La（Ⅲ）对查尔酮合成酶（CHS）结构影响的初步研究

现已明确类黄酮是植物响应UV-B辐射、减轻其伤害的重要物质,查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是影响类黄酮合成与积累的关键酶之一.     

胡萝卜类黄酮含量的测定及DcCHS基因家族的鉴定分析

查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)是类黄酮合成过程中的第一个关键酶,具有重要的生理功能。测定胡萝卜不同发育时期、不同组织部位的类黄酮含量,并在全基因组水平上对胡萝卜CHS基因家族进行鉴定和分析。结果表明,无论在苗期还是收获期,胡萝卜叶中的类黄酮含量均极显著地高于根中的含量。叶中的类黄酮含量在不同发育时期无显著差异,而根中的类黄酮含量在不同发育时期却差异显著。胡萝卜基因组中共有12个DcCHS基因,分布于5条染色体上,氨基酸序列长度为253～398 aa,外显子1～3个。经预测,DcCHS蛋白均定位于细胞质,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主。DcCHS蛋白可分为ClassⅠ和ClassⅡ两类,含有10种保守基序,motif1、4、6、7为CHS蛋白N端结构域,motif2、3、8为CHS蛋白C端结构域。这些研究结果可为胡萝卜CHS基因的功能研究提供参考。     

植物查尔酮合成酶分子生物学研究进展

查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS,EC 2.3.1.74),是植物类黄酮物质合成途径中的第一个酶,也是植物次生代谢途径中的关键酶之一,对植物具有非常重要的生理意义。为此,综述了查尔酮合成酶基因结构、基因进化、表达调控机理以及诱导因子,概述了查尔酮合成酶基因工程在植物生理方面的研究,并进一步对查尔酮合成酶的分子生物学研究做了展望。     

大白菜查尔酮合成酶基因BrCHS1的克隆与特征分析

查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是类黄酮合成途径前期的1个关键酶。本研究从大白菜花瓣中克隆到1个查尔酮合成酶家族基因,命名为BrCHS1。序列比对发现BrCHS1氨基酸序列与其他物种CHS氨基酸序列的同源性多数在80%以上,利用实时荧光定量PCR技术分析BrCHS1在大白菜黄色和白色花各种花器官中的表达水平,结果表明:BrCHS1在黄色花瓣中的表达量远高于其他花器官。以FT50×H1的F2代分离群体为试材,根据BrCHS1周围序列设计SSR1引物,寻找与大白菜白色花基因紧密连锁的分子标记,结果显示,BrCHS1基因与白花性状基因并不连锁。     

栾树查尔酮合酶基因克隆与表达分析

  目的  查尔酮合酶(CHS)是苯丙烷途径的限速酶之一,在植物次生代谢物的合成中起着重要的作用。本研究通过对栾树CHS 基因进行克隆与生物信息学分析,以及分析栾树 CHS 基因表达与类黄酮合成的关系,期望为后续深入研究栾树类黄酮代谢途径其他相关基因、 CHS 基因家族以及锦叶栾呈色机制提供参考。  方法  以栾树叶片为材料,采用RT-PCR技术进行查尔酮合酶基因的克隆并进行生物信息学分析;通过实时定量PCR（qRT-PCR）技术分析 CHS 基因在栾树不同组织以及在5月、7月、9月的栾树和锦叶栾叶片中的表达模式;通过代谢组测定筛选出栾树与锦叶栾的类黄酮差异代谢物。  结果  克隆获得两个 CHS 基因的全长DNA,命名为 KpCHS1 和 KpCHS2 。其中 KpCHS1 序列全长为2 492 bp,ORF为1 173 bp,编码含有390个氨基酸的蛋白质; KpCHS2 序列全长为1 321 bp,ORF为1 182 bp,编码含有393个氨基酸的蛋白质;进一步的序列比对和系统发育分析表明,KpCHS1和KpCHS2蛋白高度同源,具有四个CHS特异性保守基序和一个查尔酮合成酶活性位点; KpCHS1 和 KpCHS2 在栾树根、茎、叶、种子中都普遍表达,其中, KpCHS2 在种子中的表达量最高, KpCHS1 在叶片中表达量高,而在根和茎中,两个基因的表达量相似且较低;表达模式分析显示,在栾树和锦叶栾叶片中,随着月份增加, KpCHS1 的表达量呈现出下降的趋势,而 KpCHS2 表达量未表现出明显的规律。在7月份的叶片样本中, KpCHS1 基因在锦叶栾中表达量显著高于栾树;代谢组结果显示,山奈酚-7-O-葡萄糖苷、7-羟基香豆素、槲皮素-3β-D-葡萄糖苷、以及类黄酮生物合成途径重要的中间产物山萘酚、柚皮苷等黄酮类物质在锦叶栾叶中含量显著升高。  结论   KpCHS1和KpCHS2属于栾树查尔酮合酶家族并且高度同源,但在系统进化树上分布在很远分支上,推测这两个蛋白在氨基酸活性催化功能上可能存在较大差异;KpCHS1和KpCHS2在根、茎、叶、种子中均有表达,且在叶和种子中较高。研究结果初步显示,KpCHS1基因与栾树类黄酮的生物合成高度相关。      

