人视黄醇结合蛋白基因的毕赤酵母表达载体构建

用PCR方法从pGEX-hRBP中扩增人视黄醇结合蛋白(retinol bingding protein，prop)，用限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9，然后用T4连接酶将目的片段克隆到pPIC9载体中。分别用PCR方法和酶切方法验证了此载体构建成功，为下一步使用毕赤酵母进行真核表达人视黄醇结合蛋白打下基础。     

内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达

将人溶菌酶、内含肽、弹性蛋白3个基因串联插入巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得重组质粒pPIC-MIELYZ,经Pme I酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,经G418筛选阳性克隆,并用甲醇诱导表达,以探讨内含肽-弹性蛋白介导的人溶菌酶在毕赤酵母中的表达情况。结果表明:SDS-PAGE和Western blot证实表达的融合蛋白分子量正确,抑菌试验表明融合蛋白对微球菌具有良好的抑菌效果。说明融合基因在毕赤酵母中成功表达,为后继的纯化工作及新型毕赤酵母表达载体的构建奠定基础。     

膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

通过提取膜荚黄芪叶片总RNA进行反转录合成cDNA,根据GenBank上已发表的膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)核酸序列设计引物,从cDNA中扩增到PAL的开放阅读框区段,并将该区段亚克隆到pUCm-T载体上.通过设计与毕赤酵母表达载体pPIC9K具有同源区段的引物,从pUCm-T-PAL上扩增出带同源臂的PAL,利用体外同源重组技术将其克隆到pPIC9K中构建成pPIC9K-PAL表达载体.与传统的酶切连接载体构建方法相比,该方法可避免酶切位点可利用性的限制.将SalⅠ线性化的pPIC9K-PAL电转化至毕赤酵母GS115中,于2.0mg/mL G418抗性平板上进行筛选获得阳性克隆.经1%甲醇诱导120h后,重组菌株GS115/pPIC9K-PAL与负对照相比,其SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳图谱在77.96ku处有1条明显的蛋白带,大小与预期PAL蛋白一致.利用Q-Sepharose FF蛋白纯化柱对总蛋白进行纯化,获得了较纯的苯丙氨酸解氨酶.Bradford法测得纯化后PAL质量浓度为0.08mg/mL,含量占总蛋白的11.54%,最高比活达到4 270U/mg.     

家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace在毕赤酵母GS115中的表达及其分析

【目的】构建表达家蚕乙酰胆碱酯酶（BmAChE）的毕赤酵母菌株,实现BmAChE在毕赤酵母中分泌表达并对其活性进行分析。【方法】从家蚕头部提取总RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,通过PCR扩增出家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace并进行序列测定。采用PCR及重叠延伸PCR去除原bmace中的信号肽和疏水肽,并对序列中存在的2个A+T富含区进行同义密码子替换的改造。将改造后的bmace与表达载体pPIC9K连接,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,以Ellman法测定酶活力,毒扁豆碱和有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制试验分析重组BmAChE（rBmAChE）的生物活性。【结果】改造后的bmace经重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为70 kD的蛋白,具有AChE活性,酶比活力约为1 187 U•mg-1。抑制试验显示,该rBmAChE能够被毒扁豆碱强烈抑制,并且可被皮蝇磷等10种有机磷农药和克百威等5种氨基甲酸酯类农药抑制,最低抑制浓度IC50值可达2.78×10-10 mol•L-1。【结论】成功构建分泌表达BmAChE的毕赤酵母菌株,其表达了具有良好活性的rBmAChE,可用于进一步制备有机磷及氨基甲酸酯类农药快速检测分析制剂。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710株δC蛋白基因在毕赤酵母中表达

将番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC蛋白基因与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9Kσ-C,转化大肠杆菌DH5α,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9Kσ-C用内切酶SacⅠ线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合,采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达,通过SDS-PAGE和Western-blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了高效表达,并且具有免疫反应性。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。     

山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建及表达

从重组克隆载体pMD18-P32中扩增出山羊痘病毒P32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-P32.重组质粒pPIC9K-P32用Sal I线性化后,与毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组.采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达.SDS-PAGE和Western-blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31kD的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别.     

