棉纤维特异表达蓝铜蛋白基因(GhBCP1)的克隆与鉴定

【目的】对从棉纤维细胞分离获得的基因GhBCP1进行序列和表达分析,初步分析其功能。【方法】采用mRNA荧光差异显示结合cDNA末端快速扩增技术克隆基因全长cDNA序列,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定氨基酸序列进行分析,并用荧光实时定量PCR法研究基因在不同组织中的表达。【结果】克隆了一个棉纤维特异表达基因的全长cDNA,命名为GhBCP1(GenBank登录号:EF222282),该cDNA全长721bp,含有一个编码176个氨基酸蛋白的开放阅读框。BLAST分析表明该基因所编码产物为一个蓝铜蛋白。Southern杂交分析表明该基因在陆地棉(Gossypium hirsytum L.)中有2个拷贝。实时荧光定量PCR分析发现该基因在棉花纤维细胞特异表达,在纤维发育过程中,GhBCP1转录产物的累积主要发生在纤维细胞发育由伸长向次生壁合成转换阶段。【结论】GhBCP1基因的组织特异性和发育阶段性表达初步证明该基因的功能可能与次生壁合成的起始密切相关。     

棉纤维发育过程中糖代谢生理特征对氮素的响应及其与纤维比强度形成的关系

 【目的】研究棉纤维发育过程中的糖代谢生理特征对氮素的响应及其与纤维比强度形成的关系,探索改善棉纤维比强度的生理调控技术途径。【方法】以美棉33B（AC-33B）和科棉1号（KC-1）为材料,设置大田氮素水平0 kg N?hm－2（缺氮）、240 kg N?hm－2（适氮）和480 kg N?hm－2（高氮)试验,研究3个氮素水平下棉纤维发育过程中糖代谢的重要物质（蔗糖和β-1,3-葡聚糖）含量变化、调节糖代谢的相关酶（蔗糖酶、蔗糖合成酶、磷酸蔗糖合成酶及β-1,3-葡聚糖酶）活性的动态变化和纤维比强度形成的关系。【结果】两年试验结果表明,在240 kg N?hm－2水平下,棉纤维中的蔗糖酶活性最高,可长时间地为棉纤维发育提供一个充足的物质能量库,蔗糖合成酶、磷酸蔗糖合成酶活性最高,促使纤维发育过程中铃龄5～24 d的蔗糖下降量及24～31 d蔗糖增长量最大,并且全铃期内转化率高且转化彻底,β-1,3-葡聚糖酶活性高,使含量及峰值高的β-1,3-葡聚糖中后期转化彻底,因此,此水平下棉纤维发育过程中蔗糖和β-1,3-葡聚糖含量的上述动态变化,有利于纤维素平缓累积且累积期长,与高强纤维的形成需要的纤维素累积特征相吻合;而在0 kg N?hm－2水平下,棉纤维发育过程的糖代谢生理特征与上述表现刚好相反,最终纤维素累积过快且累积期短,形成低强纤维;480 kg N?hm－2水平则介于上述两者之间。【结论】棉纤维发育过程糖类物质代谢生理特征在0、240、480 kg N?hm－2水平间存在明显差异,该差异是导致纤维最终比强度形成不同的重要因素。在240 kg N?hm－2水平下,上述糖代谢相关酶活性变化及糖类物质供给更为优化,更有利于高强纤维的形成。     

荧光实时定量PCR研究GA负调控因子基因在棉花纤维不同发育时期的表达模式

棉花纤维发育经历起始期、延伸期、次级细胞壁加厚期、脱水期共4个发育时期。为了了解GA负调控因子基因在整个纤维发育时期的调节作用,采用敏感的实时定量PCR对GA负调控因子基因Gh RGL在棉花纤维不同发育时期中的转录水平进行了定量研究,通过提取来源于不同纤维发育阶段[包括-3~0 DPA(开花后)胚珠,3 DPA胚珠,5 DPA胚珠,10 DPA胚珠,15 DPA纤维,25 DPA纤维]的样品总RNA,探讨不同发育时期Gh RGL基因的表达模式。结果显示,Gh RGL基因在所有被选的样品中都有表达,其中在5 DPA胚珠和10 DPA胚珠中转录水平较高,在10 DPA胚珠中表达水平最高,在-3~0 DPA胚珠、3 DPA胚珠、15 DPA纤维、25 DPA纤维中的表达水平较低,表明Gh RGL基因在纤维伸长期表达水平较高,暗示Gh RGL可能对纤维伸长起着重要作用。     

