利用cDNA-AFLP技术分析炭疽菌危害诱导茶树的差异表达基因

应用cDNA-AFLP技术筛选炭疽菌（Colletotrichum sp.1）危害诱导茶树毛蟹品种（Camellia sinensis cv. Maoxie）的差异表达基因,为探究茶树抗炭疽菌的分子机制奠定基础。利用256对选择性扩增引物组合分析病菌接种后0 h和48 h的叶片cDNA,经筛选、测序和BLAST比对获得136条差异表达片段（TDFs）。同源基因功能分析结果表明,128条TDFs与Nr数据库已有基因同源,其功能以胁迫响应、生物调控与信号转导为主;其中51条TDFs与TPIA数据库中冷害、干旱、盐碱条件下的差异表达基因高度同源。进一步对27条TDFs进行qRT-PCR验证,结果显示,有24条TDFs的表达情况与cDNA-AFLP的结果一致,WRKY转录因子、乙烯响应转录因子、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等抗逆相关基因的表达显著上调。本试验通过筛选获得差异表达的抗逆相关基因,为后续的基因功能研究奠定基础。     

利用基因芯片筛选茶树芽叶紫化相关基因

采用基因芯片技术对龙井群体中紫芽资源和绿芽资源进行分析,探索茶树紫化相关的差异表达基因。结果检测到差异表达基因43个,其中上调表达基因17个,下调表达基因26个。以基因芯片中紫芽资源上调基因TC0002e03和下调基因TL016D09、TL011D06,及不变基因TL022H08、TL024B05为材料,用实时荧光定量方法验证基因芯片的结果,二者完全相符。根据基因芯片的实验结果,采用数据库查询方式对43个差异表达基因进行功能注释,结果表明差异表达基因主要与能量代谢、次生代谢和转录调控等分子功能有关,特别是在差异表达基因中还包含两个与花青素代谢途径直接相关的基因,苯丙氨酸解氨酶和花青素还原酶基因,同绿芽资源相比,它们在紫色资源中分别下调3.44倍和上调2.09倍;同时还筛选到两个可能调控花青素合成的转录因子MYB蛋白和WD40蛋白,分别上调2.25倍和2.54倍。这些研究结果将为深入理解茶树芽叶的紫化机理,克隆相关基因打下基础。     

低温胁迫下茶树基因表达的差异分析

利用cDNA-AFLP技术分析了茶树在低温胁迫下的基因表达差异。用16对引物(256个组合)对三个样品池进行了差异条带的筛选,结果表明,在冷胁迫不同处理时期相关基因表达存在显著差异,共获得了86个差异片段。在选择回收的10条差异表达cDNA片段中,经克隆测序,Blast序列同源性检索,显示其中片段1与一种低温和盐胁迫响应蛋白有77%的同源性,片段5与拟南芥冷诱导表达相关60 s ribosomal protein L7(RPL7B)有89%的同源性;片段8与一种逆境诱导蛋白(Stress-induced H1-Histone protein)有79%的同源性;片段9与干旱条件下的EST序列有着较高的同源性,其它6个片段在GenBank数据库中未找到相似序列,可能为新基因。     

木薯干旱胁迫响应基因MeGSTU7自然变异分析

在2个木薯品种中检测MeGSTU7基因在不同干旱胁迫阶段的表达量变化,并克隆测序了60个木薯品种的基因区DNA序列,分析基因核苷酸多态性及其自然变异,并将核苷酸多态性与干旱胁迫表型关联分析,挖掘优等位变异。结果表明,干旱胁迫条件下,2个品种的MeGSTU7的表达量均上调。MeGSTU7基因区核苷酸变异丰富,共有23个SNP位点,A/G突变为主;外显子区总计10个同义突变,12个非同义突变;外显子区在品种资源群体中有4种主要单倍型,所有的单倍型分为两大类,分子进化分析表明,MeGSTU7的外显子区的两端受到很强的正选择作用;Q+K+MLM混合线性模型关联分析结果表明,1个Indel和2个SNP与干旱胁迫下地上部鲜重耐旱系数显著关联,并筛选得到了优等位变异。     

