对猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的佐剂作用

E515-A是一种含人参茎叶皂苷(GSLS)的白油佐剂。将E515-A和含猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗原的水相在低剪切力(转速200 r·min^-1)下混合,形成油乳剂疫苗。为观察E515-A对PEDV灭活疫苗的免疫增强作用,将72只ICR小鼠随机分成6组,分别进行2次(间隔2周)皮下注射:(1)0.9% NaCl溶液,(2)PEDV抗原+0.9% NaCl溶液,(3)PEDV抗原+GSLS,(4)PEDV抗原+白油佐剂,(5)PEDV抗原+E515-A和(6)PEDV抗原+氢氧化铝铝胶。于一免后24 h采血检测血清IFN-γ水平和NK细胞杀伤活性;于二免后检测血清特异性IgG及IgG1和IgG2a水平,制备脾淋巴细胞检测细胞增殖能力。结果表明,E515-A对于PEDV疫苗诱导的免疫反应具有显著的促进作用,免疫增强效果优于铝胶佐剂。和对照组比较,E515-A油佐剂可以显著促进免疫小鼠的NK细胞杀伤活性,促进细胞因子IFN-γ的产生,增强脾淋巴细胞对刀豆蛋白A(Con A)和脂多糖(LPS)刺激的增殖应答能力,提高血清IgG及其亚类IgG1和IgG2a水平。为增强猪的疫苗免疫效果,E515-A作为猪疫苗的佐剂值得进一步研究。     

人参茎叶皂甙对鸭禽流感疫苗的免疫增强作用和抗氧化功能的影响

为探讨人参茎叶皂甙(GSLS)对鸭流感疫苗的免疫增强作用和抗氧化功能的影响,给鸭群饮水口服GSLS,同时接种禽流感疫苗,通过检测血清抗AIV特异性HI效价、免疫器官指数、淋巴细胞增殖转化指数、细胞因子和肠黏膜SIg A水平,评价GSLS的免疫增强作用;通过测定血清丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)含量,评价GSLS对机体抗氧化功能的影响。结果表明:在28和35日龄时,饮水口服中剂量GSLS组鸭血清抗AIV特异性HI效价显著高于对照组(P0.05),与1份疫苗组相比,免疫后2、3、4周,饮水口服GSLS能诱导机体对0.75份疫苗抗原产生的HI效价提高,但是差异不显著(P0.05),1份+GSLS组鸭血清抗AIV特异性HI效价显著提高(P0.05);饮水口服GSLS能显著增强鸭脾脏和法氏囊指数(P0.05),显著提高受Con A刺激产生的脾淋巴细胞增殖转化指数,显著或不显著提高脾淋巴细胞上清中IFN-γ(Th1)和IL-4(Th2)水平,显著提高鸭肠黏膜SIg A含量;饮水口服中剂量GSLS组血清MDA和SOD含量分别显著低于和高于对照组(P0.05)。因此,饮水口服GSLS具有增强鸭群对禽流感疫苗的免疫应答水平和机体抗氧化功能的作用。     

桑杜口服液增强猪蓝耳疫苗免疫效果

拟考察桑杜口服液对猪蓝耳疫苗的免疫效果。选择100头健康仔猪,平均分为桑杜口服液高、中、低剂量组,免疫对照组和空白对照组。33日龄首次免疫接种猪蓝耳疫苗,1个月后进行二免,每次免疫前3 d灌胃桑杜口服液,每天1次,连用7 d。分别于首免后7、14、21、28 d采血,测定血清中猪蓝耳病特异性抗体水平,以及首免后7、14、21 d血清IL-2、IFN-γ、IgG含量,并于30日龄和60日龄时称体质量,比较各组指标的变化。结果表明,桑杜口服液高、中剂量组在首免后大部分时间均能显著提高血清中猪蓝耳病特异性抗体水平与血清IL-2、IFN-γ、IgG含量,并且中剂量组具有显著的促生长作用。表明桑杜口服液高、中剂量口服给药可显著提高猪蓝耳病疫苗免疫效果,可开发为中药免疫增强剂。     

猪流行性腹泻病毒血清IgG间接ELISA检测方法的建立

以大肠杆菌表达系统制备的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)中和抗原S1D(1μg/mL)每孔100μL进行包被,利用HRP-兔抗猪IgG(1∶20 000)建立了检测猪血清中抗PEDV IgG的间接ELISA方法。阴性判断临界值(M+2SD)为0.632,批内和批间检测的平均变异系数分别为2.3%和3.1%,该方法与商品化的PEDV抗体间接ELISA检测试剂盒同时检测50份临床血清样品,均为阳性,上述结果表明该方法可用于PEDV血清IgG的临床检测。     

猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

以乳化灭活的猪流行性腹泻病毒(PEDV)作为抗原,免疫大白兔,制备兔抗PEDV高免血清,纯化抗PEDV IgG并进行生物素标记。以体外表达的PEDV S蛋白作为抗原,商品化的PEDV单克隆抗体作为捕获抗体,生物素标记的IgG作为检测抗体,建立了检测PEDV的生物素-亲和素系统的双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法最低检测限量为20 ng/μL,且稳定性和特异性较好。对25份临床猪腹泻样品进行检测,3份检出PEDV阳性,与RT-PCR法的符合率为100%。本研究为PEDV临床检测提供了新方法,也为猪腹泻病原的多重检测技术研究奠定了基础。     

猪细小病毒病灭活疫苗佐剂筛选及配苗乳化工艺研究

为了筛选制备猪细小病毒病灭活疫苗(L株,悬浮培养)的佐剂,用注射用白油和法国赛比克公司生产的MontanideTMISA 206 VG佐剂(简称206佐剂)分别配制灭活疫苗,通过对两种疫苗的配苗乳化工艺、疫苗性状、无菌检验、安全检验、效力检验和免疫期等方面进行比较。结果显示:与注射用白油配制的疫苗相比,使用206佐剂配苗乳化工艺相对简单;制备疫苗剂型为水包油包水型,易注射,吸收良好;局部和全身均无不良反应,安全性良好;免疫后第7天猪细小病毒206佐剂疫苗免疫猪产生HI抗体效价显著高于白油佐剂疫苗,免疫后第60天猪细小病毒206佐剂疫苗免疫猪HI抗体效价达到峰值;免疫期为6个月。综上,确定206佐剂作为制备猪细小病毒病灭活疫苗的佐剂。     

猪流行性腹泻病毒S1蛋白的免疫原性评估

为了评估猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白的免疫原性,利用果蝇胚胎S2细胞表达重组S1蛋白,将纯化的S1蛋白免疫4周龄昆明小鼠,收集免疫血清及脾淋巴细胞,通过ELISA、病毒中和试验和流式细胞术等方法分析表达的重组S1蛋白的免疫原性。结果显示,与对照组(PBS)相比,重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠血清中特异性IgG抗体水平显著提升;二免后14 d,果蝇细胞重组PEDV S1蛋白免疫组小鼠的中和抗体效价达到1∶320;免疫后小鼠脾脏淋巴细胞具有更强的增殖能力;外周血CD3⁺T细胞百分比显著增加,CD4⁺/CD8⁺T细胞比值高于对照组;小鼠血清中IL-4、IFN-γ水平显著上升。综上,成功表达了重组PEDV S1蛋白,其可以诱导小鼠产生高效价的中和抗体,促进细胞免疫应答。     

Th表位肽与聚肌胞苷酸对猪O型口蹄疫合成肽疫苗的免疫增强作用

[目的]本文旨在研究Th表位肽和聚肌胞苷酸[Poly(I:C)]2种免疫增强剂对猪O型口蹄疫合成肽抗原细胞免疫和体液免疫的增强作用。[方法]将上述2种免疫增强剂分别与O型口蹄疫病毒(FMDV)合成肽抗原混合乳化,分组免疫Balb/c小鼠,分别在免疫后7、14、21和28 d检测小鼠血清中的VP1抗体、IL-4和IFN-γ水平,以及脾脏中T淋巴细胞转化率及脾脏组织形态变化。[结果]免疫后14 d Th表位肽疫苗组和Poly(I:C)疫苗组血清VP1抗体水平显著高于普通疫苗组(P0.05),免疫后28 d Th表位肽疫苗组显著高于Poly(I:C)疫苗组和普通疫苗组(P0.05)。细胞因子检测结果显示:免疫后14、21 d Th表位肽与Poly(I:C)疫苗组IL-4含量显著高于普通疫苗组(P0.05),免疫后14 d Th表位肽疫苗组IFN-γ含量明显高于其他组(P0.05),免疫后21 d Th表位肽与Poly(I:C)疫苗组IFN-γ含量显著高于普通疫苗组(P0.05)。Th表位肽与Poly(I:C)均可使试验小鼠脾脏白髓区增大,着色加深,动脉周围淋巴鞘胀大,Poly(I:C)疫苗组淋巴细胞增殖系数显著高于其他各试验组(P0.05)。[结论]Th表位肽和Poly(I:C)对猪O型口蹄疫合成肽抗原均有显著免疫增强作用,而Th表位肽可延长体液免疫持续时间。     