海岛棉纤维品质性状关联分析

海岛棉纤维具有长、强、细等优点,利用纤维品质各性状进行关联分析研究,可以为今后分子标记辅助选择育种(molecular marker-assisted selection,MAS)提供理论指导。利用194个SSR(simple sequence repeats)标记,对214份海岛棉材料的基因组进行扫描,分析其群体结构,并利用TASSEL软件的MLM(mix liner model)模型对8个纤维品质性状进行关联分析。结果显示:(1)利用STRUCTURE群体结构软件分析,将214份海岛棉材料划分为4个亚群,主要分布于中国、美国及前苏联,说明其亚群的划分与来源地有一定的相关性。(2)利用MLM模型进行关联分析,结果显示检测到13个标记与8个纤维品质性状相关联,且在第13和17号染色体上标记较集中;其中部分标记同时与2个或多个性状相关,可能是性状相关或"一因多效"的遗传基础。     

不同棉花品种纤维比强度形成的温度敏感性差异机理研究

 【目的】研究纤维比强度形成存在温度敏感性差异的2个棉花品种纤维发育生理特性对低温的响应差异。【方法】选用纤维比强度形成存在温度敏感性差异的2个品种（科棉1号：温度弱敏感型品种,苏棉15：温度敏感型品种）,通过分期播种,使相同果枝部位棉铃发育处于不同的温度条件,研究低温对棉花纤维发育相关物质含量和酶活性的影响。【结果】正常播期条件下,棉纤维发育期日均最低温为24.0和25.4℃,棉纤维中蔗糖合成酶活性高,β-1,3-葡聚糖酶活性低,蔗糖转化率和纤维素含量均较高,最终纤维比强度最高;晚播所致的低温（棉纤维发育期日均最低温低于21.1℃）则显著影响棉纤维发育,蔗糖转化率、纤维素含量、β-1,3-葡聚糖含量均下降,纤维发育相关酶活性中蔗糖合成酶活性下降、β-1,3-葡聚糖酶活性上升,导致纤维比强度降低。2个纤维比强度形成存在温度敏感性差异的棉花品种纤维发育生理特性对低温的响应存在差异,温度敏感型品种（苏棉15）的蔗糖转化率、纤维素含量及酶活性（蔗糖合成酶、β-1,3-葡聚糖酶）在因播期形成的不同温度间的变化幅度明显大于温度弱敏感型品种（科棉1号）。【结论】低于21.1℃的日均最低温影响棉纤维发育及纤维比强度形成,不同棉花品种纤维发育相关的物质含量、酶活性对低温的响应存在差异,这可能是导致纤维比强度存在温度敏感性差异的主要原因之一。     

陆地棉纤维强度与产量性状关系的研究

本研究分三个试验,共用17个现代品种 (系) 进行了纤维强度与产量性状以及纤维强度与吐絮进程关系的分析。结果表明,纤维强度与产量及产量因素相关不显著;纤维强度与吐絮进程参数呈显著或极显著的负相关关系 (相关系数分别为-0.9616~**,-0.8482~*,-0.8278~*和-0.9745~**);吐絮进程参数与产量及产量因素的相关不显著。通径分析表明,产量因素中单株结铃数对皮棉产量的直接贡献最大。     

棉纤维细胞初生发育过程中的基因表达

棉纤维细胞是由胚珠的部分表皮细胞经分化突起发育而成的,在整个生长发育过程中棉纤维细胞只生长不分裂,是一种很好的研究植物细胞生长发育机理的模式材料．近年来国内外不少研究者已经分离出一批对棉纤维初生生长发育有重要作用的功能基因,并阐明了这些基因的表达及调控特征．这些基因的分离和鉴定不仅有助于阐明植物细胞分化和伸长发育的分子机理,而且还可以促进棉纤维品质改良遗传工程的开展。     

棉花木葡聚糖转移/水解酶基因克隆和分析

为研究XTH基因与棉花(Gossypium spp.)纤维伸长的关系,克隆了两个XTH基因,分别命名为Gh XTH1(Gen Bank:AY189971)和Gh XTH2(Gen Bank:JN968478)。Gh XTH1编码区全长870 bp,编码289个氨基酸,Gh XTH1全长885 bp,编码294个氨基酸。序列分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均存在XTH家族保守序列DEIDFEFLG。生物信息学分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均含有信号肽。跨膜结构预测表明,Gh XTH1和Gh XTH2均在N端存在跨膜螺旋。系统发生学分析表明,Gh XTH1与拟南芥XTH6、XTH7亲缘关系较近,Gh XTH2与拟南芥XTH9亲缘关系较近。半定量分析表明,Gh XTH1和Gh XTH2均随着棉花纤维发育表达量降低,Gh XTH2比Gh XTH1表达量高。     

