少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶基因的克隆及生物信息学分析

为研究捕食线虫性真菌几丁质酶的功能,在国内首次对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-801和AO-483基因进行扩增、克隆及测序,并对其编码蛋白信号肽、疏水性与亲水性、高级结构、功能域进行预测和分析。结果显示,2个不同蛋白均具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶,无信号肽序列,表明这2个蛋白为非分泌型蛋白,二级结构以无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠为蛋白的主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构。系统发育分析表明,几丁质酶AO-801和AO-483与昆虫病原真菌几丁质酶的亲缘关系更为接近,说明它们所产生的几丁质酶在侵染宿主的过程中发挥着类似的功能,并且不同来源真菌几丁质酶根据分子质量的差异形成3个不同的进化分枝。     

少孢节丛孢菌胞外几丁质酶AO-379基因克隆及其表达分析

[目的]深入了解捕食线虫性真菌几丁质酶的生物学功能,为今后以少孢节丛孢菌重组几丁质酶AO-379研发线虫病生物防控制剂打下基础.[方法]克隆少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-379基因的全长序列,利用Signal P4.1 Server、InterPro、ExPASy等在线分析软件对其进行生物信息学分析;构建重组表达载体pET32a-AO-379,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后用IPTG进行诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting检测分析表达获得的融合蛋白.[结果]少孢节丛孢菌几丁质酶AO-379基因全长1475bp,含有1个1203bp的开放阅读框(ORF),编码400个氨基酸.几丁质酶AO-379基因序列与少孢节丛孢菌标准株(ATCC 24927)几丁质酶基因序列的同源性为97.08%,其推导氨基酸的同源性为98.75%.几丁质酶A0-379属于糖苷水解酶18家族,具有SXGG和VDGFDLDFE两个催化区保守序列.其中,SLGGS位于第127~131位,为底物结合位点;VDGFDLDFE位于第173~181位,为水解酶催化活性位点.经大肠杆菌诱导表达获得的融合蛋白AO-379相对分子质量为60.0kD,且能与抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生反应.[结论]少孢节丛孢菌几丁质酶AO-379可在大肠杆菌中成功诱导表达,且获得的融合蛋白AO-379能与抗少孢节丛孢菌多克隆抗体发生反应,可用于研发线虫病生物防控制剂.     

不同保存方法对少孢节丛孢菌存活及捕食活性的影响

为了探讨少孢节丛孢菌分生孢子及菌丝长期保存方法,以分生孢子萌发、菌丝生长、产生捕食器和捕食能力为指标,比较少孢节丛孢菌分生孢子及菌丝在不同保存条件下的保存效果。结果表明,在3种保存溶液中、-20℃条件下冻存3a的分生孢子没有萌发长出菌丝,而在4℃条件下保存3a的分生孢子仍可以萌发长出菌丝,且能产生捕食器捕食线虫。在固体培养基CMA和YPSSA生长的菌丝于-20℃或4℃条件下保存2a,菌丝仍可生长并产生捕食器捕食线虫;但在-20℃保存2a的菌丝复苏后接种对绵羊粪便中线虫的捕食活性较冻存前有所下降。研究结果提示,少孢节丛孢菌分生孢子可在3种保存溶液中4℃条件下及在固体培养基CMA、YPSSA中于-20℃或4℃条件下均可长期保存,但在3种保存溶液中4℃条件下菌株的捕食活性最高。     

温度和pH对捕食性线虫真菌分离株少孢节丛孢菌生长的影响及生物学特性观察

为了观察捕食性线虫真菌少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)的生长及pH值和温度对该菌生长的影响,试验将分离株少孢节丛孢菌丝接种于0.4g/L玉米粉琼脂培养基(CMA)中,分别置15、20、25、30、35℃恒温箱中培养,又将菌种分别接种到pH值为5.5、6.0、6.5、7.0的0.4g/L玉米粉琼脂培养基,每天定时观察菌株的发育情况,测量菌丝生长长度.结果表明:A.oligospora在pH值为5.5~7.0的环境下均能生长,其中以pH为6.0时生长速度最快;在温度为15~35℃时均能生长,其中以25℃时菌丝生长速度最快.此外,对真菌分离株生物学特性进行了描述和图片说明,特征为:分生孢子梗无色、直立、不分枝、分隔,分生孢子丛状着生、无色、具1个隔、梨形至倒卵形,捕食线虫的器官为三维粘性网.上述结果为进一步研究A.oligospora的生物学特性及批量化培养奠定了重要基础.     