番木瓜干旱胁迫相关CpDHN基因的克隆与原核表达

本研究基于转录组获得的CpDHN转录本序列,以番木瓜‘台农二号’组培苗叶片为材料,采用RT-PCR技术克隆了该基因包含完整ORF在内的425 bp cDNA序列。序列分析表明,CpDHN预测编码93个氨基酸,其理论分子量为10.50 kDa、等电点为6.62、总平均疏水指数为-1.984、核定位。除保守的K片段外,蛋白还含有1个S片段,可归为KS型脱水素。在拟南芥中的10个脱水素中,CpDHN与AtLEA8的亲缘关系最近,相似性为53.3%。值得注意的是,虽然CpDHN的编码区不存在内含子,但其3°UTR含有1个与AtLEA8类似的内含子。表达谱分析显示,该基因在根和叶片中均受干旱胁迫诱导。此外,还构建了CpDHN的原核表达载体,SDS-PAGE分析显示,该蛋白在大肠杆菌中可高效表达。这些结果为下一步的功能鉴定奠定了坚实的基础。     

cDNA-AFLP结合BSA研究马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因差异表达片段

通过对具有 6个无毒基因不同表型的马铃薯晚疫病菌构建的 4个混合池进行cDNA AFLP分析 ,得到与 6个与无毒基因相关的差异表达片段 (TDFs) 85条 ,其中与无毒基因Avr1相关的为 2 0条 ,Avr2 2 8条 ,Avr3 Avr10 Avr1116条 ,Avr4 2 1条。差异表达片段大小主要分布在 10 0bp和 30 0bp之间 ,最小片段为 6 0bp ,最大片段 4 40bp。差异表达片段的获得将有利我们下一步克隆全长无毒基因和对晚疫病垂直抗性机制的研究     

利用基因芯片筛选甘蔗成熟期叶片差异表达候选基因

利用Agilent甘蔗4×44k（perarray）芯片分析甘蔗叶片在甘蔗成熟期的差异表达基因,并通过生物信息学手段对基因芯片杂交结果进行分析。芯片杂交结果符合质控标准,并且杂交数据重复性良好,结果可靠。在甘蔗生长过程中8个时间点上,共筛选出相关差异在2倍以上的基因20个,其中上调表达基因17个,下调表达基因3个。这些候选基因分别涉及不同水平分子进程和多种代谢途径。     

木薯耐寒相关microRNA的差异表达分析

采用荧光实时定量PCR(quantitative Real Time-PCR,qRT-PCR)技术对低温胁迫处理及对照的两个木薯品种C4和KU50材料进行差异表达分析。结果表明,该6个miRNA在胁迫材料与对照中的表达不同,不同品种及器官中也存在差异表达,且6个miRNA属于受低温诱导与上游调节基因相关的miRNA,这将成为今后研究的主要对象。     

