用豚鼠红血球M.R.E.血凝反应筛选和鉴定仔猪黄痢大肠杆菌K_(88)~ 抗原的研究

从江苏、上海、北京的七个县十一个患有新生仔猪腹泻的猪场分离到的225个大肠杆菌株中,有127个菌株能在0℃下对豚鼠红血球呈现m.r.e.血凝反应。随猪场不同,它们分属于5个O抗原型,用它们的OK血清和新鲜菌液作交叉凝集反应,表明它们都含有一个共同的K抗原。从这些菌株得到的表面m.r.e.血凝素提取物,在琼脂扩散沉淀反应中均能与这些OK血清形成一条共同的沉淀线。在所试的36个标准O抗原菌株中,有三个呈m.r.e反应阳性,凝集反应和琼扩反应也证明它们与上述病原菌株具有一种共同的K抗原和m.r.e.血凝素抗原。其中44752株的自发突变株在失去m.r.e.血凝活性的同时,也不再能与其它菌的OK血清发生交叉凝集反应,表明这种m.r.e.血凝素就是那个共同的K抗原。一系列试验表明,这种m.r.e.血凝素在对培养温度的依赖性、等电点沉淀及水溶性,颗粒大小、血凝性和抗原性等理化和生物学特性方面均与Stirm和φrskov等确定的大肠杆菌表面K_(88)抗原相一致。在体外试验中,这些m.r.e.阳性菌株能吸着于2～3日龄仔猪小肠前段上皮细胞上,表明它们确系K_(88)~ 大肠杆菌。在仔猪结扎肠试验中,它们具有肠道病原性,引起肠扩张,证明它们确系仔猪黄痢的致病菌。从仔猪水肿病、仔猪白痢、羔羊大肠杆菌病及拉痢幼兔分离到的大肠菌株均呈m.r.e.反应阴性。由此表明,对豚鼠红血球的m.r.e.血凝反应在鉴定黄痢致病菌株方面是特异性的。本文证明了,在没有标准K_(88)单因子血清的条件下,用m.r.e.血凝反应从国内流行菌株中筛选和鉴定K_(88)~ 大肠菌株是可行的,并且这种方法简单易行,便于普及应用。用m.r.e血凝反应还可以从己知K_(88)~ 菌株中发现K_(88)抗原方面的变异性。对来自江苏、上海、北京七个县十一个猪场的菌株的研究表明,在我国,大多数猪场的仔猪黄痢都是由K_(88)~ 大肠杆菌引起的。在国内引起黄痢的K_(88)~ 菌株中,至少有4个O抗原类型,其中以O_(60)在江苏、上海一带最常见。O_(60)型乃是国外尚未报道的含K_(88)的O抗原类型。自从φrskov et. al.(1961)在对仔猪有肠病原性的大肠杆菌中发现K_(88)抗原以来,许多学者陆续证明,从不同国家和地区黄痢仔猪分离到的病原性大肠杆菌,虽然可能具有不同的O、K、H抗原结构,但它们中大多数部含有一个共同的表面K_(88)抗原。一系列研究表明,K_(88)抗原是一种仔猪小肠上皮细胞吸着素,它与细菌在小肠前段的定居力有关。根据这些研究,英国一家公司研制了一种实验性疫苗,它是用提取浓缩的K_(88)抗原加到不同大肠杆菌株的混合液中制成的,该苗给妊娠母猪皮下注射后,可通过初乳为仔猪提供被动免疫,显著降低新生仔猪腹泻(即我国的黄痢)的发病率和死亡率。在我国,对K_(88)~ 大肠杆菌在仔猪黄痢的发病中究竟起多大作用,尚没有详细研究。在没有标准K_(88)单因子血清的条件下,本文探索了应用对豚鼠红血球的m.r.e.血凝反应从国内黄痢流行菌株中筛选和鉴定K_(88)~ 大肠杆菌的可能性,并根据它对肠上皮细胞的吸着性、抗原性及K_(88)抗原的一些理化特性进行了鉴定。研究的目的在于寻找一种简单易行的试验方法,以弄清K_(88)~ 大肠杆菌在我国的流行情况,从而为进一步开展黄痢防治的研究创造了必要的条件。     

