两种动物组织DNA提取方法的比较

本试验以猪耳组织为试验样本,采用酚-氯仿抽提方法[1]和DNA提取试剂盒方法进行DNA提取的对比试验,并通过核酸蛋白定量仪测量了DNA浓度和纯度,并进行了PCR扩增实验。试验表明,两种提取方法都可以进行PCR扩增试验,但采用试剂盒提取方法提取DNA可以直接进行PCR扩增,而酚-氯仿提取法需放置一段时间后效果好,并且采用试剂盒提取的DNA纯度高、速度快、节省耗材、结果稳定、重复性强,适合大量DNA提取试验。     

猪耳组织DNA的快速提取

采用一步法提取的猪基因组DNA,可直接用于PCR扩增、单链构象多态性(SSCP)分析及测序。操作步骤为:采取新鲜猪耳组织2～10mg,蛋白酶K消化,55℃1h,滤纸过滤消化产物。取孔径为1.2mm的滤纸(含有足量的DNA)作为模板进行PCR扩增。结果表明,提取的基因组DNA质量较高,PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和SSCP分析后可见清晰的条带,可进一步用于克隆测序。滤纸上的DNA干燥后可常温保存。该方法简单、快速,成本低,效率高,适用于大批量的基因分型,也可用于提取不同组织的基因组DNA。     

鸡抗菌肽LEAP-2基因克隆及序列特征分析

Ⅱ型肝表达抗菌肽(LEAP-2)是近年来在脊椎动物中发现的一种新型抗菌肽,并具有较强的抗微生物活性.本研究旨在以艾维茵肉鸡为实验材料,提取鸡全血DNA,通过PCR方法扩增抗菌肽LEAP-2基因,将PCR产物回收后,转化至克隆载体进行DNA测序,并将测序结果与GenBank公布序列进行对比,用ScanProsite对其蛋白质序列进行生物学信息分析.结果表明:扩增产物为150 bp大小的片段,基因序列与GenBank公布序列同源性高达100％,编码48个氨基酸残基,具有3个结构功能区7个功能位点.本研究为进一步探讨LEAP-2的功能奠定了基础.     

不同提取方法对食蟹猴粪便中结肠小袋虫PCR检测的影响

比较不同抽提方法对结肠小袋虫DNA提取效率的影响,从而获得一种高效、稳定的提取粪便样品总DNA的方法,继而为后续试验提供基础材料.采用3种商品化基因组DNA提取试剂盒和经典酚-氯仿法,分别对食蟹猴粪便样品进行DNA提取,作为模板,进行PCR检测,观察不同抽提方法对DNA扩增效果的影响.4种提取方法均能扩增出目的条带,粪...     

多重引物PCR特异性扩增微孢子虫DNA片段

利用几种引物的混合物,检验多重引物PCR早期检测不同种类家蚕传染性微孢子虫的适用性。结果是:当用目的微孢子虫的基因组DNA作为DNA模板时,用本研究设计的多重引物进行PCR可以扩增出特异性DNA片段。而当采用家蚕或其他微生物的基因组DNA作为DNA模板时,没有获得PCR产物。另外,只有当家蚕被各种微孢子虫感染时,多重引物PCR才能扩增出特异性ONA片段。当从受到家蚕微孢子虫感染的蚕卵中抽提基因组DNA作为DNA模板时,采用多重引物PCR也可以扩增出特异性DNA片段。从受家蚕微孢子虫感染的家蚕中抽提基因组DNA作为DNA模板时,也可以得到类似的结果。这些发现说明本研究设计的多重引物PCR适合用于蚕种微粒子孢子感染性检验。     

PCR技术在鼠金黄色葡萄球菌检测中的初步研究

根据已公布的金黄色葡萄球菌耐热核酸酶nuc基因的序列 ,设计并合成一对特异性的引物 ,利用PCR技术扩增nuc基因片段。对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株抽提的DNA进行扩增。结果金黄色葡萄球菌PCR产物出现 6 6 8bp的特异性DNA扩增片段 ,而其他非金黄色葡萄球菌未出现扩增片段 ,证实了合成的引物对金黄色葡萄球菌具有特异性。将抽提的金黄色葡萄球菌DNA进行系列稀释 ,测定此PCR体系的敏感性。结果显示 ,该PCR体系能检出 3pg金黄色葡萄球菌DNA ,且从抽提DNA到PCR扩增及电泳结束仅需 4h。因此 ,研究所建立的扩增耐热核酸酶nuc基因检测鼠金黄色葡萄球菌的PCR方法 ,具有快速、可靠、敏感和特异的特点 ,可用于临床样品和金黄色葡萄球菌感染时的检测 ,适合应用于实验大小鼠的监测     