少孢节丛孢菌DNA提取及18SrDNA基因序列扩增试验

对捕食线虫性真菌———少孢节丛孢菌的DNA提取及18SrDNA基因序列扩增方法进行了研究。结果表明:将少孢节丛孢菌接种于0.4g/L玉米粉液体培养基中,置20℃±1℃温箱中培养2周,其浓缩菌丝经细胞裂解液裂解,可用酚———氯抽提法提取DNA,以该DNA为模板,用真菌特异性PCR引物扩增后,少孢节丛孢菌18SrDNA基因序列的4个PCR扩增片段分别为597bp、555bp、377bp、310bp。     

捕食线虫性真菌—少孢节丛孢菌口服生物制剂安全性试验

为研究少孢节丛孢菌口服生物制剂的安全性,将20只6月龄绵羊分成4组,前3组分别灌服含有1.0×105、1.0×106、1.0×107少孢节丛孢菌分生孢子口服生物制剂,第4组为对照组灌服灭菌的生理盐水,灌服后连续30d观察绵羊的各项临床指标;并在7d后每组分别剖检2只绵羊,无菌采集绵羊各器官组织,进行组织切片和少孢节丛孢菌的分离鉴定;另外,将12只感染捻转血矛线虫后的绵羊分成3组,灌服3个不同剂量的生物制剂后测定其对粪便中线虫的捕食活性。结果表明,绵羊的精神状态、食欲、饮水、体温、粪便、增量正常;绵羊肝脏、脾脏、肾脏、肠道淋巴结等组织器官没有出现病理变化;也未从上述组织中分离出少孢节丛孢菌;3个不同剂量的生物制剂均可显著降低绵羊粪便中的幼虫数量。研究结果证实,少孢节丛孢菌口服生物制剂安全有效,无毒副作用。     

捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌（Arthrobotrys oligospora）CIMH1株形态学研究

捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌CIMH1株在不同发育时期有菌丝和孢子两种形态。只有在捕食对象－活的线虫幼虫存在条件下，该菌株才能产生捕食性结构－菌环、菌网等。菌环、菌风孢子具有一定的形态学特征。     

碳氮源对少孢节丛孢生长及捕食线虫能力的影响

[目的]探索不同碳氮源对少孢节丛孢生长及捕食线虫能力的影响。[方法]通过对菌株进行分离、接种与培养,观察、测定少孢节丛孢在含有葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉4种碳源和尿素、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵4种氮源培养基上生长时的菌落形态、大小、稠密度、菌丝粗细及其捕食线虫的能力。[结果]碳源不同,少孢节丛孢的生长及捕食能力不同。4种碳源中,可溶性淀粉的效果最好,最适合少孢节丛孢的生长,且菌丝捕食线虫的能力最强。3种无机氮源对少孢节丛孢生长及捕食能力的影响没有显著差异,但与有机氮源尿素的影响相比,差异较大。在含尿素的培养基中,少孢节丛孢生长速度最慢,但菌丝捕食线虫能力最强。[结论]碳源和氮源对少孢节丛孢的生长和捕食线虫能力均有明显影响。     

捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌CIMHI株捕食特性研究

报道了首次从国内土壤中分离出的捕食线虫性真菌少孢节丛孢菌 CIMHI 株(Arthrobotrys oligosporaStrain:CIMHI)对马线虫三期幼虫捕食活性、捕食效力以及杀虫机理。研究表明该菌株生长环境对其捕食活性有很大影响。其捕食活性在20℃、有氧环境、玉米粉浓度相对较低且菌丝较稀疏的培养基中最强,菌株的捕食活性是在马线虫三期幼虫体内存在的可以诱导少孢节丛孢菌 CLMHI 产生捕食线虫性器官的物质以及虫体运动刺激下产生的。其杀虫机理是通过菌株产生的收缩或不收缩的菌环粘性茵网菌丝,菌结等捕     

三种生境少孢节丛孢生长特性和捕食效力比较

比较分离自温泉、淡水及土壤的捕食线虫真菌——少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)的生长特性及捕食效力。通过测定三种生境少孢节丛孢在不同温度、p H及有氧和无氧条件下的生长率及其在最适培养条件下对线虫的捕食率,得出三种生境中少孢节丛孢的最适生长温度均为30℃,分离自温泉和土壤的少孢节丛孢最适p H分别为5.5~7.0和4.5~5.5,而淡水生境少孢节丛孢对不同p H具有广泛适应性;淡水和温泉生境少孢节丛孢对无氧环境有一定的耐受性,而土壤生境少孢节丛孢在无氧环境下生长率低至1.24 cm/5 d。三种生境的少孢节丛孢捕食效力没有显著性差异。     

