羊口疮病毒安徽株116基因的生物信息学分析及原核表达

为了对羊口疮病毒（Orf virus, ORFV）安徽株116基因进行生物信息学分析及原核表达。以ORFVAH-F10株为模板PCR扩增116基因,使用生物信息学软件预测该基因编码蛋白的结构与功能。同时将扩增产物克隆至pET-32a（＋）原核表达载体,经BamH I及EcoR I双酶切鉴定后进行测序,构建pET-32a（＋）-116重组质粒。转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）进行IPTG诱导,纯化蛋白后免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体。测序结果显示,ORFV116基因全长561 bp,编码186个氨基酸。生物信息学分析结果显示：该蛋白分子量约为20.33 kDa,为不稳定亲水性蛋白;无信号肽、保守结构域及跨膜结构域;含有2个N糖基化位点和42个磷酸化位点;二级结构以无规则卷曲为主,分别为延伸链（5.91%）、α-螺旋（14.52%）与无规则卷曲（79.57%）;预测该蛋白含有20个可能的B细胞优势抗原表位与4个CTL细胞表位。SDS-PAGE及Western-blot结果显示,ORFV116蛋白大小约为51 kDa,主要以可溶形式表达且具有良好的反应原性。     

羊口疮病毒115基因的克隆及原核表达

【目的】获得羊口疮病毒（ORFV）115基因表达蛋白。【方法】利用Oligo 7软件设计并筛选出115基因特异性扩增引物,以ORFV FJ-ND株基因组为模板,通过PCR技术扩增获得其基因序列,再将115基因克隆至pGEX-6p-1上,重组质粒pGEX-6p-115,并对其进行测序鉴定,鉴定正确后转化RosettaganmiB(DE3)感受态细胞,通过优化IPTG浓度和诱导时间获得重组融合蛋白最佳表达条件,用SDS-PAGE对表达的目的蛋白进行分析。【结果】115基因全长450 bp,编码149个氨基酸;115基因可以在RosettaganmiB中表达,重组蛋白分子大小约42 kDa,主要以包涵体形式表达。【结论】成功克隆了ORFV 115基因,构建了pGEX-6P-115原核表达质粒,优化了重组蛋白表达条件并进行纯化,为进一步探索ORFV 115蛋白在感染宿主过程中的机制和作用奠定基础。     

羊口疮病毒重庆株F1L基因克隆与生物信息学分析

旨在分析OrfV-CQ株F1L基因的分子特点,预测其编码蛋白的生物学功能。对OrfV-CQ株F1L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,利用生物信息学相关软件进行序列分析并对其编码蛋白的二级结构、B细胞表位、T细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽进行预测。结果表明,OrfV-CQ株F1L基因长1 023bp,编码340个氨基酸,与Shanxi株F1L基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%和95.0%。OrfV-CQ株F1L基因编码蛋白的α-螺旋、β-片层、β-转角、无规则卷曲分别为11.21%、10.3%、2.73%、75.76%;可能存在5个B细胞优势抗原表位,3个CTL表位,4个Th细胞表位,无跨膜结构域和信号肽。     

猫传染性腹膜炎病毒AH1905株N基因的生物信息学分析及原核表达

为了解猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus, FIPV)在中国的流行与遗传变异情况,对新分离的FIPV AH1905株的N基因进行了克隆和序列比对分析,并利用生物信息学软件对N基因编码蛋白的二级结构进行了预测。最后,将N基因克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,在原核细胞中进行表达,并制备鼠源多克隆抗体。测序结果表明,FIPV AH1905株的N基因全长1 134 bp,编码377个氨基酸。序列比对分析结果显示,FIPV AH1905株与报道的FIPV参考毒株的核苷酸同源性为90.2%～92.4%,氨基酸同源性为91.8%～93.9%,与国内其他分离株位于同一进化分支,同属于FIPV基因Ⅰ型。对N蛋白二级结构预测结果显示,该蛋白具有高度亲水性,其二级结构主要由α螺旋(h)(14.06%)、延伸链(e)(15.12%)、β转角(t)(3.71%)和无规则卷曲(c)(67.11%)组成,无信号肽区域和跨膜结构域,存在48个潜在的磷酸化位点,含有6个潜在的B细胞抗原表位、2个CTL表位和2个Th表位。Western blot检测结果证明,...     