棉纤维特异启动子E6基因表达载体的构建

以棉花cDNA为模板克隆了棉花纤维特异启动子E6,从质粒RDB1上切下植物的35S启动子,置换上棉纤维特异启动子E6.经PCR及酶切鉴定,得到了含E6基因的植物表达载体.     

一个棉花血红素加氧酶基因的克隆及特性分析

血红素加氧酶(HO)是催化血红素降解的微粒酶系统,根据HO基因的保守序列设计PCR引物,对构建棉花腺体形成时期的cDNA均一化文库PCR进行筛选,分析确定阳性克隆中cDNA片段的大小,克隆了棉花中1个HO基因全长cDNA,命名为HOCG(GenBank登记号:EU373020),并对其编码的氨基酸序列进行分析.结果显示,HOCG基因长度为1 462 bp,编码318个氨基酸,其编码的蛋白质预测的等电点和分子量分别为5 580和36 220.RT-PCR分析表明,该基因在湘棉18腺体形成前后表达有差异,该基因的克隆与分析有利于进一步探明棉花腺体形成的机制.     

唐菖蒲丙二烯氧化物环化酶基因GhAOC的克隆与表达分析

克隆唐菖蒲AOC基因的全长cDNA序列,并分析该基因的表达模式及其对茉莉酸(Jasmonic acid,JA)生物合成的影响。以唐菖蒲栽培品种‘Rose Supreme’的球茎为试材,利用RT-PCR和RACE技术克隆AOC基因的全长cDNA序列;利用基因枪方法进行GhAOC基因的亚细胞定位分析;运用实时荧光定量PCR技术分析GhAOC基因的表达模式。克隆了1个全长为898bp的茉莉酸生物合成关键酶丙二烯氧化物环化酶(allene oxide cyclase,AOC)基因的cDNA序列,命名为GhAOC。该序列含有1个735bp的开放阅读框(ORF),编码244个氨基酸,推导的蛋白质分子量为26.52ku。亚细胞定位分析表明GhAOC是叶绿体蛋白。实时荧光定量RT-PCR表达分析显示,该基因在唐菖蒲叶、花、根、匍匐茎、新球茎和籽球上都表达,其中在新球茎和籽球中表达量最高;经过0.1～0.5mmol/L的MJ(methyl jasmonate,茉莉酸甲酯)处理后,逐渐提高了GhAOC基因在球茎中的表达量和内源MJ含量。GhAOC基因的表达促进了唐菖蒲茉莉酸的生物合成。     

AOS1 基因克隆及其在鲜切芋头褐变中的表达模式分析

【目的】鲜切芋头即使在低温条件下贮藏,贮藏期间仍会出现变黄变褐的现象,严重影响鲜切芋头的商品性。从鲜切芋头中克隆丙二烯氧化物合成酶（Allene oxide synthase, AOS）基因 AOS1,并分析其表达与鲜切芋头褐变的关系,鉴定鲜切芋头褐变过程中的重要功能基因,为鲜切芋头褐变机制研究提供参考。【方法】以鲜切芋头 cDNA 为模板,采用 RT-PCR 法克隆 AOS1 基因编码序列（Coding sequence, CDS）;采用荧光定量 PCR 法分析鲜切芋头褐变过程中 AOS1 表达情况,利用转录组测序数据分析外源褐变抑制剂处理对 AOS1表达的影响,并分析 AOS1 启动子序列。【结果】20 ℃条件下,鲜切芋头贮藏 24 h 切面出现明显的变黄变褐症状,而 4 ℃下贮藏 12 d 才出现明显的褐变症状,表明贮藏温度是影响鲜切芋头褐变进程的重要因素,低温贮藏可有效抑制鲜切芋头褐变。芋头 AOS1 基因的 CDS 全长为 1 560 bp,编码 519 个氨基酸残基;AOS1 基因编码蛋白质的分子量为 57.63 kD,等电点为 8.68,定位在叶绿体。植物 AOS1 蛋白序列相似性较低,芋头 AOS1 与番茄AOS1、拟南芥 AOS1 蛋白的亲缘较远,但天南星科植物 AOS1 蛋白的序列同源性较高。芋头 AOS1 启动子中含有许多植物激素和逆境响应元件,AOS1 表达在鲜切处理后显著上调,表明切分处理诱导了 AOS1 的表达。随着鲜切芋头褐变进展,AOS1 表达量逐渐增加,外源乙醇酸和香草酸处理 AOS1 表达显著下调,表明 AOS1 表达与鲜切芋头褐变有关。【结论】鲜切芋头褐变与 AOS1 表达具有明显正相关性,切分去皮等处理可能通过诱导 AOS1表达促进鲜切芋头褐变。     