棉花查尔酮异构酶基因家族的鉴定及表达分析

为研究陆地棉查尔酮异构酶CHI（chalcone isomerase）在彩色棉纤维发育及响应胁迫中的作用，对陆地棉基因组中GhCHI基因家族进行鉴定，开展蛋白理化性质、结构域、启动子顺式作用元件、蛋白质高级结构、系统进化分析，利用转录组数据和实时荧光定量PCR分析其表达特征。结果显示，从陆地棉基因组中鉴定获得12个GhCHI基因家族成员，可分为2个亚家族，具有典型的查尔酮超家族结构域，编码201~452个氨基酸，主要为亲水性蛋白，二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主。GhCHI基因启动子顺式作用元件类型主要包含光反应元件、激素响应元件及参与类黄酮生物合成调控的元件等。表达分析结果显示GhCHI1、GhCHI2、GhCHI3、GhCHI4与纤维发育密切相关，尤其在彩色棉纤维发育后期的色素沉积着色时期表达水平较高；这4个基因在叶、花托、雌蕊中也具有较高的表达水平；GhCHI1、GhCHI2、GhCHI3在热胁迫、盐胁迫和干旱胁迫下均受到显著的诱导表达。GhCHI1―GhCHI4蛋白互作分析结果显示，它们可能和参与类黄酮合成的2-氧代戊二酸3-双加氧酶和类黄酮3''-单加氧酶等蛋白质存在相互作用。结果表明，GhCHI1、GhCHI2、GhCHI3和GhCHI4基因在彩色棉的纤维发育和胁迫应答中发挥重要作用。     

油果实中查尔酮合成酶基因PsCHS的克隆表达分析及其启动子的分离

从成熟果实均一化全长cDNA文库中分离了编码CHS基因的全长cDNA序列,命名为PsCHS,根据其序列设计引物,采用Genome Walking方法从基因组DNA中分离获得PsCHS基因上游的调控序列,命名为PsCHSp,PsCHS基因全长1 442bp,其中ORF 1 176bp,编码392个氨基酸;采用APA-Walking技术,获得该基因的5ˊ端调控区,经在线软件预测,启动子序列含有典型的结构特征元件TATA-box和CAAT-box,还包含光响应元件、厌氧诱导元件、胚乳表达相关元件、MYB结合位点以及激素响应元件;RT-PCR结果显示,PsCHS基因在果实发育的前期表达量较高,花后40d表达量最高,随后开始下降,果实成熟期表达量较低。分离获得的PsCHS基因属于查尔酮合成酶基因家族成员之一,查尔酮合成酶(Chalcone synthase,CHS,EC 2.3.1.74)是类黄酮合成途径中的一个重要酶,该基因可能对类黄酮的合成起到调控作用。     

菘蓝查尔酮合成酶基因(IiCHS)的克隆及其生物信息学分析

类黄酮是植物体内一类重要的次生代谢产物,对植物的生长发育有着重要的调节作用。查尔酮合成酶是植物类黄酮合成途径的第一个关键酶,在调控类黄酮的生物合成中起着决定作用。本研究采用RTPCR方法扩增得到一条菘蓝查尔酮合成酶家族蛋白基因,命名为IiCHS,全长1 273 bp,包含一个1 194 bp的ORF,编码397个氨基酸,分析其编码的蛋白质序列显示其属于查尔酮合成酶家族蛋白,定位于胞质中。该研究不仅有助于分析查尔酮合酶基因的功能,而且还为进一步利用该基因资源改良菘蓝品质奠定了理论基础。     

查尔酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用

[目的]克隆不同抗性葡萄品种中查尔酮合成酶(chalcone synthase)基因CHS1,明确该基因在葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)侵染下的表达模式,并对CHS1进行亚细胞定位和功能验证,为探究CHS1的广谱抗病作用机理提供依据.[方法]分别...     