口疮病毒O2O基因的克隆、表达及多抗制备

羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病.O2O基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白.根据GenBank中O2O基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因.然后将其亚克隆至pET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET-32a-ORF-020.鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达.表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析.最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清.SDS-PAGE结果表明,ORFV O2O基因在体外获得正确表达,大小约37 kDa.Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与O2O蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性.     

口疮病毒O2O基因的克隆、表达及多抗制备

羊口疮是由口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的接触性、嗜上皮性的传染病。020基因是该病毒重要的酶活力调节蛋白。根据Gen Bank中020基因的序列设计引物,从ORFV-F10株感染的病料中提取DNA,PCR扩增获得目的基因。然后将其亚克隆至p ET-32a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒p ET-32a-ORF-020。鉴定正确后转化BL21感受态细胞,进行IPTG诱导表达。表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。最后将纯化的020蛋白免疫BALB/c雌鼠,制备多抗血清。SDS-PAGE结果表明,ORFV 020基因在体外获得正确表达,大小约37 k Da。Western-blot结果表明,制备的多抗血清能够与020蛋白发生特异性反应具有良好的反应原性。     

羊口疮病毒B2L基因的原核表达、纯化及反应原性分析

【目的】克隆和表达羊口疮病毒(ORFV)的B2L基因,进而纯化并分析其反应原性.【方法】根据GenBank已发表的ORFV(GQ328006)的B2L基因序列设计一对特异引物,以提取阳性临床样品的总DNA为模板,通过PCR方法获得ORFV的B2L基因,将该基因片段连接至原核表达载体pET-30a(+)上,获得重组质粒pET-30a(+)-B2L.将此重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,挑取单克隆进行扩大培养,经IPTG诱导获得重组融合蛋白.用SDS-PAGE和Western-blotting对表达的目的蛋白进行分析.【结果】成功获得重组质粒pET-30a(+)-B2L,读码框正确.获得了43ku的表达产物,与预期目的蛋白大小相符;纯化后的目的蛋白能与ORFV阳性血清发生特异反应.【结论】成功对ORFV-B2L蛋白进行了原核表达,且纯化后蛋白具有良好的反应原性.     

犬瘟热病毒OP株核蛋白基因的克隆与表达

以犬瘟热病毒OP株感染Vero细胞收获病毒提取的RNA为模板,根据已发表的犬瘟热病毒OP株序列设计两对引物,RT-PCR扩增出核蛋白基因的822、897bp片段。将PCR产物定向克隆进pGEX-6p-1载体中谷胱甘肽-S-转移酶基因的下游,再将重组质粒转化进宿主菌BL_(21)中,在37℃、1.0mmol·L~(-1)IPTG的诱导下,核蛋白基因分段获得了良好的表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,确定其表达融合蛋白质的相对分子质量分别为52、54ku。将表达产物回收后混合免疫小鼠,间接免疫荧光试验显示免疫小鼠的血清能与病毒感染的细胞呈现特异反应,表明体外表达核蛋白基因保留了天然蛋白部分的抗原性。     

H1亚型猪流感病毒广东株HA基因的原核表达

为了研制猪流感检测试剂和流感亚型特异性单抗筛选所需的重组抗原,本研究克隆和原核表达了H1N1亚型猪流感病毒的血凝素(hemagglutinin,HA)基因.首先采用RT-PCR方法扩增了H1亚型猪流感病毒(SIV)广东株的HA基因.测序结果表明,扩增的SIV HA基因cDNA长度为 1 701 个核苷酸,共编码566个氨基酸.BLAST分析表明,H1N1亚型SIV广东株HA基因核苷酸序列与GenBank中已发表的中国香港特别行政区、中国大陆、美国分离的经典H1亚型毒株相近,核苷酸序列同源性在89%以上.然后将HA基因的cDNA片段亚克隆至pET32a( )表达载体中,构建重组质粒pET32a-H1,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达.SDS-PAGE和凝胶扫描分析表明,HA基因在大肠杆菌中获得了高效表达,重组融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25.2%.经免疫印迹证实重组蛋白可以被SIV特异性抗体所识别.     