用交联葡聚糖柱层析提纯K_(88)抗原

连续三次用等电点沉淀法提纯的大肠杆菌K_(88)抗原,在琼脂扩散沉淀反应及免疫电泳中均与同源菌株的OK血清只产生一条沉淀线。这种抗原提取物在通过交联葡聚糖(Sephad ex)G_(50)柱层析后,在用紫外分光光度计检查时,其洗脱液却表现三个紫外线吸收峰。但在对豚鼠红血球的MR血凝反应(MRHA)中,仅第一峰呈阳性反应,也只有第一峰的洗脱液能象原K_(88)提取液那样在pH为4.5左右时发生浑浊沉淀。试验表明,在琼扩反应中表现为单     

应用MCA-ELISA检测腹泻仔猪粪样中的大肠埃希氏菌K_(88)粘着素抗原

将抗大肠埃希氏菌K_(88)粘着素抗原的单克隆抗体(MCA)标记辣根过氧化物酶,建立了一种MCA-ELISA,其对K_(88)阳性菌株的检测限为1×10~4个菌。本法对113株大肠杆菌分离培养物的检查结果与直接凝集试验结果完全符合,两种方法都检出K_(88)阳性菌株     

抗大肠埃希氏菌(E.coli)粘着素K88的特异单克隆抗体的产生及其特性测定

用等电点沉淀和葡聚糖凝胶柱层析法从大肠埃希氏菌C83901株(08:K87,K88_(ab))培养物分离和提纯K88_(ab)抗原,并以200ug/只的剂量免疫BALB/c纯系小鼠。第三次免疫后72小时取免疫小鼠脾脏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP_2/0—Ag14进行融合,得到能分泌抗K88_(ab)特异单克隆抗体的杂交瘤细胞系4个,分别命名为JLZK—1、JLZK—4、JLZK—7和JLZK—10。经多次克隆后,JLZK—7和JLZK—10在体外长期培养仍能稳定地分泌特异单克隆抗体。用JLZK—7和JLZK—10接种经降植烷(Pristane)激化的BALB/c小鼠所产腹水的免疫荧光滴度高达10~4—10~6,直接凝集反应滴度高达10~2—10~4。免疫荧光试验和直接凝集试验表明JLZK—7单克隆抗体能与所试验的含K88_(ab)或K88_(ac)抗原的全部大肠埃希氏菌反应,而不与K88抗原阴性的大肠杆菌和肠杆菌科的其他细菌起反应,是针对K88_(ab)抗原中成分a的型共同的单克隆抗体。另一方面,JLZK—10单克隆抗体只与大肠埃希氏茵中的K88_(ab)阳性菌株起反应,不与K88_(ac)阳性茵株和K88阴性菌株起反应,是针对K88_(ac)抗原中成分b的型特异单克隆抗体。     

K_(88)大肠菌培养物口服免疫母猪对仔猪黄痢的预防作用

仔猪黄痢在我县新生仔猪中的发病率和死亡率都很高。国内外研究者一致证明,大肠菌的 K_(88)抗原是一种菌体表面吸着素,它使菌体吸附于仔猪小肠前端的肠上皮上,从而加剧疾病的严重性。K_(88)是一种分子量较大的蛋白性抗原,能刺激机体产生抗体,故目前国内外已开始应用疫苗预防。为此,作者进行了用从本县黄痢仔猪分离的 K_(88)大肠菌口     

对FC株猪源性肠毒素型大肠杆菌致病因子的研究

FC菌株是一株从腹泻仔猪粪便中分离的肠毒型大肠杆菌(Entcrotoxigenic E.coli,ETEC)。在MRHA反应中,本菌能凝集人O型、豚鼠、马、绵羊、牛、鸡和兔的红细胞,对人O型和豚鼠红细胞有很高的血凝性,血抗K_(88)和K_(99)血清不能抑制其对豚鼠和绵羊红细胞的血凝.在体外小肠上皮细胞吸附试验中,本菌对仔猪小肠上皮细胞有强烈的吸附作用;透射电镜和扫描电镜观察证实了FC株菌除表面具有一种纤毛样结构外,还能定居在仔猪小肠段。血清学试验结     