玫瑰查尔酮合酶CHS基因的克隆及生物信息学分析

本研究旨在克隆玫瑰查尔酮合酶CHS基因并对其进行生物信息学分析,以期为利用基因工程技术改变玫瑰花色、培育玫瑰新品种奠定良好基础。以玫瑰品种‘唐红’(Rosa rugosa‘Tanghong’)为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了玫瑰查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)基因的c DNA全长。经生物信息学分析,该基因全长1416 bp,开放阅读框1167 bp,编码389个氨基酸,其蛋白的分子式为C1899H3043N505O562S18,相对分子质量为42.518 k Da,等电点为6.12。该蛋白不稳定系数低于40,为稳定性蛋白,无信号肽和剪切位点存在。其蛋白质二级结构主要由42.16%的α螺旋、29.05%的随机卷曲、10.54%的β转角和18.25%的延伸链组成。系统进化分析表明,玫瑰CHS基因与同科植物月季、草莓亲缘关系最近,与其他科及同科其他属植物的亲缘关系较远。本研究首次克隆了玫瑰CHS基因,获得了其生物信息学相关信息,探明了CHS基因在类黄酮生物合成过程中的重要作用,为改良玫瑰花色提供了理论依据。     

藤茶查尔酮合成酶基因AgCHS1的克隆及功能鉴定

【目的】查尔酮合成酶（chalcone synthase,CHS）是植物类黄酮生物合成的第一个关键酶,从藤茶中克隆AgCHS1,分析其序列特征及其在藤茶中的组织表达特异性,通过体外酶活性检测和烟草遗传转化对其功能进行鉴定,为进一步研究藤茶类黄酮累积的调控机理提供理论基础。【方法】根据藤茶转录组测序结果设计引物,以藤茶叶片cDNA和基因组DNA为模板,PCR扩增得到AgCHS1。利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA6和DNAMAN软件进行多重序列比对,并构建系统进化树。通过原核表达系统获得AgCHS1的重组蛋白,分析该重组蛋白对底物的催化活性,并通过高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）对酶促反应产物进行鉴定。利用qRT-PCR技术对AgCHS1在藤茶不同器官的表达水平进行分析,并采用硝酸铝比色法测定相应的总黄酮含量变化。构建植物过量表达载体,通过叶盘法转化烟草,筛选阳性转基因后代,对T₂代株系花瓣中的花青素和黄酮醇含量进行检测。【结果】AgCHS1的ORF长1 182 bp,编码393个氨基酸,基因组序列长1 315 bp,含2个外显子和1个内含子。生物信息学分析表明,AgCHS1为稳定的亲水蛋白。通过与其他物种的CHS蛋白多序列比对发现,AgCHS1含有查尔酮合成酶家族的特征序列和活性位点残基,包括丙二酰CoA结合位点和三联活性中心位点,与其他物种的CHS序列一致性较高。系统进化分析显示,AgCHS1与葡萄、山葡萄的CHS处于同一进化分支,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果表明,AgCHS1在成熟叶和花中的表达量最高,在老叶中的表达量最低。藤茶不同器官的总黄酮含量与AgCHS1表达水平呈显著正相关。体外酶活性分析显示,重组的AgCHS1蛋白可以催化底物对-香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成柚皮素,说明该蛋白具有查尔酮合成酶活性。获得5株烟草转基因阳性株系,其中2株的花瓣颜色明显加深;与对照相比,转基因株系OE3、OE4花瓣中的花青素含量分别提高56.6%和25.3%,OE3的黄酮醇含量没有显著差异,OE4的黄酮醇含量提高39.1%。【结论】AgCHS1是藤茶中催化合成查尔酮的关键酶,过量表达AgCHS1可以提高转基因植物中花青素和黄酮醇的含量。     