猪α干扰素在毕赤酵母中的高效表达和纯化

为了研制新型的猪用抗病毒制剂,开展了猪α干扰素（PoIFNα）在毕赤酵母中的表达和产物纯化研究。将PCR扩增的PoIFNα基因插入pPIC9k的SnaBⅠ和EcoRⅠ位点,构建了表达转移载体pPIC9k/PoIFNα;经酶切和测序鉴定,转移载体构建正确。pPIC9k/PoIFNα以限制性内切酶SalⅠ线性化后电转化毕赤酵母GS115菌株,经抗性筛选获得4拷贝PoIFNα基因的重组菌株GS115/PoIFNα;重组菌株经BMMY培养基诱导后上清中有目的蛋白,表达量达136 mg/L。表达产物经过SP-Sepharose 阳离子交换层析,可以得到纯度较高的rPoIFNα,纯化产物在MDBK细胞上抑制VSV的活性高达2.27×108 U/mg。     

利用透明颤菌血红蛋白基因vgb改造毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的研究

为了解决酵母发酵时贫氧限制目的蛋白表达量,利用透明颤菌血红蛋白基因vgb设计毕赤酵母分泌 型表达载体pPIC9K-vgb,并以人乳铁蛋白基因为目的基因转入毕赤酵母GS115。研究结果表明,该表达载体具 有转化操作简单、后期工程菌筛选简便、菌体耐低氧能力强、目的蛋白摇瓶表达量高等优点。该表达载体也可 以通过直接替换目的基因而用于其他蛋白表达系统的开发研究。     

微小毛霉凝乳酶的分泌表达、产物纯化及鉴定

采用基因工程的方法对微小毛霉(Mucor pusillus)凝乳酶进行分子改造,获得适于乳品工业生产用的凝乳酶,克隆到了微小毛霉凝乳酶基因,构建了酵母表达质粒pPIC9K/M。线性化后电击转入毕赤酵母GS115,在甲醇诱导下进行凝乳酶的初步发酵试验,通过pH反应及酶抑制反应试验证明,重组凝乳酶获得了分泌表达。SDS-PAGE分析表明重组凝乳酶的分子量约为46 kD,与理论值(45.3 kD)基本相符,培养基上清液中凝乳酶的活性为311.8 U/mL,纯化的总回收率为51.89%,纯度达到92%。     

果胶裂解酶、木聚糖酶及果胶裂解酶、木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

运用RT-PCR技术,从绿色木霉(AS3.3711)mRNA中扩增出木聚糖酶基因xyn2,并与质粒pPIC9K相连,构建了表达载体pPIC9K-xyn2,转化毕赤酵母GS115,并且将pPIC9K-xyn2和pPIC9K-PelC(果胶裂解酶)同时转化毕赤酵母GS115,通过组氨酸营养缺陷型筛选,G418高拷贝菌株筛选,以及摇瓶诱导表达筛选,分别得到一株高表达木聚糖酶毕赤酵母菌株X5和一株同时高表达木聚糖酶和果胶裂解酶毕赤酵母菌株PX6。同时,将一株高表达果胶裂解酶毕赤酵母菌株P2保存。重组酶酶学性质分析表明,P2和PX6分泌果胶裂解酶,X5和PX6分泌木聚糖酶最适温度均为50℃;P2分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为14.2U/mL;X5分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为5.8U/mL;PX6分泌果胶裂解酶最适pH5.4,最大酶活为12.6U/mL,分泌木聚糖酶最适pH6.0,最大酶活为4.2U/mL。     

透明颤菌血红蛋白对毕赤酵母菌体密度及表达的影响

将提高菌体发酵密度的透明颤菌血红蛋白基因vgb和腈水解酶基因bxn共同克隆进巴斯德毕赤酵母的分泌型表达载体pPIC9K而设计了重组质粒pPIC9K-vgbbxn,其中vgb胞内表达以提高菌体的发酵密度,bxn分泌表达.转化GS115菌株后,通过PCR、SDS-PAGE检测证实两基因已经整合进酵母基因组且能高效表达,摇瓶发酵试验证明,血红蛋白在贫氧条件下可明显促进酵母菌体生长和bxn基因分泌表达.     