基于关联分析的新陆早棉花品种农艺和纤维品质性状优异等位基因挖掘

【目的】寻找与新陆早棉花品种农艺和纤维品质性状相关联的分子标记,鉴别与这些性状相关的优异等位变异及携带优异等位变异基因的典型载体材料,为新陆早棉花品种分子设计育种奠定基础。【方法】利用筛选出分布于26条染色体且多态性高的75对SSR标记对51份新陆早棉花品种进行多态性扫描;采用R语言编程软件对多环境的表型性状绘制boxplot图;在对供试材料进行群体结构和连锁不平衡分析的基础上,利用TASSEL软件中MLM（mixed linear model）方法进行分子标记与15个性状的关联分析;依据计算的表型效应值,鉴别和统计优异等位变异的位点及典型材料。【结果】通过群体遗传结构分析将51份新陆早棉花品种划分为4个亚群结构。针对15个表现型性状的BLUP（best linear unbiased prediction）结果进行统计和分析,鉴别出极显著和显著相关的性状。分析结果显示,在4种环境条件下,棉花5个性状（果枝始节高、果枝始节数、衣分、纤维上半部长度和短纤维率）变化趋势稳定,10个性状（株高、果枝数、叶枝数、有效铃数、单铃籽棉重、单铃皮棉重、马克隆值、比强度、纤维整齐度和纤维伸长率）较稳定。通过关联分析,获得与农艺性状相关的等位变异位点117个（P＜0.05）,其中对9个农艺性状贡献率（R²）最大的等位变异位点分别为：BNL3650b（株高,R²=11.78;果枝始节高,R²=20.80;果枝始节数,R²=11.54）、NAU3995c（果枝数,R²=14.86）、BNL119b（叶枝数,R²=9.7）、NAU3995d（有效铃数,R²=14.98）、BNL3255a （单铃籽棉重,R²=11.11）、NAU1071a（单铃皮棉重,R²=10.15）和BNL663a（衣分,R²=12.42）。与纤维品质相关的等位变异位点55个（P＜0.05）,其中分别对6个纤维品质性状贡献率最大的等位变异位点为：NAU1103b（纤维上半部长度,R²=6.4）、NAU1071a（纤维比强度,R²=7.57）、BNL3140b（马克隆值,R²=12.06）、BNL3650b(纤维整齐度,R²=13.47)、BNL1421a（短纤维率,R²=13.04）和BNL2960b（纤维伸长率,R²=11.67）。共检测到39个与农艺（29个）和纤维品质（10个）性状相关的位点（P＜0.01）,对表型变异解释率范围为6.45%-20.8%,平均值为11.14%,同时检测到与2个以上性状相关联的位点47个。携带优异等位变异基因的典型材料共计17份。通过与已经报道的棉花农艺和纤维品质性状相关的QTL（quantitative trait loci）比较,检测的27个QTL在前人研究中已经报道,其中BNL3650（纤维整齐度）、BNL3033（马克隆值）、NAU3254（纤维伸长率）、GH132（衣分）、TMB1618（比强度）、BNL1421（比强度和纤维整齐度）和BNL119（纤维伸长率）7个QTL具有相同的关联性状。【结论】51份原种新陆早棉花品种的群体遗传结构简单,连锁不平衡水平低,表型性状在2种环境条件下变化趋势较稳定。基于SSR的关联分析,发掘了一些与农艺和纤维品质相关的优异等位变异基因及典型材料。     

Molecular Cloning, and Characterization of an Adenylyl Cyclase-Associated Protein from Gossypium arboreum L.