红麻查尔酮合成酶及其异构酶基因的克隆与表达分析

[目的]克隆红麻查尔酮合成酶(CHS)及其异构酶(CHI)基因并构建CH基因的植物表达载体,为进一步研究其在红麻育性及抗逆性中的作用奠定基础.[方法]提取红麻不育系(P3A)、保持系(P3B)花药RNA和DNA,以红麻花药转录组高通量测序数据为基础,利用同源克隆技术获得CHS和CHI基因,并利用载体重组技术构建CHS基因植物表达载体.[结果]红麻CHS基因cDNA全长序列为1236 bp,包含一个1170bp开放阅读框,编码389个氨基酸;其DNA序列全长为1329bp,包含2个外显子和1个内含子.CHI基因cDNA序列为724 bp,最大开放阅读框为630bp,编码209个氨基酸;其DNA序列全长为1087 bp,包含4个外显子和3个内含子.[结论]成功克隆获得红麻CHS和CHI基因的序列,构建的CHS基因植物表达载体pBI121-CHS可用于该基因功能的研究.     

菊芋查尔酮合成酶基因的克隆与表达分析

为揭示菊芋(Helianthus tuberosus L.)查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)基因的功能,以菊芋‘廊芋8号’叶片为材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,克隆得到菊芋CHS基因命名为HtCHS,其编码区全长为1 197 bp(GenBank登录号MN124515),编码398个氨基酸。HtCHS的基因组DNA(gDNA)全长为1 567 bp,含2个外显子和1个内含子。序列比对和系统进化树分析显示,不同植物中的CHS氨基酸序列具有极高的同源性,菊芋与同属的向日葵CHS氨基酸序列一致性达到99.25%,共聚于一个分支。HtCHS蛋白相对分子质量为43.61 ku,等电点为6.33。HtCHS蛋白具有查尔酮合成酶结构域,属于查尔酮合成酶超家族成员,HtCHS不含信号肽和跨膜区,属于非分泌蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,HtCHS在根中表达量最高。与对照相比,150 mmol·L~(-1) NaCl和20%PEG 6000处理6 h时HtCHS表达显著上调,处理12 h时显著下调。原核诱导表达分析结果显示,成功诱导出与预测蛋白大小一致的目的蛋白。     

巨峰葡萄查尔酮合成酶基因4的克隆及表达特性的RT-PCR分析

克隆了葡萄查尔酮合成酶基因4(CHS4),并采用半定量RT-PCR技术,以actin为内参,分析了CHS4在巨峰葡萄果实发育阶段不同组织的表达。对CHS4的序列分析表明:CHS4含有1个内含子,2个外显子;与CHS1、CHS2、CHS3在核苷酸水平的同源性分别为99.3%、92.6%和76.0%。半定量RT-PCR分析结果表明:CHS4在果皮、果肉、种子、叶片和根系中均有表达,在花后30d的果皮中表达强烈,随后迅速降低,到花后70d表达又增强;CHS4在花后30～45d的果肉中表达强烈,随后迅速降低;在花后45d的种子中也表达强烈,随果实发育,其表达逐渐下降。高温处理抑制CHS4在巨峰葡萄幼叶中的表达,但诱导CHS4在幼根的表达。     

类黄酮物质及查尔酮合酶在油菜性状改良中的作用

类黄酮化合物(Flavonoids)是一类重要的植物次生代谢产物,查尔酮合酶(CHS)是类黄酮物质形成步骤中的一个关键酶,影响植物的多种重要性状.油菜是重要的经济作物,许多植物的CHS基因已经被克隆并进行了基因工程的研究,但CHS与油菜性状发育的关系和分子机理的研究还十分欠缺.本文简略综述了类黄酮物质的结构、分布、功能、CHS基因在类黄酮途径中的重要作用、植物界CHS基因克隆和基因工程的研究进展,重点论述了CHS在油菜的种皮色泽、花瓣颜色、异花传粉、花粉育性、抗紫外线能力、茎表紫色、抗病能力等性状形成中可能的重要作用,并提出了通过对CHS基因的表达调控来改良这些性状的可能性.     