猪传染性胃肠炎病毒福建株M基因的克隆与生物信息学分析

对猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)福建分离株(TGEV-FJ 株)M基因进行克隆、测序,并利用生物信息学技术分析TGEV-FJ株M蛋白基因的同源性、信号肽、糖基化位点、磷酸化位点及其二级结构.结果显示,成功扩增出M基因完整目的片段(7...     

猪流行性腹泻病毒Nsp5基因的原核表达及生物信息学分析

旨在对猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)Nsp5基因进行原核表达,利用生物信息学软件,预测其编码蛋白的结构和功能,为了解PEDV致病机理奠定基础。本研究克隆PEDV/LY/2014/04毒株的Nsp5基因,亚克隆进pET-28a(+)原核表达载体,PCR和酶切验证重组质粒的构建,重组质粒pET-28a(+)-Nsp5转入E.coli BL21(DE3)中,SDS-PAGE检测Nsp5的表达和His band Ni+纯化情况,Vector NTI Advance等软件对Nsp5蛋白氨基酸组成、抗原表位、二级和三级结构进行预测和分析。结果表明,成功克隆并构建了重组质粒pET-28a(+)-Nsp5,表达重组蛋白大小约22 ku,且主要以包涵体形式存在,His band Ni+纯化后获得高纯度重组蛋白。Nsp5蛋白是由196个氨基酸残基组成的多肽,其分子质量的理论值为21 820.07 u,理论等电点(pI)为8.734,略偏碱;二级结构骨架中α-螺旋(h)占55.61%,β-折叠(t)占7.65%,无规则卷曲(c)占20.92%,延伸链(e)占15.82%;Nsp5蛋白质的三级结构中,中间段以α-螺旋为主作为骨架,C端多个复杂二级结构构成该蛋白的酶活性中心;B细胞抗原表位的预测,表明有15个潜在的B细胞优势表位。本研究为猪流行性腹泻病毒Nsp5蛋白质的生物学功能相关研究提供数据支持。     

传染性造血组织坏死病毒糖蛋白基因的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法扩增了传染性造血组织坏死病毒IHNV-ZYX株编码的糖蛋白(G)基因,将G基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌Rosetta( DE3)中得到了表达.SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小的G蛋白.提取G蛋白的包涵体,并制备抗血清.间接ELISA和Western-blott...     

猪细小病毒7型Cap基因原核表达与生物信息学分析

利用PCR方法扩增猪细小病毒7型(porcine parvovirus 7,PPV7)的Cap基因,将扩增产物克隆至pGEX-6P-1原核表达载体,构建重组质粒pGEX-6P-1-Cap,并进行测序鉴定。经鉴定正确后的重组质粒转化至E. coli Rosetta感受态细胞进行IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western-blot进行鉴定。同时使用生物信息学软件预测该基因编码的蛋白的理化性质、二级结构、信号肽和跨膜结构域等。结果表明,成功从病料中扩增到Cap基因并构建获得重组质粒pGEX-6P-1-Cap,诱导表达出大小约为78 ku的Cap蛋白,与预期相符。诱导获得的Cap蛋白能够与GST单抗发生特异性反应,具有良好的反应原性。生物信息学分析结果显示,该蛋白是亲水稳定蛋白,二级结构中以无规则卷曲(c)结构居多,占62.90%,α螺旋(h)、β转角(t)、延伸链(e)分别占11.09%、4.05%、21.96%,无信号肽区域和跨膜结构域,存在62个磷酸化位点,12个B细胞抗原表位,2个CTL表位和3个Th表位。本研究成功表达了PPV7 Cap蛋白并预测其生物学特性,为该蛋白质的生物学功能相关研究提供参考。     

