小麦黄花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

通过RT-PCR方法扩增获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的衣壳蛋白(CP)基因,将其连接原核表达载体p EHISTEV,并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达38 k D的融合蛋白。通过切胶回收的方法收集目的蛋白,免疫新西兰长耳兔,制备WYMV CP的多克隆抗体。间接ELISA测定该抗血清效价为1∶2 048,Western blotting分析表明该血清可以与病株中CP发生特异性反应,而与健康植株汁液无反应。该血清为WYMV的检测及CP功能的研究奠定了基础。     

酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒P2互作的寄主因子

小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus,WYMV)隶属马铃薯Y病毒科(Potyviridae),大麦黄花叶病毒属(Bymovirus).该病毒基因组是由两条正义单链RNA1和RNA2构成,共编码10个蛋白,其编码的P2在病毒的复制过程中发挥重要功能.文章构建了小麦cDNA酵母文库,通过共转试...     

山东小麦黄花叶病毒的分子检测与鉴定

利用RT-PCR对2012年山东10个地区送检的105个小麦样品进行了检测,从泰安、临沂、枣庄3个地区的样品中检测到了小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)。这3个地区WYMV分离物CP基因的核苷酸一致率为97.6%～98.3%,氨基酸一致率为98.3%～99.0%。在利用CP基因核苷酸序列构建的系统进化树中,这3个分离物均与WYMV分离物聚类到一起,其中枣庄分离物和河南分离物(FR828007)亲缘关系更近。     

小麦黄花叶病毒的血清学检测

利用间接ELISA对感染WYMV的小麦病叶检测,通过比较分析影响ELISA测定结果的包被缓冲液、抗血清及酶标抗体的浓度和种类,确立了较为稳定的反应体系.利用此ELISA检测体系并结合RT-PCR方法对从四川采集的田间小麦中WYMV进行检测,确定了有较高的检测灵敏度的检测系统,为田间大量小麦病样的检测提供有效、方便的方法.     

小麦黄花叶病毒P1蛋白原核表达、抗血清制备及其检测

用RT-PCR方法从感染小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)扬州分离物的小麦叶片中扩增获得该病毒P1基因的全长cDNA片段,并进行了序列分析。结果表明,P1基因编码区含有765个核苷酸,编码1个由255氨基酸组成分子量为28.2 kDa的蛋白。将P1基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中构建重组原核表达载体pGEX 6P-1-P1,经IPTG诱导,P1蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST-P1的融合蛋白,纯化并制备了P1蛋白的兔抗血清。利用此抗血清,可以检测WYMV病叶中的P1蛋白,但与提纯的WYMV粒子没有血清学反应,表明P1没有参与WYMV粒子的包装,是一种非结构蛋白。     

小麦黄花叶病毒P2蛋白原核表达、抗血清制备及其在感病小麦细胞中的定位

通过RT PCR获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)扬州分离物P2基因,并进行序列分析。P2基因编码区含有2 635个核苷酸,编码一个由875个氨基酸组成的分子量72 kDa 的蛋白。在原核表达体系中,该基因的全长表达较困难,因此将P2基因的5′端和3′端各设计大约1 kb亚克隆到原核表达载体pMAL C2X中构建重组表达载体MBP P2N,MBP P2C,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达MBP P2N和MBP P2C融合蛋白。MBP P2C融合蛋白经大量诱导、纯化、制备相应抗血清。用制备的抗血清可以有效检测WYMV病叶中的P2蛋白。免疫胶体金标记实验表明在感病WYMV的小麦叶片细胞膜状内含体结构中发现有大量胶体金颗粒特异性分布,表明P2蛋白可能与膜状内含体结构有关。     

小麦黄花叶病毒编码VPg蛋白N端结构是VPg与核仁蛋白Fibrillarin互作区域

小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员,其基因组是由两条正义单链RNA组成,共编码10个蛋白。其中,VPg（Viral protein genome\|linked）作为病毒末端结合蛋白,与病毒基因组RNA 5’端共价连接。利用软件分析WYMV VPg蛋白氨基酸序列发现其N端具有核定位信号（NLS）序列,C端具有核输出信号（NES）序列。通过激光共聚焦显微镜观察VPg与GFP融合蛋白在烟草细胞中的表达情况发现,GFP\|VPg主要定位于细胞核中。利用eYFP（n）标记核仁结构蛋白Fibrillarin与VPg进行双分子荧光互补实验发现,VPg与Fibrillarin互作且定位于细胞核中。根据VPg结构特点构建一系列缺失突变体与Fibrillarin的互作实验验证了它们之间的互作区域发生在N端NLS区域。     