膜荚黄芪查尔酮异构酶基因的克隆及表达分析

查尔酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)是催化合成异黄酮类化合物的关键酶之一。本研究从膜荚黄芪中克隆了CHI基因cDNA全长,并对其进行了序列分析,同时采用紫外分光光度法测定异黄酮含量并进行了定量分析,为深入了解黄芪异黄酮类化合物生物合成机制奠定了分子基础。结果表明,AmCHI基因cDNA全长为910 bp,开放阅读框为660bp,编码219个氨基酸,其分子量为24 021.42 Da,等电点为5.41,Genbank登陆号为KY0862871。AmCHI蛋白定位于细胞质,无信号肽,属于稳定的亲水蛋白,氨基酸序列与豆科植物相似性较高,推测属于TypeⅡ型。总异黄酮含量根<茎<叶,CHI基因表达量根<茎<叶。     

查尔酮合酶蛋白表达技术、结构、活性和进化

查尔酮合酶(CHS)是类黄酮途径的首步关键酶,参与合成所有类黄酮和异黄酮物质,参与决定多种植物重要性状。NCBI已有2917条CHS序列登录和释放。单个物种基因组中的CHS普遍由基因家族编码,通过基因加倍而产生。CHS蛋白的表达技术目前均是基于大肠杆菌的原核表达,多采用Novagen公司的pET载体系统,最通行参数为37℃条件下1 mmol/L IPTG诱导3h,表达蛋白普遍采用His-Tag进行亲和纯化,采用质谱或免疫分析技术进行身份检测,通过对生化反应底物和产物的HPLC检测可以精确分析酶活。苜蓿等植物的CHS蛋白已完成X射线晶体衍射研究,获得了三维结构和活性位点构象的初步解析,并与植物Ⅲ型PKS超家族中的其它酶类进行了比较。CHS蛋白的催化活性中心含有一个Cys-His-Asn三联体,另外CoA结合通道和内部的起始/延伸/环化腔关系到CHS蛋白的底物特异性及聚酮化合物链延伸的长度。植物Ⅲ型PKS超家族中,其它酶的结构骨架和催化方式与CHS相似,但活性位点残基的变化可能会造成活性中心结构的改变,进而产生底物特异性、催化能力和产物种类的显著变化,是蛋白水平进化的根本动力。     

查尔酮合酶基因重复-歧化的遗传学效应

基因的重复-歧化是生物进化的重要机制。查尔酮合酶（CHS）是类黄酮途径的第一个关键酶,影响植物的多种性状。本文综述了CHS基因经重复-歧化后的假基因化、亚功能化、新功能化、基因互作这4种遗传学效应的表现和发生原因,并从系统发生的角度综述了亚功能化和新功能化的成员在分子进化树上的聚类式样。     

藜麦CqCHS1基因的克隆及胁迫下表达分析

查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)是植物类黄酮合成途径中的一个关键限速酶,参与植物中多个合成代谢途径,包括花青素合成。通过PCR反应成功克隆出藜麦CHS基因(CqCHS1)的cDNA全长序列,并进行预测分析,包括CqCHS1基因结构和编码的蛋白质保守结构域。同时,利用qRT-PCR技术检测了在不同胁迫处理下CqCHS1的表达情况。结果表明,CqCHS1基因包含2个外显子和1个内含子,其编码的蛋白质由392个氨基酸残基组成。CqCHS1蛋白是亲水性蛋白质,不存在信号肽,定位于细胞质。进化分析显示,CqCHS1与拟南芥AtCHS1的亲缘关系最近,其基因功能可能存在相似性。此外,还发现在CqCHS1基因启动子区域存在多个与胁迫和激素响应相关的顺式作用元件。表达分析结果表明,藜麦幼苗中CqCHS1的表达不会受到干旱胁迫的影响,而外源脱落酸(ABA)处理会抑制CqCHS1的表达,低温胁迫则会诱导CqCHS1的表达。本研究结果为进一步探究藜麦CqCHS1的基因功能提供了基础。     

何首乌查尔酮合成酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆何首乌查尔酮合成酶基因并作序列分析。[方法]以cDNA序列的保守区域设计引物,以何首乌 （ Polygonum multiflorum Thunb.）为材料,根据其他植物查尔酮合成酶（Chaleone synthase,CHS）基因eDNA序列的保守区域设计引物,利用RT-PCR和3＇-RACE进行克隆。[结果]从何首乌叶cDNA中克隆出了长度为1258bp的基因片段。序列分析表明,该片段具有典型的CHS基因家族的结构域,为何首乌的CHS基因片段,命名为PmCHS。将得到的序列提交GenBank,序列号为FJ601685。对获得的PmCHS的氨基酸序列进行比较分析,发现PmCHS含有Phe215,推测其能够催化聚酮的合成反应。何首乌CHS与其他植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明,其与同为蓼科的虎杖和掌叶大黄的同源性较近。[结论]何首乌查尔酮合成酶基因的成功克隆为蓼科植物中蒽醌的基因工程等研究打下了良好的基础。