重组水貂生长激素真核表达载体的构建及在巴斯德毕赤酵母中的表达

【目的】构建水貂生长激素（mGH）基因真核表达载体,并在巴斯德毕赤酵母GS115中进行表达,为大量获得水貂生长激素奠定基础。【方法】将体外合成的水貂生长激素基因插入分泌型表达载体pPIC9K。将重组的pPIC9K-mGH用SacI酶切后,LiC1法转化巴斯德毕赤酵母菌株GS115,经G418筛选后进行甲醇诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blot检测酵母上清中水貂生长激素的表达。【结果】酵母上清中可见与目的蛋白相对分子量（31kd）相符的条带,该条带可被水貂生长激素多克隆抗体特异识别。【结论】正确构建了水貂生长激素真核表达载体,该蛋白能在巴斯德毕赤酵母中成功表达。     

雪莲类PEBP基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了构建雪莲类PEBP基因真核表达载体,在毕赤酵母中表达并鉴定.将雪莲类PEBP基因开放阅读框序列克隆到真核表达载体pPIC9k上,转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞内,利用筛选到的Muts(methanol utilization slow)重组酵母株进行表达,经SDS-PAGE分析,表达产物置于低温条件下进行抗冻试验.结果在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带,大小为20 kD,与预期相符,上清液抗冻检测表明PEBP具有一定的抗冻性,表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达.该研究成功构建了真核表达载体pPIC9k-PEBP,获得了表达产物,并为进一步研究雪莲类PEBP基因的抗冻功能打下基础.     

黑曲霉内切β-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达

利用RT-PCR技术,提取黑曲霉(Aspergillus niger)L3的总RNA进行反转录,并通过PCR扩增得到去除天然信号肽的β-1,4-葡聚糖酶基因eg Ⅰ,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,使之位于α-因子信号肽下游,并与之同框,构建重组表达质粒pPIC9k-eg Ⅰ,电击转化毕赤酵母GS115,经MM、MD、CMC-Na和G418平板筛选,得到重组毕赤酵母工程菌1#和5#,在摇瓶中β-1,4-葡聚糖酶酶活分别达到1456 U/mL和1928U/mL.重组酶最适温度为70℃,最适pH为5.0.     

牛气管抗菌肽在毕赤酵母中的表达及条件优化

根据已发表的牛气管抗菌肽(bTAP)序列和酵母密码子偏爱性设计并合成一段bTAP DNA序列,将其与毕赤酵母pPIC9K质粒连接后构建了分泌表达载体pPIC9K-bTAP.获得重组质粒经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母GS115,通过G418抗性筛选获得了阳性转化重组菌.通过对重组菌培养条件的进一步优化,揭示了重组...     

新城疫病毒F48E9株F-HN蛋白融合基因在毕赤酵母中的表达

利用重叠PCR技术拼接新城疫病毒F蛋白基因和HN蛋白基因,并将构建好的融合基因克隆到载体pET28a,经测序后融合基因插入表达载体pPIC9K中,在启动子AOX I和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白F-HN.重组质粒pPIC9K-F-HN经Sac Ⅰ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,经G418筛选得到转化...     

Lactobacillus reuteri PYR8亚油酸异构酶基因在毕赤酵母中的表达

以Lactobacillus reuteri PYR8菌株基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增出亚油酸异构酶(linoleate isomerase,LI)基因,将其克隆至酵母表达载体pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115中.重组菌株GS115/pPIC9K-LI经1%甲醇诱导后,SDS-PAGE电泳表明该基因在酵母中得到表达,即分子量约为67 kD的重组LI蛋白.经SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析纯化获得了纯度为95%的重组LI蛋白样品.气相色谱分析表明,纯化的重组LI具有亚油酸异构酶的活性,酶的比活力为6.8 U·mg-1.     

鸡α干扰素在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达及抗病毒功能初探

为了研究鸡α干扰素(ChIFNα)基因的特性和功能,将鸡α干扰素的DNA序列克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达载体pPIC9K中,并转化入巴斯德毕赤酵母GS115菌株,用PCR技术鉴定阳性转化子。重组菌株GS115/pPIC9K-IFNα用1%甲醇诱导后,分泌表达重组蛋白,斑点杂交(dot-blot)检测IFNα具有免疫原性。细胞病变抑制法表明,表达产物有明显的抗鸡H9N2亚型禽流感病毒活性。     

Exendin-4-Tβ4融合蛋白在毕赤酵母中的表达研究

为实现Exendin-4-Tβ4(以下简称Ex4-Tβ4)融合蛋白在毕赤酵母中的表达,采用重叠PcR法扩增出有Ex4-Tβ4融合基因.将其克隆入表达质粒pPIC9KH,采用毕赤酵母GSll5作为宿主菌,利用电转化法将重组载体pPIC9KH-Ex4-Tβ4转入GSll5中,利用甲醇作为诱导物,对重组栽体进行诱导表达,成功构建重组质粒pPIC9KH-Ex4-Tβ4,SDS-PAGE证明Ex4-Tβ4在毕赤酵母中能高效表达,成功地在毕赤酵母中表达了Ex4-Tβ4融合蛋白.