土传线状小麦黄花叶病毒浦江分离物Nb基因的克隆及序列分析

根据已发表的日本小麦黄花叶病毒ＲＮＡ１核苷酸序列，设计了一对引物Ｎｂ０１／Ｎｂ０２，用来扩增浙江浦江土传线状小麦黄花叶病毒分离物Ｎｂ基因的全长序列。     

菜豆黄花叶病毒外壳蛋白(CP)序列分析

以菜豆黄花叶病毒分离物、蚕豆、豌豆为试验材料,进行了菜豆黄花叶病毒外壳蛋白(CP)序列分析。结果显示,目标片段中包含819 bp的外壳蛋白序列,编码273个氨基酸。分离物的外壳蛋白基因核苷酸和推导编码蛋白质的氨基酸序列的同源性分别为98.7%~99.9%和98.9%~100.0%。与65个菜豆黄花叶病毒外壳蛋白进行序列同源性和系统进化树分析的结果表明,菜豆黄花叶病毒青海蚕豌豆分离物与云南蚕豆分离物同源性最高。外壳蛋白的序列特征揭示,NAG为菜豆黄花叶病毒中病毒的蚜传相关基序。     

小西葫芦黄花叶病毒辽宁分离物的鉴定与序列分析

从辽宁省沈阳市和盖州市分别采集表现花叶的南瓜样品,经透射电镜负染色实验,观察到典型的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)线状病毒粒子.利用Potyvirus通用引物Legpoty F/LegpotyR分别对3个沈阳样品和3个盖州样品进行RT-PCR扩增,得到预期片段,克隆并测序.Blast显示6个病毒样本与小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)同源性最高,均大于99%.利用已经报道的特异引物ZYMV-F/ZYMV-R,从6个样本中扩增到约1.2 kb的ZYMV片段,片段包含完整的外壳蛋白(CP)基因.基于CP的核苷酸序列同源性分析,发现2个ZYMV辽宁分离物与山西分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14](KP742962)同源性最高,达99.1%和99.4%.系统进化树分析表明,2个ZYMV辽宁分离物与山西分离物ZYMV-[CN:SX:Chrysanthemum:14]聚集在一个分支,推测ZYMV辽宁分离物与山西分离物亲缘关系最近.     

驻马店地区小麦黄花叶病害病原鉴定与品种抗性评价

为了解驻马店地区小麦黄花叶病病毒分离物的类型及该地区主要推广小麦品种对小麦黄花叶病的抗性表现,对驻马店地区13个不同地点同一小麦品种上病毒分离物进行鉴定,并在同一田间试验条件下,对驻马店地区主要推广的12个小麦品种进行田间抗性评价。结果表明,随机选取的13个地点中有4个地点的样品中检测出小麦黄花叶病毒(WYMV),占总样品的30.8%,所有地点均未检测到中国小麦花叶病毒(CWMV)。在供试的12个小麦品种中,豫农416和衡观35表现为高抗,占供试品种的16.7%;泛麦8号和华育198表现为中抗或中感,占供试品种的16.7%;另外8个品种则表现为感病,占供试品种的66.6%。不同小麦品种在病圃区的产量及产量构成因素存在较大差异。以上结果表明,WYMV在驻马店地区有一定范围的分布,暂未检测到CWMV;该地区主推的小麦品种中豫农416和衡观35对小麦黄花叶病具有一定的抗性。     

Genome-wide identification and analysis of the regulation wheat DnaJ family genes following wheat yellow mosaic virus infection

The co-chaperone DnaJ plays an important role in protein folding and regulation of various physiological activities, and participates in several pathological processes. DnaJ has been extensively studied in many species including humans,drosophila, mushrooms, tomatoes, and Arabidopsis. However, few studies have examined the role of DnaJ in wheat(Triticum aestivum), and the interaction mechanism between TaDnaJs and plant viruses. Here, we identified 236 TaDnaJs and performed a comprehensive genome...     