猪瘟疫苗冻干保护剂的筛选及免疫效果评价

为了筛选耐热性能好、能提高猪瘟病毒(SFV)疫苗经口服途径免疫效果的冻干保护剂,配比不同组分的冻干保护剂与黏膜佐剂LTRG蛋白、SFV按比例混合,通过对冻干工艺的优化,制备了4种.SFV的冻干苗;口服免疫小鼠,测定血清IgG和粘膜IgA抗体效价。结果表明:试验2组即甘氨酸+明胶组和试验4组即明胶组的外观形态较好,水溶后呈现澄清的状态;试验2组和试验4组的冻干苗经口服免疫,诱导小鼠产生的IgG抗体水平显著高于SFV组、SFV+LT组及其他试验组(P0.01)。二免7 d试验2组小鼠肛试子IgA抗体显著高于其他组(P0.01),且小鼠脾脏IFN-γ和IL-4细胞因子的表达量也极显著高于其他组(P0.01)。研究初步筛选出第2组配方,即以甘氨酸和明胶配伍作为猪瘟口服疫苗冻干保护剂,为研制口服途径免疫的猪瘟疫苗奠定了基础。     

黑蒜提取液对金葡菌Trap蛋白诱导特异性免疫应答的影响

为研究黑蒜提取液对抗原诱导机体产生的特异性免疫应答和免疫保护作用的影响,将小鼠随机分为佐剂对照组、Trap(Target of RNAIII Activating Protein)对照组、黑蒜高剂量组、黑蒜低剂量组、生蒜高剂量组、生蒜低剂量组。持续灌胃给药4周后免疫注射金黄色葡萄球菌Trap蛋白,2周后加强免疫。二免1周后收集小鼠脾淋巴细胞,用Trap蛋白体外刺激,检测淋巴细胞增殖及其分泌的细胞因子水平。二免两周后采集血清,间接ELISA法检测Trap特异性IgG及其亚类,并用金黄色葡萄球菌Newman菌株攻毒。结果显示:黑蒜提取物高剂量组和低剂量组能显著提高血清抗Trap IgG和IgG2a,上调IFN-γ、IL~(-1)7a分泌水平,促进淋巴细胞增殖,提高攻毒保护率,且明显优于生蒜高剂量组、低剂量组和Trap对照组。为Trap的增强疫苗免疫效果提供了实验依据。     

不同佐剂制备的鸡坦布苏病毒灭活疫苗免疫效果比较

以不同材料为佐剂制备坦布苏病毒灭活疫苗,用ELISA方法检测免疫鸡不同时间抗体产生的情况,以选择最佳制苗佐剂。取40只1月龄SPF鸡,随机分成8组,以不同的佐剂组合制备疫苗,免疫7个组(包括白油组、白油+IL-2组、铝胶组、铝胶+IL-2组、蜂胶组、蜂胶+IL-2组、IL-2组),另设不免疫对照1个组,分别于免疫前及免疫后1周、2周、3周和4周采血,用已建立的ELISA方法检测血清中的ELISA抗体,比较不同佐剂灭活疫苗的免疫效果。结果表明:以白油+IL-2作为佐剂组的灭活疫苗效果最好,产生的抗体水平优于其他各组,免疫后3周ELISA抗体可达到1∶800以上,是较理想的制备坦布苏病毒灭活疫苗的佐剂。     

不同佐剂制备的鸡坦布苏病毒灭活疫苗免疫效果比较

以不同材料为佐剂制备坦布苏病毒灭活疫苗,用ELISA方法检测免疫鸡不同时间抗体产生的情况,以选择最佳制苗佐剂。取40只1月龄SPF鸡,随机分成8组,以不同的佐剂组合制备疫苗,免疫7个组(包括白油组、白油+IL-2组、铝胶组、铝胶+IL-2组、蜂胶组、蜂胶+IL-2组、IL-2组),另设不免疫对照1个组,分别于免疫前及免疫后1周、2周、3周和4周采血,用已建立的ELISA方法检测血清中的ELISA抗体,比较不同佐剂灭活疫苗的免疫效果。结果表明:以白油+IL-2作为佐剂组的灭活疫苗效果最好,产生的抗体水平优于其他各组,免疫后3周ELISA抗体可达到1∶800以上,是较理想的制备坦布苏病毒灭活疫苗的佐剂。     