应用反向间接血凝试验检测山羊痘病毒抗原

以兔抗山羊痘病毒IgG致敏绵羊红细胞，采用反向间接血凝试验(RPHA)检测山羊痘病毒抗原。该诊断试剂与山羊痘病毒抗原发生特异性的凝集反应；在PBS中不自凝；与其它动物病病毒抗原无交叉反应。对贵州省8个疫区现场采集山羊痘待检抗原检测结果表明，该方法阳性检出率为87．5％(7／8)。与琼脂扩散试验(AGP)阳性检出率为50％(4／8)相比较，RPHA敏感性比AGP高；同时对山羊痘野生强毒H—GZ株F1～F5代细胞培养物进行检测，F1代就可检出RPHA效价，而AGP则不能检测。该诊断试剂可用于兽医临床上山羊痘的快速诊断及作为病毒分离培养的检测指标。     

对FC株猪源性肠毒素性大肠杆菌致病因子的研究——Ⅰ.FC株菌粘着素抗原的鉴定及部分特性

本文介绍了FC株猪源性肠毒素性大肠杆菌柔毛粘着素的部分特性。在抵抗甘露糖的血凝试验中,本菌能凝集人O型、豚鼠、马、绵羊、牛、鸡和兔的红细胞,上对人O型和豚鼠红细胞有很高的血凝活性,且抗K_(88)和K_(99)血清不能抑制其对豚鼠和绵羊红细胞的血凝。在体外小肠上皮细胞吸附试验中,本菌对仔猪小肠上皮细胞有强烈的吸附能力。FC株茵的O抗原为101。K_(88)、987p两种抗血清均不能凝集本菌,而K_(99)抗血清可凝集。不过,经O_(101)和K_(99)两种抗原吸收后的FC抗血清仍能凝集F_(41)~+和K_(99)~+;F_(41)~+的两个标准菌株。这表明,FC菌株是一株具有K_(99)和F_(41)两种粘着素抗原的猪源性肠毒素性大肠秆菌。     

应用间接血凝试验(IHA)诊断猪蛔虫病

以猪蛔虫抗原致敏绵羊红细胞制备检测猪蛔虫特异性抗体的间接血凝诊断试剂,与猪蛔虫抗体发生特异性凝集反应.结果表明,用间接血凝诊断试剂对3 000份猪血清进行现场检测,阳性率为30.00%;而琼脂扩散试验(AGP)的阳性率为13.00%,表明,间接血凝试验(IHA)比GAP敏感,间接血凝诊断试剂可用于猪蛔虫病的快速诊断.     

大肠杆菌K_(88)菌毛抗原的纯化及抗血清制备

<正> 在引起仔猪腹泻的肠毒性大肠杆菌中,K_(88),K_(99)和987P是三种常见的吸附性菌毛,这些细菌表面纤毛能与肠粘膜上皮细胞表面的特异性受体位点结合,使细菌吸附于肠粘膜表面产生肠毒素,导致仔猪急性严重腹泻、脱水,最后衰竭死亡。K_(88)阳性的肠毒性大肠杆菌不仅是引起仔猪黄痢病最重要的病原之一,而且能引起仔猪水肿病,并能单独或协同轮状病毒导致仔猪白痢的流行。     