The aim of this study was to clone CAP （adenylyl cyclase-associated protein） gene from Gossypium arboreum L. and develop a platform for expressing and purifying CAP protein, which is a base for the construction and function researches of CAP. In this work, a CAP homolog from cotton （DPL971） ovule was identified and cloned. And the cDNA sequence consisted of an open reading frame of 1 416 nucleotides encoding a protein of 471 amino acid residues with a calculated molecular weight of 50.6 kDa. To gain insight on the CAP role in cotton fiber development, the cloned CAP cDNA was expressed. A significant higher yield pure protein was obtained with the chromatographic method. Further experiments showed that the purified protein can bind with the actin in vitro indicating that the recombinant cotton CAP is functional. The procedure described here produced high yield pure protein through one chromatographic step, suitable for further structure-function studies.     

杨树环化酶基因组织表达模式和蛋白定位

半定量RT-PCR显示,毛果杨形成层、幼叶和顶芽中的Potri.006G237100转录产物极低,但在木质部、叶柄和根中其转录水平却较髙,在木质化茎节其转录产物也呈现高丰度积累,这表明Potri.006G237100在毛果杨木质化组织中特异地、高丰度转录表达。实验构建p GWB5-Potri.006G237100载体,转化拟南芥、分子鉴定得到5个过量表达转基因植株,激光共聚焦分析显示融合蛋白Potri.006G237100-GFP定位在转基因植株的细胞质。     

不同陆地棉纤维发育重要阶段形态学差异比较

[目的]研究不同陆地棉品种纤维发育形态学变化,比较棉纤维发育重要阶段的形态学差异.[方法]以新陆中82号、新陆中70号、新陆中38号以及15-1242为材料,在扫描电镜观察纤维在开花前1 d至开花后1 d的胚珠、发育21和28 d的纤维以及成熟纤维.[结果]随着开花时间的增加,胚珠表皮细胞的突起数量或伸长数量逐渐增加,...     

棉纤维发育相关酶活性的基因型差异与纤维比强度的关系

 【目的】以纤维比强度差异较大的不同基因型棉花为材料，研究它们纤维发育过程中相关酶活性的动态变化与纤维比强度的关系，为探索改善棉纤维比强度的生理调控途径提供理论依据。【方法】选择棉纤维比强度分属高（科棉1号）、中（美棉33B）、低（德夏棉1号和苏棉15号）3种类型，4个不同基因型的品种，在大田栽培条件下，研究棉纤维次生壁加厚过程中相关酶活性的动态变化、纤维素累积和纤维比强度形成的关系。【结果】β-1,3-葡聚糖酶活性在次生壁加厚发育过程中呈下降趋势，蔗糖合成酶、过氧化物酶和IAA氧化酶活性变化均呈单峰曲线，基因型间差异主要表现在酶活性的大小和峰值出现的时间。科棉1号属高强纤维基因型，棉纤维中与纤维发育相关的酶活性在整个次生壁加厚期高于中、低强纤维基因型，前者酶活的动态变化与纤维素累积快速增长期的协调性好，纤维素累积平缓，纤维比强度增强的幅度大；反之，如低强纤维品种德夏棉1号和苏棉15号，其纤维发育相关酶在次生壁加厚期活性低，纤维素累积快速增长期短，纤维比强度增强的幅度小；美棉33B棉纤维发育相关酶活性、纤维素累积和纤维比强度形成特征介于上述两种基因型之间。【结论】不同基因型棉花纤维中与纤维发育相关的酶活性存在显著差异，该差异可能是导致纤维素累积特性及纤维比强度形成基因型间差异的主要生理原因之一。     

不同纤维品质棉花纤维发育过程中内源激素含量变化及与品质的关系

研究棉纤维发育过程中内源激素含量的变化,认识激素对纤维品质的调节效应,为人工调控纤维品质提供依据具有重要意义。选择新疆棉区4个纤维品质不同的棉花为材料,探讨棉纤维发育过程中内源激素含量的变化及与纤维品质形成的关系。结果表明:不同品种棉花纤维发育过程中纤维生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素(ZR)和脱落酸(ABA)的变化趋势基本相似,其差异主要表现在IAA、GA3、ZR和ABA的含量大小及峰值出现的时间。新陆早16号在纤维发育前期有较高含量IAA、GA3、ZR和低含量的ABA,表现出纤维伸长速率较高,快速伸长时期较长;在次生壁加厚期ZR峰值出现较早,有利于棉纤维成熟,纤维品质表现较优。02-DB在纤维发育前期较高含量的ABA影响了纤维伸长速率和快速伸长时期,同时后期ZR峰值出现的晚,影响纤维发育,最终品质较差。