利用霍乱毒素B亚单位展示猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白主要抗原表位

为探讨以霍乱毒素B亚单位为载体制备口蹄疫亚单位疫苗的可行性,利用E.coli表达CTB-GHloop嵌合基因,用SDS-PAGE分析目的基因的表达及表达产物的可溶性,利用神经节苷脂(GM1)为抗原鉴定重组蛋白五聚体的形成。将目的蛋白浓度调整为200μg/ml,以白油佐剂乳化制备疫苗,免疫健康仔猪,免疫后利用ELISA测定特异性抗体水平,评价免疫后体液免疫反应,利用淋巴细胞增殖实验评价细胞免疫水平。结果表明嵌合基因在E.coli中获得高效表达,重组蛋白可溶,并能够形成五聚体;Western-blot结果显示重组蛋白能够与口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清发生反应;以每头仔猪200μg免疫,试验猪产生较高的抗体水平与细胞免疫反应。     

马尾藻多糖佐剂对猪PRRS疫苗免疫效果影响的研究

分别以马尾藻多糖的不同剂量与猪PRRS灭活抗原配制成完全佐剂疫苗,免疫5组非猪PRRSV免疫猪,并于首免的第0、20、40、50d采血,测定其体液免疫和细胞免疫水平。结果表明：（1）各马尾藻多糖佐剂组T淋巴细胞转化率（61.4%、65.0%、63.4%）均高于空白组1（52.8%）及普通佐剂疫苗组（59.6%）,各马尾藻多糖佐剂组与空白对照组间差异显著（P〈0.05）;（2）各马尾藻多糖佐剂组的T淋巴细胞亚群数量均高于空白组和普通佐剂疫苗组,其中以CD3的数量差异最明显（P〈0.05）,但马尾藻多糖组与普通佐剂疫苗组的CD8和NK细胞亚群的测定值差异不显著;（3）间接ELISA法测定各马尾藻多糖佐剂组血清中抗体的活性（0.631、1.015、0.688）均高于两对照组（0.518、0.568）,其中100mg/头份马尾藻多糖佐剂组与对照组间的差异显著（P〈0.05）。可见,以马尾藻多糖作为佐剂即可以提高体液免疫水平,又能增强细胞免疫功能,其中100mg/头份马尾藻多糖剂量的总体免疫效果最佳。     

黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳的制备及免疫佐剂效应研究

【目的】筛选制备W/O型黄芪多糖(APS)、紫锥菊提取物(EM)纳米乳佐剂的最佳配方,并考察该纳米乳佐剂的免疫效应。【方法】根据伪三元相图中纳米乳区面积的大小并结合肉眼观察,筛选制备黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳佐剂的配方,观测制剂的形态、粒径分布、pH、黏度及稳定性;以卵清白蛋白(OVA)为模式抗原,用含不同质量黄芪多糖与紫锥菊提取物的纳米乳佐剂免疫小鼠后,测定并比较血清OVA诱导特异性抗体水平的变化。【结果】制备黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳的配方中,Tween 80、Span 80、石蜡油、乙醇、水的体积比为3∶1∶1.5∶0.5∶1;所得纳米乳为淡黄色透明液体,透射电镜下呈圆球形,平均粒径45.2nm,pH 6.71,黏度4.60s,理化性质较稳定。用黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳和抗原同时免疫小鼠后,未见任何不良反应,且用黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳免疫的各试验组小鼠,其血清OVA特异性IgG、IgG1和IgG2a抗体水平均显著高于OVA抗原对照组(P<0.05),而各试验组的IgG、IgG1和IgG2a抗体水平无显著差异;只有APS 200μg+EM 200μg+OVA抗原组和APS400μg+EM 200μg+OVA抗原组的IgG、IgG1和IgG2a抗体水平显著高于铝胶(Alum)+OVA抗原组(P<0.05),且以APS 400μg+EM 200μg+OVA抗原组的3种抗体水平最高。【结论】黄芪多糖与紫锥菊提取物纳米乳佐剂制备方法简单,稳定性好,能显著增强机体抗体的产生能力,同时可以增强Th1和Th2的免疫应答反应,具有开发佐剂的应用价值。     