番木瓜干旱胁迫相关CpDHN1基因的克隆与分析

番木瓜（Carica papaya L.）隶属于番木瓜科番木瓜属,是一种营养价值高的热带果树,广泛种植于热带和亚热带地区。作为全年结果的典型热带作物,番木瓜易受寒害、旱害等非生物胁迫的影响。然而,目前有关番木瓜的抗逆研究主要集中于导致绝产的病毒病,鲜见针对非生物胁迫的报道。脱水素又名第二类胚胎发育晚期丰富蛋白,属于亲水性高、富含甘氨酸、复杂度低的非结构蛋白,因其与生物的抗逆性密切相关而受到广泛关注。为解决番木瓜生产在地域上的局限性,并进一步提高其品质和产量,积极筛选和鉴定参与非生物胁迫响应的关键基因具有重要的理论意义和应用价值。本研究基于转录组获得的CpDHN1转录本序列,以‘台农二号’番木瓜组培苗叶片为材料,提取总RNA进行反转录,结合RT-PCR技术克隆了该基因636 bp的全长编码区序列,在此基础上对其进行序列、表达特性以及原核表达分析。结果显示,CpDHN1编码211个氨基酸,其理论分子量为24.09 kDa,等电点为5.05,总平均疏水指数为-1.584,不稳定系数为66.51,属于不稳定、高度亲水的细胞核定位蛋白。CpDHN1蛋白富含谷氨酸、赖氨酸和丝氨酸,含有3个保守区域,即2个K片段和1个S片段,符合脱水素蛋白的基本结构特征,属于SK_n型脱水素。生物信息学分析表明CpDHN1无跨膜螺旋,其二级结构中以α-螺旋结构占主导。表达分析显示,该基因在根、叶片和韧皮部树液中均有表达,且其表达水平受干旱胁迫调控。同源分析表明,CpDHN1与拟南芥AtLEA4序列相似性最高,为46.8%,而与番木瓜中已报导的另一个脱水素CpDHN的相似性仅为19.4%。研究还构建了CpDHN1的原核表达载体,根据SDS-PAGE结果,CpDHN1在40 kDa处有条中强度的诱导条带,而在55 kDa处有条高亮的诱导条带,可能与其无规结构有关。这些结果为进一步的功能分析与应用奠定了坚实的基础。     

木薯转化酶抑制子MeINH3基因的克隆及生物信息学分析

转化酶抑制子调控转化酶的活性,在植物的糖代谢过程中具有重要作用。为了研究木薯的转化酶抑制子,本实验利用木薯基因组数据库分析及RT-PCR方法,从木薯中分离了1个木薯转化酶抑制子MeINH3的cDNA序列。MeINH3序列长度为564 bp,包含528 bp的完整开放阅读框,编码127个氨基酸,N端有16个氨基酸残基的信号肽,4个保守的半胱氨酸残基可形成两个二硫桥。亚细胞定位预测表明,MeINH3蛋白定位于胞外。根据生物信息学分析结果,推测其可能抑制木薯细胞壁转化酶活性。     

木薯抗旱相关miRNA表达差异分析

对2个木薯(Manihot esculenta Crantz)品种SC124和KU50进行驯化和非驯化干旱处理,利用实时荧光定量PCR技术(qPCR)取样2个部位的3个时间点,对5个miRNA进行表达差异研究。结果显示,5个miRNA具有不同的表达形式,miRNA 171 ab和398 b经过驯化后诱导(DH)条件下表达,miRNA 166 a在直接干旱处理(DNH)条件下的功能叶中有表达,而驯化后诱导条件下只在根中有表达;miRNA 390 b和399 e在2种干旱处理方式中都有表达,经过驯化后表达量也明显增加。通过对不同处理、部位和时间点上的表达情况分析,表明miRNA具有明显的品种特异性、组织特异性和时序性。     

24份木薯(Manihot esculenta)种质的遗传多样性研究

采用产量性状和12个表型性状聚类分析以及SSR标记技术,对不同产地来源的24份木薯(Manihot esculenta)种质遗传多样性进行了研究。结果表明,依据12个表型性状在欧氏距离系数为39.353处可将供试的24个木薯种质分为3类,一些品种的表型性状与地理来源之间存在相关性;利用18对SSR引物对24份木薯种质进行多态性分析,共检测到154条带,其中多态性带145条,每一个位点上检测到5～12条,平均8.6条。材料间相似系数在0.510～0.967之间,平均相似系数为0.695。以相似系数0.78为结合点,可以将材料分为三大类。不同国家和地区来源的材料不能明显聚类,不同淀粉含量、干物质量分数的品种却聚在一起,且没有发现与淀粉含量、干物质量分数相关的特异性条带。农艺性状的聚类结果与SSR聚类的结果有很大的差异,说明木薯在长期的演化和自然选择过程中发生了显著的表型变化。     