集约化猪场PWD病原性大肠杆菌毒力因子分析

探索浙江省集约化猪场仔猪断奶腹泻(PWD)病原性大肠杆菌血清型和毒力因子特征,为PWD防治及耐药性研究提供资料.从10个规模化猪场以直肠棉拭子采集PWD病料,经细菌分离纯化、革兰氏染色、生化试验和小鼠致病性试验等,对病原进行鉴定.采用11种猪源大肠埃希氏茵常见O型抗原血清、应用K88及F18菌毛单因子血清对分离茵进行玻板凝集试验和PCR方法分析黏附素及肠毒素类型.分离鉴定的56株病原性大肠杆菌O抗原定型了33株,共覆盖了11种血清型,其中O149、O139、O8为优势血清型,共17株,占定型菌株的51.5%;茵毛单因子血清玻板凝集试验和PCR测得病原性大肠杆菌中产肠毒素大肠杆菌(ETEC)比例较高,占病原性大肠杆菌分离总数的67.92%(36/53),肠毒素中含STa、STb、STa+STb、LT和SL-2e分别占总检测菌株数的30.19%(16/53)、35.85%(19/53)、18.9%(10/53)、1.89%(1/53)和9.43%(5/53).黏附素类型主要有K88和F18两种,分别占总检测菌株数的24.53%(13/53)和28.30%(15/53).结果表明,浙江省PWD病原性大肠杆菌至少覆盖了包括优势血清型O149、O139、O8在内的11种血清型;大肠杆菌中以产肠毒素型为主,主要毒力因子包括黏附素F18及K88和肠毒素STa、STb、SLT-2e等.     

大肠埃希菌F4菌毛凝集性单抗制备及抗原表位差异

采用杂交瘤单克隆抗体制备技术,获得4株能稳定分泌产肠毒素大肠埃希菌(ETEC)F4菌毛特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为8EH2、8EH3、9E10、11D4。免疫印迹和凝集反应结果表明:这4株单抗均能与纯化的F4菌毛蛋白发生特异性反应,且与F4大肠埃希菌不同血清型变异株F4ab、F4ac和F4ad发生特异性肉眼可见的凝集反应;而与F18、F6(987P)、F5(K99)产肠毒素大肠埃希菌参考株、分离株以及肠炎沙门氏菌参考株50336、分离株等多种肠杆菌科细菌无任何交叉反应。对单抗亚类的特性检测结果显示,这4株单抗均属于IgG1抗体,且主要识别F4ac的抗原表位,其中,8EH2、8EH3、9E10也能够较好地识别F4ab的抗原表位。结果说明F4菌毛凝集性单克隆抗体为ETEC F4感染的快速特异诊断提供技术基础。     

鸡致病性大肠埃希氏菌的菌毛血清型检测

使用透射电镜对3株鸡致病性大肠埃希氏菌(E.coii)的菌型进行了形态观察,发现其中2株菌具有纤细、中空、挺直的菌毛,另外1株未见菌毛。有菌毛的2株菌与K88、K99、987P和F41单因子兔高免血清的玻片凝集反应阴性,而与2株兔源的具菌毛的E.coli菌的兔高免血清呈强阳性。未见菌毛的那株菌与上述所有血清的玻片凝集反应均呈阴性。     

黑叶猴大肠杆菌O_(147):K_(88)及O_(55):K_(59)(B_5)菌株的分离和鉴定

本文报告了从一只黑叶猴体内分离大肠杆菌O_(147):K_(88)及O_(55):K_(59)(B_5)菌株的结果。材料和方法一、病料来源某市动物园于1986年12月送检病死成年猴1只。据称,该猴两天前食欲不振,精神萎靡,曾肌肉注射氯霉素未见好转,后食欲废绝,体温逐步下降而死亡。死后约4小时送至本系,剖检见胃底部有大片斑点状出血区,肠道粘膜亦有点状出血,肠系膜巴结肿大2-3倍,肝稍肿大,其它脏器无眼观病理变化。无菌采集肝、肺、肠系膜淋巴结、小肠(十二指肠)内     

间接ELISA筛选鹅源副粘病毒病单克隆抗体方法的建立

将鹅源副粘病毒NA-1株接种SPF鸡胚进行病毒增殖,用蔗糖密度梯度离心对病毒进行纯化.用提纯的鹅源副粘病毒作为抗原包被ELISA板,通过反应条件的筛选,建立检测鹅源副粘病毒病单克隆抗体的间接ELISA方法.结果表明,抗原最佳包被质量浓度为5 mg·L-1,血清最适稀释度1∶80,其作用时间为60 min,羊抗鼠酶标二抗的最适质量浓度为1∶6 400,最适作用时间为60 min,37℃显色15 min.不与小鹅瘟等3种疫病阳性血清发生反应.对282孔杂交瘤细胞液进行检测,阳性检出率为12.77%,高于血凝抑制试验的阳性检出率(10.28%),符合率为91%.     