长沙地区南瓜的小西葫芦黄花叶病毒检测及其分子进化分析

对长沙地区160份南瓜疑似病毒病样品进行小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)检测,检出率达46.9%。为进一步明确长沙地区ZYMV分离物的分类地位和分子进化特征,克隆获得了1个长沙地区ZYMV外壳蛋白基因,与Gen Bank已报道的ZYMV外壳蛋白基因比对,并进行基因重组、系统发生、遗传差异、选择压力、种群结构和基因漂流分析。结果显示:长沙地区ZYMV外壳蛋白基因没有发生明显的重组,突变与负选择作用是其进化的主要驱动力,种群结构相对稳定,但正处于扩张的趋势中;ZYMV不同分离物外壳蛋白基因形成3个有明显地理相关性的美洲、欧洲和亚洲种群,美洲和欧洲种群与亚洲种群之间基因交流不频繁,可能受到遗传漂变的影响,而欧洲种群与亚洲种群之间基因交流较频繁。     

小西葫芦黄花叶病毒dsRNA的原核表达及其对ZYMV的防治效果

【目的】小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)是危害西瓜最为普遍的病毒,在西瓜上利用外源喷施病毒基因dsRNA的方法实现对ZYMV的预防和治疗。【方法】首先以实验室已有的ZYMV病毒序列为依据,针对其不同的基因片段,利用NCBI数据库找出与其相似的序列。随后利用软件DNAMAN8对序列进行多重比对分析,找出其保守区域,根据分析结果选择长度介于200—350 bp的ZYMV 3′UTR、6K2、HC-Pro、P3、NIb 5个基因片段,同时选择长度为190 bp的GUS基因片段作为对照。PCR扩增得到这6个片段后,利用同源重组的方法将它们插入到含有双T7启动子的L4440载体中,并利用RNAⅢ酶缺陷型大肠杆菌HT115建立原核表达系统生产dsRNA,采用超声波破碎的方法释放dsRNA,利用TE(10 mmol·L^-1 Tris-HCl和1 mmol·L^-1 EDTA)缓冲液溶解dsRNA,最后比较和分析IPTG使用浓度、诱导时间以及超声波破碎时间对dsRNA表达和释放的影响。在西瓜植株上采用喷施...     

中国小麦花叶病毒(CWMV)侵染条件下小麦内参基因的选择

实时定量PCR(qRT-PCR)是分析功能基因表达水平的常用方法之一,qRT-PCR数据统计分析离不开合适内参基因的选择。为了选择中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus, CWMV)侵染条件下的小麦内参基因,本实验通过PCR扩增效率和扩增特异性分析,从10个持家基因中选择8个候选基因,然后以接种CWMV的小麦样品为材料,利用qRT-PCR技术进一步检测上述8个基因在CWMV侵染条件下小麦样品中的时空表达特性。基于这些数据,通过geNorm、NormFinder程序分析,结果表明,2个小麦基因(即26S和CDC)在CWMV侵染前后以及不同组织中表达最为稳定,26S和CDC组合可选作CWMV与小麦互作过程中功能基因表达分析的内参基因。     

郑州地区小麦黄矮病病原鉴定及其外壳蛋白的分子进化分析

为了明确郑州地区小麦黄矮病病原种类及其分子变异情况,根据已公布的小麦黄矮病致病毒株GAV,GPV和PAV的外壳蛋白(CP)全长基因序列,采用RT-PCR方法鉴定了来自郑州地区的4个分离物种类,并进行了基于CP序列的郑州分离物与6个国内和3个国外分离物的进化关系分析.结果表明,郑州地区的4个分离物均鉴定为BYDV-PAV(命名为PAV-ZZ),其编码的CP与国内及国外的分离物,在核苷酸水平上的一致性为81%～99%.PAV-ZZ CP与济南分离物一致性最高,核苷酸水平上达99%;与昆明和德国、瑞典、美国分离物一致性较低,核苷酸水平上仅为81%.这表明BYDV-PAV郑州分离物与北方地区的病毒分离物可能有着相似的系统进化特征,而与南方地区及国外分离物在系统进化上有较大的差异.