牦牛C1H21orf62基因的克隆、生物信息学及表达分析

应用RT-PCR方法克隆牦牛C1H21orf62基因并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR方法检测C1H21orf62基因在有角牦牛和无角牦牛角芽组织的mRNA表达.结果表明,C1H21orf62基因编码区全长662 bp,编码161个氨基酸.C1H21orf62是一种亲水性蛋白,含有13个潜在的磷酸化位点,但无跨膜域和信号肽.C1H21orf62基因mRNA在无角牦牛角芽组织的表达水平极显著高于有角牦牛.     

蚕豆耐盐相关基因VfHKT1;1的克隆、生物信息学分析及表达特性

高亲和性钾离子转运蛋白(high affinity K+transporter,HKT)能够调节细胞及整株的Na+/K+转运,在植物盐胁迫调控中发挥着重要作用.采用RT-PCR和PCR方法克隆获得蚕豆VfHKT1;1基因全长编码序列,该基因包含1659 bp的开放阅读框,编码552个氨基酸.系统进化树分析发现,该蛋白属...     

马铃薯乙烯响应因子基因的克隆表达及生物信息学分析

根据番茄ERF5基因(NM_001247583.1)序列设计引物,采用RT-PCR方法得到马铃薯ERF基因的cDNA,并对其进行生物信息学及表达分析.结果表明:该cDNA全长789bp,阅读框为732bp,编码243个氨基酸.序列同源性分析表明该基因序列与番茄ERF5基因的序列同源性达82%,氨基酸序列同源性达70%.对该马铃薯ERF基因的氨基酸序列经BLAST进行多序列比对,发现该氨基酸序列的98～160bp为AP2结构域,属于AP2/EREBP转录因子的EREBP亚族ERF类.蛋白质三级结构预测表明该基因的AP2结构域非常保守.对ERF基因进行荧光定量PCR分析,表明该基因可能参与了马铃薯块茎解除休眠与发芽过程的调控.     

塞内加谷病毒3C蛋白生物信息学分析及真核质粒构建表达

3C蛋白是塞内加谷病毒重要的非结构蛋白之一,在病毒入侵机制及影响宿主抗病毒天然免疫方面发挥重要作用。试验应用Oligo 7.0和Primer 6.0软件,用BLAST对比SVV世界参考株,设计一对特异性引物。以SVV-SN株病毒液抽提RNA为模板,将序列连接pMD19-T载体后测序,对正确片段作生物信息学分析可知SVV 3C可编码一个较稳定非分泌型蛋白,具有一个保守"催化三联体"。预测发现该蛋白具有16个磷酸化位点,证明其较高活性,预测其二级结构后得到再次证实。将pMD19-SVV-3C和真核表达载体pcDNA3.1(+)双酶切后连接,重组质粒经鉴定后命名为pcDNA3.1(+)-SVV-3C。将pcDNA3.1(+)-SVV-3C转染到BHK-21细胞24 h后制样作Western blotting,成功验证该重组质粒可在BHK-21中真核表达。相比其他同科病毒,当前SVV 3C蛋白研究存在空白。文章旨在为进一步研究SVV 3C蛋白结构提供理论依据,为后续探索SVV 3C蛋白对于宿主作用机制奠定基础。     

香蕉MYB转录因子基因的电子克隆及生物信息学分析

采用电子克隆方法获得香蕉MYB基因.通过生物信息学方法,对此序列编码的蛋白质从氨基酸组成、理化性质、疏水性/亲水性、结构域及其空间结构等方面进行了预测和分析.结果表明:香蕉MYB基因编码序列全长1 266 bp,包含1 266 bp的开放阅读框,编码413个氨基酸,含有1个保守的MYB功能域、1个SANT保守结构域.在序列组成、理化性质、结构域及空间构象等方面,与小麦等其他植物的MYB转录因子具有高度的相似性.