动物产品的DNA提取方法

采用以异硫氰酸胍法为基础的提取方法分别提取牛肉、山羊肉、鸡肉、猪肉干、鱼粉、牛奶粉、牛奶、鱼油以及牛油中的DNA,18S rDNA片段的PCR扩增结果表明各样品已提取到DNA,且DNA中不含抑制PCR的物质。牛肉、牛奶粉、牛奶、加入牛肉DNA的鱼油和牛油的牛源性成分PCR检测结果为阳性;山羊肉和加入山羊肉DNA的鱼油的羊源性成分PCR检测结果为阳性;牛、羊源性成分PCR产物经酶切鉴定为非假阳性。这些结果显示本研究建立的动物产品DNA提取方法是可行的。     

基于线粒体12S rRNA基因序列鉴别牛肉的种源

在提取黄牛肉、牦牛肉和水牛肉总DNA的基础上,设计通用引物进行PCR扩增,电泳回收PCR产物后双向测序,再通过构建系统进化树鉴别牛肉的物种来源.PCR扩增获得的牦牛、水牛12S rDNA基因片段大小都为440 bp,黄牛12S rDNA基因片段大小都为439bp.参照引用的不同牛种12S rDNA基因序列,构建的系统进化树能够清晰地鉴别测序样品的牛种来源.因此,结合运用PCR扩增和DNA测序技术是一种精确可靠的方法,能够有效地运用于牛肉的种源鉴别.     

番鸭全血基因组DNA的提取与克隆

以柠檬酸葡萄糖溶液(ACD)抗凝的番鸭全血为材料,采用酚/氯仿抽提法和试剂盒法提取基因组DNA,并对基因组DNA进行PCR扩增、克隆并测序。结果表明,提取的基因组DNA纯度高,用琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA,主带清晰、无拖尾现象,无污染;通过PCR扩增有特异性条带出现,测序结果显示番鸭基因组DNA片段大小为868bp,与预期结果大小一致。     

从白羽王鸽的血液中提取基因组DNA方法的比较研究

禽类血液中的蛋白质含量较高,用传统方法提取其血液中的基因组DNA比较繁琐、纯度不高,而且提取的产物中有大量蛋白质残留。本研究采用改良的CTAB法从白羽王鸽全血中提取全基因组DNA,并以传统的酚-氯仿抽提的方法和TAKARA公司基因组提取试剂盒法作对照。结果表明：qCTAB法可以得到大量的、较完整的基因组DNA,并且纯度达到2．00,浓度达到了144．67ng/μL,完全可以满足PCR扩增限制酶切等实验的要求。     

东北地区部分犊牛感染贾第虫的基因型及基因亚型分析

采用巢式PCR方法鉴定东北部分地区牛源贾第虫的基因型。提取DNA后经巢式PCR扩增TPI基因，扩增产物测序后用BLAST和MEGA4．0软件进行同源性和系统发育分析。结果表明，吉林市和长春分离株属于蓝氏贾第虫的AssemblageE型；大庆分离株中蓝氏贾第虫的AssemblageE和AssemblageA型均存在。     

牛分支杆菌ag85b基因原核表达载体的构建

为构建牛分支杆菌ag85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出ag85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒。将此重组质粒转化入大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定。酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同。结果表明,成功地克隆并构建了ag85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b。     

基于线粒体12S rRNA基因序列鉴别牛肉的种源

 在提取黄牛肉、牦牛肉和水牛肉总DNA的基础上,设计通用引物进行PCR扩增,电泳回收PCR产物后双向测序,再通过构建系统进化树鉴别牛肉的物种来源。PCR扩增获得的牦牛、水牛12S rDNA基因片段大小都为440 bp,黄牛12S rDNA基因片段大小都为439 bp。参照引用的不同牛种12S rDNA基因序列,构建的系统进化树能够清晰地鉴别测序样品的牛种来源。因此,结合运用PCR扩增和DNA测序技术是一种精确可靠的方法,能够有效地运用于牛肉的种源鉴别。     

中麻黄叶绿体DNA序列不同引物扩增条件的筛选

目的:对16个不同居群的中麻黄从23对叶绿体编码区及非编码区DNA片段中筛选具有变异的叶绿体DNA片段。方法:通过试剂盒法提取DNA并梯度优化筛选扩增条件,PCR扩增产物经生物工程有限公司测序获得产物序列。结果:引物[trnS(GCU)-trnG(UCC)、atpB-rbcL、psbA-trnH、F71-R1516]能扩增出清晰、单一的条带。结论:16个不同居群中30个麻黄个体的叶绿体DNA扩增成功,初步筛选出具有变异的叶绿体DNA片段F71-R1516。     