一株鸡源新城疫病毒的分离鉴定

从湖北某养殖厂一只死亡鸡只中分离出一株病毒,通过血凝实验、血凝抑制实验和PCR方法对其进行了分离鉴定。结果表明,该病毒能与1%鸡红细胞发生凝集反应,并且该病毒液能被新城疫标准阳性血清所抑制,而不能被禽流感标准阳性血清所抑制,新城疫病毒的F基因PCR引物扩增出特异性条带,证明分离株为新城疫病毒,命名为HB1910。分离毒的血凝价为1:512,EID_(50)为10~(7.83)∕0.1 mL用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测,结果分离毒株在约350 bp处均可见到清晰的目的条带,而禽流感引物扩增无条带,证明分离毒为鸡新城疫病毒。     

对FC株猪源性肠毒素型大肠杆菌致病因子的研究

FC菌株是一株从腹泻仔猪粪便中分离的肠毒素型大肠杆菌○在MRHA反应中,本菌能凝集人○型、豚鼠、马、绵羊、牛、鸡和兔的红细胞,对人○型和豚鼠红细胞有很高的血凝性,血抗K_(88)和K_(99)血清不能抑制其对豚鼠和绵羊红细胞的血     

检测禽流感抗体的重组核蛋白间接ELISA方法的建立

以大肠杆菌系统表达的H9亚型禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)为抗原包被ELISA板,通过反应条件的筛选,建立检测禽流感抗体的重组核蛋白间接ELISA(NP-ELISA)方法。结果表明,抗原最佳包被质量浓度为7.56μg/ml,血清最适稀释度为1∶160,作用时间为60 min;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鸡IgG最适稀释度为1∶5 000,血清和酶标抗体最适作用时间为60 min。特异性试验结果表明,NP抗原可与H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体发生反应,经NP-ELISA检测为阳性的H9亚型AI血清样品能够被H9亚型AIV阻断,而NP抗原与新城疫等4种疫病阳性血清不发生反应。对223份待检鸡血清进行检测,NP-ELISA阳性检出率为96.86%(216/223),而血凝抑制试验、琼脂免疫扩散试验结果分别为93.72%(209/223)和81.61%(182/223),表明NP-ELISA是检测禽流感型特异性抗体的一种特异、敏感、快速、经济的血清学检测技术。     

河南省猪致病性大肠杆菌分离株的鉴定

从河南省 2 3个规模化猪场发生仔猪黄痢、白痢、水肿病的猪只十二指肠、小肠前端、心血和肝脏中分离出的致病性大肠杆菌 2 79株 ,用大肠杆菌 3 0种O抗原和K抗原 (K88、K99、987P)进行了血清型鉴定。用 2 0种抗生素对分离株进行了药敏试验。结果表明 :( 1)同一地区的不同猪场流行的主要血清型一般不同 ;( 2 )用单因子定型血清鉴定 ,大多数分离株为K88型 ,8种优势血清型占定型菌株的 69.3 5 % ;( 3 )致病性大肠杆菌存在着广泛的耐药性 ,敏感药物是头孢曲松、头孢唑啉。     

犬冠状病毒基因重组抗原间接ELISA检测方法的研究

以在E、coli高效表达的犬冠状病毒核蛋白为抗原,用辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗犬IgG为二抗,建立了检测犬冠状病毒抗体的间接ELISA方法。经方阵滴定确定出最佳反应条件为lμg／孔纯化的E．coli表达的重组N蛋白抗原包被酶标板,用10％的兔血清进行封闭,以正常E．coli裂解上清液稀释待检血清。结果表明：应用重组N蛋白作为诊断用抗原具有特异性强、稳定性高、成本较低等特点。