木薯分子标记遗传连锁图谱的构建及相关性状QTL定位

用木薯推广品种KU50为母本,SC124为父本通过杂交得到包含235个单株的F1分离群体,构建了一张包含150个标记的分子遗传连锁图谱,其中EST-SSR有72个位点,SSR有58个位点,SRAP有20个位点,这些位点分布了21个连锁群,总长度为1434.48cM,标记间距为9.56cM.遗传图谱的连锁群的长度在16.89～139.63 cM,标记的间距是0.2～47.0cM,标记位点比较多的是LG1、LG2、LG4、LG9、LG10,分别是17、18、13、14、15个,而标记数最少的是LG20,只有2个标记.用IciQTLMaping3.2软件在LOD=2.5进行QTL分析,检测了块根产量(WCY)、耐寒性分析(CR11、CR12)、干物质含量(DMC11、DMC12)3个木薯数量性状,总共得到34个QTL位点,分布在12个连锁群上.其中关于WCY的QTL位点总共有17个,贡献率为21.70％～55.23％,平均贡献率为40.74％;CR11相关的QTL位点有4个,贡献率为2.97％～33.29％,平均贡献率为18.20％.与CR12相关的QTL定位有3个,贡献率为5.23％～29.85％,平均贡献率为18.28％;与DMC12性状相关的QTL位点有4个,贡献率为15.87％～38.52％,平均贡献率为26.24％;与DMC11性状相关的位点有6个,贡献率为13.84％～22.15％,平均贡献率为17.56％.     

云南野生甘蔗抗旱性遗传表现分析

对云南西双版纳割手密、云南蛮耗割手密、云南富宁斑茅组合后代在人工水分胁迫下测定相关抗旱生理指标,采用模糊隶属函数平均值综合评价抗旱表现,结果表明:①云南富宁斑茅组合后代抗旱性最强,其次是云南蛮耗割手密、云南西双版纳割手密组合后代;②随着代数增加抗旱性不断得到改良,云南富宁斑茅种质表现较强的抗旱性遗传优势.     

Genotypic Variation in Responses of Cassava (Manihot esculenta Crantz) to Drought and Rewatering: Root System Development

Abstract

Soil moisture condition is a major factor that affects root system development and thus, crop production. This study aimed to evaluate genotypic variations of cassava in root system structures and their responses to different soil moisture conditions by examining various root traits including production and elongation of adventitious roots and their laterals. Four pot experiments were conducted and different genotypes of various backgrounds were grown under well-watered, droughted, droughted to rewatered conditions. One field experiment was also conducted with selected genotypes till maturity. Results showed that substantial genotypic variations exist in root system structure, and the effects of the soil moistures were significant for most of the root traits. The principal component analysis (PCA) showed that the lateral root development mainly accounted for the variations in root system structure regardless of soil moisture conditions. The PCA on the differences between droughted and well-watered control, and droughted-rewatered and the control further indicated that the branching ability of adventitious roots was mainly responsible for the root system responses to drought as well as rewatering. Genotypic ranking in root system responses to drought was almost consistent among the pots and field experiments. Genotypicvariations in rooting depth were relatively small while those in horizontal spread were apparent in the field experiment.The ability to maintain adventitious root elongation under drought, resulting in relatively large horizontal spread of root system and to recover sharply from drought by lateral root branching may be related to good growth and yield performance under field.     

胡萝卜根中特异性表达基因的cDNA—AFLP分析

胡萝卜是一种具有重要保健功能的蔬菜,其块状根系富含胡萝卜素等多种营养物质,可开发作为生物反应器。以转基因胡萝卜根作为生物反应器生产生物活性成分需要应用其根部高效、特异性表达的启动子。本研究应用cDNA-AFLP分析胡萝卜根、叶中基因的差异表达,获得32个在根中高效表达而在叶中不表达的转录衍生片段（TDF）。测序和同源比对分析结果表明,其中有20个TDF在基因库中未发现同源基因,其他12个分别是推定的植物激素抑制蛋白、金属硫因-1蛋白及其他有关基因。