-FABP基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT-PCR法，以18S rRNA为内标，研究不同生长阶段猪肌肉组织中H-FABP基因表达的差异。结果表明，从出生到50 kg，猪H-FABP基因表达呈下降趋势；50～90 kg阶段, H-FABP基因的表达又有所上升。     

玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因的克隆与表达

玉米大斑病菌（Setosphearia turcica）属半知菌亚门丝状真菌，是严重威胁玉米生产的重要植物病原真菌。本研究克隆了玉米大斑病菌G蛋白β亚基编码基因Stgb-1。Stgb-1基因全长1296bp，由5个外显子和4个内含子组成；开放阅读框（ORF）为1056bp，编码351个氨基酸，蛋白质计算分子量为39.081kDa。STGB1蛋白推导氨基酸序列与Cochliobolus heterostrophus（100%）、Cryphonectria parasitica（80%）、Aspergillus fumigatus（81%）等丝状真菌的G蛋白β亚基编码基因均具有较高的同源性。同时，利用RACE技术和Genomic Walking技术获得了Stgb-1基因3’-末端cDNA和DNA的3’端侧翼序列，BlastN结果表明其cDNA 3’-UTR为136bp，poly(A)由9个A构成。此外，构建了pET28a-Stgb-1原核表达载体，SDS-PAGE检测和Western blot鉴定结果表明，目的蛋白在E.coli BL21菌株中已成功实现了诱导表达，为进一步研究蛋白结构与功能的关系奠定了基础。     

OsUgp2和otsAB基因共转化增强水稻抗旱抗寒能力

本研究通过农杆菌介导的转化技术,将水稻尿苷-2磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基N（OsUgp2）与大肠杆菌海藻糖-6-磷酸合成酶／海藻糖-6-磷酸合成酶磷脂酶融合基因（otsAB）共表达载体转化水稻愈伤组织,对获得的转基因植株分别进行干旱和寒冷处理,试图明确0sUgp2和otsAB共表达是否可以进一步提高转基因水稻植株的抗胁迫能力。表型观察结果显示0sUgp2和。拈AB共表达植株（ABu）经干旱和寒冷处理后恢复生长的能力,较otsAB和OsUgp2分别过量表达的转化植株（AB和U）均有所提高。定量PCR检测结果显示：经干旱处理后,转化植株ABU中0tsAB和OsUgp2的表达量较未处理植株分别提高1．92倍和1．67倍,与转化植株AB和I中0tsAB和OsUgp2表达的增加量相近;而寒冷处理后,转化植株ABU中otsAB和OsUgp2的表达量分别增加2．68倍和2．04倍,明显高于转化植株AB和u中otsAB和OsUgp2表达的增加量。液相色谱检测结果显示：OsUgp2和otsAB共表达和单表达均可以提高转化植株中海藻糖的生物合成量,且共转化植株ABU中海藻糖的含量在干旱和寒冷处理前后均是最高的。干旱和寒冷处理后,共转化植株ABU中蔗糖含量的增加也较明显。本研究结果表明OsUgp2和otsAB共表达可以增加转基因水稻植株中海藻糖和蔗糖分子的含量,同时转基因水稻植株的抗旱和耐冷胁迫的能力也得到了一定提高。     

长穗偃麦草HKT1;4基因片段的克隆及序列分析

根据已报道的其他植物高亲和钾离子转运蛋白（HKT1;4）基因的保守序列设计一对简并性引物,以长穗偃麦草幼根总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆出长穗偃麦草HKT1;4,基因命名为EeHKT1;4。结果表明：该基因片段长度为614 bp,编码204个氨基酸,所得序列与其他植物氨基酸序列同源性均在80%以上,特别是和一粒小麦TmHKT1;4氨基酸同源性高达92%。这为长穗偃麦草HKT1;4全长基因的克隆及其耐盐分子机制的研究奠定基础。     

牛杀菌/通透性增加蛋白氮端片段的原核表达

目的 克隆牛杀菌/通透性增强蛋白(BPI)N端cDNA,构建原核表达载体,在大肠杆菌中表达BPI蛋白,并纯化重组蛋白。方法 参照Genbank报道的序列,应用RT-PCR技术,从牛嗜中性粒细胞mRNA中扩增出杀菌/通透性增加蛋白基因,然后将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-1中,重组质粒转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。结果 获得BPI N端长度为714 bp的基因片断,序列分析证实该片断中有1个点突变。大肠杆菌中的表达产物为相对分子质量约为52×103的GST-BPI融合蛋白。结论 成功的表达和纯化了BPI重组蛋白。     

重组海参溶菌酶C端基因(SjLys-C)的可溶性表达和抑菌活性分析

为进一步研究海参(Stichopus japonicus)溶菌酶基因(Sjys)(Genbank登录号:EF036468)中不司片段表达产物的生物特性,本研究通过对其cDNA片段的分析,发现C端基因区域所对应的蛋白质序列中含有非酶活性.根据已知的海参溶菌酶的cDNA序列,设计山含有Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的特异性引物,从新鲜的海参肠中提取总RNA,以其为模板利用RT-PCR扩增出长度为259 bp的溶菌酶C端(SjLys-C)基因.将该目的基因连接到pET-32a(+)载体上,构建重组质粒pET-32a(+)-SjLys-C,再转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)pLysS,成功地构建了重组蛋白SjLys-C的基因工程菌.利用该工程菌诱导发酵,结果显示它能高效表达出26 kD左右的重组蚩白SjLys-C.经过Western blot分析,该重组蛋白在26 kD左右能够与Penta-His抗体发生特异性免疫反应.对纯化的重组蛋白SjLys-C进行了抑菌特性的分析,结果发现它对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和副溶血弧菌(Vibrio parahae molytic us)有较高的抑菌活性.此外,将该重组蛋白经100℃、40 min处理后,其抑菌能力提高了5％～21％.研究结果表明,重组蛋白SjLys-C基因工程菌能够制备出具有可溶性的、并具有抑菌活性的重组蛋白SjLys-C,在农业和医药等行业中有潜在应用和开发价值.     

鹅脂联素基因的克隆、序列分析及组织表达

根据GenBank发表的鸡和鸭等物种的脂联素基因序列的同源保守区域,设计了3对特异性引物,以鹅(Anser domeatica)血液基因组DNA为模板,经扩增、测序及拼接得到了部分DNA序列,全长1062bp,包含2个外显子和1个内含子(GenBank Accession No.EU370686)。该基因编码区长738bp,编码245个氨基酸,编码区核苷酸序列及所编码氨基酸序列与鸭的同源性最高,分别为94.85%和95.51%,与鸡的同源性次之,而与哺乳类的同源性较低。蛋白预测的分子量和等电点分别为26603.3D和5.19,与鸡、鸭、人及小鼠的脂联素蛋白相似。半定量PCR结果显示鹅脂联素基因在骨骼肌、脂肪、心脏和肌胃中高度表达,在小肠、腺胃、肾和肺中中度表达,而在肝脏、脾、卵巢和间脑中低度表达。