菊花几丁质酶基因ChCHI的克隆及表达分析

根据GenBank发布的几丁质酶基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,克隆到菊花1个几丁质酶基因ChCHI(GenBank登录号为KX881373)。ChCHI基因cDNA全长为1 385 bp,包含960 bp开放阅读框,编码319个氨基酸。ChCHI属于亲水性蛋白,相对分子质量约为35.5 k D,等电点为6.38,为稳定蛋白,二级结构预测表明该蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主。蛋白序列比对和进化树分析表明,ChCHI基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族几丁质酶,与薇甘菊(ACO25187.1)几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,序列一致性为87%。qRT-PCR分析结果显示,SA处理可以明显提高贡菊叶片中ChCHI的表达量。菊花ChCHI在对抗环境胁迫的分子调控中起重要作用。     

二斑叶螨几丁质酶基因的克隆及特性分析

几丁质酶广泛存在于自然界的许多物种,并参与几丁质降解、蜕皮、免疫和致病性等诸多功能.采用同源克隆结合RACE-PCR的方法,首次从螨类中克隆到二斑叶螨几丁质酶基因(TuChi)的cDNA全长序列(GenBank登录号:JQ041366).TuChi全长1 822 bp,包含3'非翻译区(UTR)为150 bp和5'UTR为52 bp,开放阅读框(ORF)为1 620 bp,编码539个氨基酸.预测的相对分子量为60.7 ku,理论等电点为5.99.二斑叶螨几丁质酶具有几丁质酶典型的结构域,包括1个N-端信号肽序列、1个几丁质催化区域、1个几丁质结合域,以及连接催化区和结合域之间的连接区域.与其他物种几丁质酶进化树比较分析表明,TuChi与昆虫几丁质酶家族Group 1具有较高的同源性,推测其与二斑叶螨的蜕皮密切相关.     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht2基因的克隆及特征分析

【目的】拟克隆朱砂叶螨几丁质代谢中的关键基因几丁质酶基因,并对其进行特征分析。【方法】利用转录组拼接技术对朱砂叶螨转录组进行拼接,根据叶螨几丁质酶序列通过BLAST找到朱砂叶螨几丁质酶相似序列,设计PCR引物,进行朱砂叶螨几丁质酶基因克隆,分析其详细特征。利用SWISS MODEL预测其蛋白结构,特别是催化功能区的结构。【结果】测序分析确认为朱砂叶螨几丁质酶基因序列,并提交到GeneBank(KY705296),其开放阅读框为1 875bp,编码624个氨基酸,C端有几丁质结合区。根据新的几丁质酶分类,判定TecCht2为Ⅵ型几丁质酶,其结构具有典型的几丁质酶结构特征。【结论】本研究克隆得到的朱砂叶螨几丁质酶基因,为今后几丁质酶功能和用于害螨防治研究奠定基础。     

5种植物花瓣ACS基因的克隆与分析

分析已发表的植物1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）合成酶（ACS）基因序列,设计一对简并引物,在随机选择的非洲菊、月季、桂花、茶梅和山茶等5种植物花瓣cDNA中进行PCR扩增．结果表明,在5种植物花瓣中都能扩增出约800bp的特异片段,登录GenBank发现均未被注册,因此将序列提交到GenBank并获得了序列号．在NCBI上进行Blast比对,发现所克隆的5个Acs基因均与其他植物花瓣的ACS基因有一定的序列相似性,最高达94％,最低为80％．将5个ACS基因的片段进行多序列比较分析,发现茶梅ACS基因与山茶ACS基因的序列差异最小,序列相似性达99％．本试验设计的ACS基因简并引物在植物中有一定的通用性,后续可以适当调整引物的简并度,以得到高通用性的简并引物．     

猪TDRP1基因的电子克隆及生物信息学分析

利用生物信息学和比较基因组学方法,对猪TDRP1基因的结构、表达及功能进行分析,结果表明:(1)电子克隆获得猪TDRP1基因cDNA部分序列共776bp,包括119bp的5′UTR、561bp的编码区和96bp的3′UTR,共编码合成187个氨基酸多肽;(2)猪TDRP1基因CDS序列与人、小鼠和大鼠的同源性分别为85%、76.1%、77.1%.编码合成的猪TDRP1蛋白与人、小鼠、大鼠之间的同源性分别为82.5%、71.1%和70.1%;(3)猪TDRP1蛋白的相对分子质量为20489.8,不含信号肽,为1个可溶性蛋白,同时也是1个非分泌性蛋白,存在4个二级结构区段;(4)基于cDNA及EST数据库的检索显示,猪TDRP1基因至少在卵巢和甲状腺等组织中表达.