牛分支杆菌αg85b基因原核表达载体的构建

为构建牛分支杆菌αg85b基因的重组表达质粒pET-32a-ag85b,采用聚合酶链反应(PCR)从牛分支杆菌AF2122/97基因组DNA中扩增出αg85b基因(978 bp),然后对扩增产物和载体pET-32a以核酸内切酶EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ分别进行双酶切;将两种酶切产物以T4 DNA Ligase连接,将靶基因克隆入载体pET-32a,构建重组质粒.将此重组质粒转化人大肠杆菌DH5α,抽提重组质粒首先经EcoR Ⅰ及Sal Ⅰ双酶切检验,再进行PCR扩增鉴定,最后测序鉴定.酶切片段及PCR扩增片段大小均与预期相符,测序结果与GenBank登录序列完全相同.结果表明,成功地克隆并构建了αg85b基因重组表达质粒pET-32a-ag85b.     

绵羊嗜皮菌病PCR诊断方法的建立

为建立动物嗜皮菌病的PCR检测方法,根据GenBank发表的刚果嗜皮菌属的部分16s-rRNA基因序列,设计了1对特异性引物.经PCR扩增,从发病绵羊皮肤病料提取的基因组DNA得到了大小约500 bp的DNA片段.将PCR产物克隆并测序表明,与GenBank发表的刚果嗜皮菌基因序列的同源性为90.632%.而猪胸膜肺麦放线杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌、肠球菌扩增结果为阴性;PCR的敏感性试验显示,这时引物能够检测到1 ng的DNA.表明此PCR方法特异性好,敏感性高,可用于嗜皮菌病的快速诊断.     

鸡核基因组中存在核线粒体DNA的实验证据

实验应用脉冲场电泳方法获得鸡核DNA,根据鸡线粒体DNA序列设计引物,以总DNA和核DNA为模板通过PCR扩增、测序和筛选鸡BAC文库方法。结果表明:鸡核DNA中普遍存在线粒体基因16S R NA、tR NA-Leu和部分ND1的同源序列;在鸡的总DNA为模板PCR中,扩增产物含有核线粒体DNA(numtDNA)产物;同时发现,该段numtDNA序列存在2个碱基突变位点。研究结果提示,在涉及PCR相关技术的mtDNA研究中,numtDNA的影响是不能忽视的。     

小鼠脑14-3-3ζ蛋白的基因克隆及鉴定

提取小鼠脑组织总RNA,采用RT-PCR法扩增14-3-3ζ蛋白的cDNA,将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体上,并用双酶切法和PCR法对结果进行鉴定。结果显示,RT-PCR扩增出1条大小约为738 bp的特异性条带,双酶切法和PCR法鉴定结果表明,PCR产物已被克隆到pGEM-T Easy载体中。DNA测序结果表明,所克隆的DNA片段与GenBank中已收录序列一致,表明小鼠脑14-3-3ζ蛋白重组pGEM-T克隆载体构建成功。     

应用复合PCR方法检测沙门菌的研究

参照文献报道的沙门菌Repeat se和hisJ基因片段的引物序列，设计并合成了2对引物，对沙门菌属和非沙门菌属的标准菌株及分离菌株进行了复合PCR扩增反应。结果，沙门菌PCR产物均出现199bp与495bp的特异性DNA扩增条带．而非沙门菌均未出现扩增条带，证明这2对引物具有沙门菌属特异性。将提取的沙门菌DNA做梯度稀释，测定该复合PCR体系的敏感度。结果表明，此体系可检出10^3CFU／mL菌液提取的DNA模板。应用上述方法，对进境鱼粉阳性样品进行了检测，均出现阳性结果。本研究表明，复合PCR是一种特异、敏感、快速的沙门菌检测方法，可应用于口岸系统鱼粉、肉骨粉的日常检测。     

对猪肝脏基因组DNA提取与纯化的研究

对血液中提取基因组DNA的方法加以改进,获得了一种提取猪肾组织中DNA的有效方法.试验表明,利用SDS裂解,氯仿、异戊醇抽提母猪肝脏中基因组DNA,得到的DNA纯度较高,可用来进一步进行RAPD分析和PCR扩增,用于各种分子生物学实验.