高效佐剂对猪细小病毒和圆环病毒二联灭活疫苗的免疫增强效果

为评价高效佐剂VA5对猪细小病毒和猪圆环病毒二联灭活疫苗的免疫增强效果,将VA5与猪细小病毒、猪圆环病毒疫苗混合免疫BALB/c小鼠和豚鼠。结果显示,VA5佐剂能明显提高猪细小病毒血凝抑制抗体效价和血清病毒中和抗体效价,亦能提高猪圆环病毒ELISA抗体和中和抗体效价,并可降低二种抗原的使用量。VA5佐剂显著提高小鼠和豚鼠免疫后的淋巴细胞刺激指数。攻毒后,VA5佐剂处理组动物脾脏PCV2/PPV病毒载量明显低于不含高效佐剂的免疫组。VA5佐剂能提高猪细小病毒、猪圆环病毒疫苗在小鼠/豚鼠中的抗体效价,提高细胞免疫力,降低攻毒后的排毒。     

新型免疫佐剂研究进展

免疫佐剂是一种能促进、延长或加强抗原免疫原性和免疫保护效果的物质。传统佐剂虽然副反应低,对许多抗原具有促进免疫反应的作用,但对某些抗原不表现或仅有很低的免疫增强作用。因此,研制和开发新型佐剂,已成为新疫苗研究中的一个重要领域[1~3]。1细胞因子佐剂细胞因子具有明显的免疫佐剂效应,可增强病毒、细菌和寄生虫疫苗的保护效应,激发对肿瘤抗原的免疫反应。具有佐剂效应的细胞因子有白介素1(IL-1)、白介素2(IL-2)、γ-干扰素和白介素-12(IL-12)。1.1白介素1(IL-1)白介素1是由抗原—抗体复合物、刀豆素A、脂多糖及胞壁酰二肽等诱…     

含佐剂蛋白的鸡新城疫冻干疫苗对雏鸡免疫效力的研究

研究了佐剂蛋白大肠杆菌热敏性肠毒素LTRG与鸡新城疫疫苗(NDV)联合冻干制品的免疫效果。选择不同剂量的佐剂蛋白与鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota抗原配比,按生产程序制备冻干疫苗。经滴鼻途径免疫雏鸡,检测血清抗体、粘膜抗体水平,分析不同配伍疫苗的免疫效果。结果表明:含4μg LTRG佐剂蛋白的NDV冻干疫苗,免疫雏鸡血清IgG抗体水平明显高于其他添加组及NDV疫苗组,差异显著;粘膜IgA抗体与NDV疫苗组比较,差异极显著。LTRG佐剂蛋白与鸡新城疫疫苗配伍制备冻干疫苗,能增强免疫雏鸡的免疫应答能力,尤其是可产生较好的粘膜抗体水平。     

双夹心ELISA检测猪传染性胸膜肺炎血清2型抗体方法的建立

用胸膜肺炎放线杆菌血清2型(1536)菌液与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化后免疫大白兔,制备兔高免血清,提纯抗体,建立检测猪传染性胸膜肺炎血清2型抗体的双夹心ELISA方法.方阵滴定确定最佳反应条件:包被纯化的兔抗App血清2型抗体为9.375 μg/mL,抗原稀释度为1∶1 600,HRP-兔抗猪IgG稀释度为1∶20 000.特异性与敏感性试验结果表明,双夹心ELISA方法特异性好、敏感性高,与猪O型口蹄疫、猪传染性胃肠炎、蓝耳病等阳性血清以及App其他血清型阳性血清无交叉反应.检测样品结果与阻断ELISA比较,其相符率为99.54%,表明双夹心ELISA可用于猪传染性胸膜肺炎血清2型抗体的检测.     

猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备及特性分析

为制备猪流行性腹泻病毒(PDEV)的单克隆抗体,并鉴定单克隆抗体特性。本试验采用差速和蔗糖梯度离心纯化PEDV抗原,免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合,经ELISA方法筛选和细胞克隆,得到能分泌鼠抗PEDV单克隆抗体杂交瘤细胞株,制备出相应的单克隆抗体,并分析其特性。试验结果:获得2株能稳定分泌抗PEDV的单克隆抗体,命名为E1和H6株,其中E1单隆抗体为IgG2a亚型,H6单隆抗体为IgM亚型,2株单克隆抗体均具有IFA、ELISA和Western bloting特性。E1杂交瘤细胞株的细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别26和105,H6杂交瘤细胞株的细胞上清液和腹水的ELISA抗体效价分别24和104。2株单克隆抗体与Vero细胞、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)均无交叉反应。Western bloting测定结果表明,E1株单克隆抗体能识别PEDV的M蛋白,H6单克隆抗体能识别PEDV的N蛋白。PEDV单克隆抗体的成功研制,为PEDV免疫诊断、表位识别及蛋白研究奠定了良好基础。