马铃薯StDWF1基因克隆及表达分析

DWF1是油菜素内酯(BR)生物合成途径中的关键基因。为探索StDWF1在马铃薯生长发育中的功能,本实验以马铃薯品种费乌瑞它(Favorita)试管苗为材料,克隆StDWF1基因全长序列,开放阅读框(ORF)为1 704 bp,编码567个氨基酸,蛋白质相对分子质量为66.08 ku,理论等电点为7.96。利用农杆菌介导法在烟草中瞬时表达StDWF1,共聚焦显微镜观察显示StDWF1定位于细胞质。荧光定量分析表明,嫩叶中StDWF1表达量最高,其次是老叶、匍匐茎、主根、茎、块茎。对马铃薯生育期叶片StDWF1表达量进行分析,结果表明在出苗期表达量最高。本实验结果为进一步阐释BR对马铃薯生长发育的调控机制奠定理论基础。     

华山松大小蠹2个甲羟戊酸路径基因的克隆与表达

香叶基二磷酸合酶/法尼基焦磷酸（G/FPPS）和异戊二烯焦磷酸异构酶（IDI）是单萜和倍半萜生物合成途径分支点的关键酶。通过克隆华山松大小蠹DaG/FPPS和DaIDI基因的全长序列,预测基因和编码蛋白的性质、结构和功能,并对序列特征和不同发育时期（幼虫、蛹、初羽化期成虫和扩散期成虫）以及不同组织（头、前中肠、后中肠、后肠和剩余躯体）DaG/FPPS和DaIDI表达的研究,旨在揭示DaG/FPPS和DaIDI在华山松大小蠹信息化学物质合成中的分子调控机制。采用RT-PCR和RACE克隆华山松大小蠹DaG/FPPS和DaIDI基因,DNAStar、Blast、ExpasyProtscale、SignalP 4.1、PSORT和TargetP等多种生物信息学方法对基因全长cDNA序列、基本理化性质、系统进化关系、信号肽和蛋白亚细胞定位等进行分析。用Real-time PCR检测DaG/FPPS和DaIDI在华山松大小蠹不同发育时期和不同组织中的表达。结果表明,克隆获得华山松大小蠹香叶基二磷酸合酶/法尼基焦磷酸DaG/FPPS和异戊二烯焦磷酸异构酶DaIDI全长cDNA序列,分别命名为DaG/FPPS和DaIDI,DaG/FPPS编码的氨基酸序列与山松大小蠹DpF/GPPS相似度最高达95%,氨基酸序列含有一个RALS 四肽基序、7 个异戊烯基转移酶保守区（Ⅰ-Ⅶ）和2个典型的DD**D的天冬氨酸富含区;DaIDI编码的氨基酸序列与山松大小蠹IDI相似度最高,达到92%。Expasy Protscale结果表明DaG/FPPS蛋白疏水性氨基酸明显多于亲水性氨基酸,推测其为疏水性蛋白,而DaIDI蛋白亲水性氨基酸数量大于疏水性氨基酸,故推测DaIDI为亲水性蛋白,有较好的水溶性。信号肽预测结果表明,DaG/FPPS和DaIDI均不含信号肽,TargetP结果表明,DaG/FPPS和DaIDI蛋白含线粒体靶向肽,结合PSORT结果推测DaG/FPPS和DaIDI均定位于线粒体。华山松大小蠹DaG/FPPS和DaIDI在不同发育时期和不同组织中均有表达,其中完全羽化期与扩散期成虫保持一致,该阶段表达量最高,不同组织中前中肠表达量最高。     

紫薇花器官发育调控基因LiFUL1的分离与表达分析

紫薇湘韵具有只开花不结实的特性,表现为花药不开裂、花粉败育、胚珠发育异常。紫薇红叶为普通紫薇,可正常开花结实。以紫薇湘韵为试验材料,采用RT-PCR方法,从花芽中分离得到1个FRUITFULL(FUL)同源基因,命名为LiFUL1(GenBank登录号为MN894547)。序列分析结果表明,其cDNA开放阅读框长度为753 bp,编码251个氨基酸,分子质量为28.453 13 ku。序列比对和保守结构域分析结果表明,LiFUL1基因编码蛋白具有典型的MADS-MEF2和K-box 结构域,C末端含有一个保守性高的基序euFUL MOTIF,因此,LiFUL1属于MADS家族的FUL/AP1亚家族。进化分析表明,紫薇的LiFUL1基因编码的蛋白氨基酸序列与木本植物蓝桉的FUL/AP1氨基酸序列亲缘关系最近。qRT-PCR分析结果表明,LiFUL1基因在紫薇湘韵花器官分化阶段的花萼分化时期、花瓣与雄蕊分化时期、雄蕊与雌蕊分化时期的表达量显著高于紫薇红叶。另外,利用原核表达系统在大肠埃希菌中成功表达了LiFUL1蛋白,为进一步研究LiFUL1基因的功能奠定了基础。     

马铃薯StSnRK2.4基因的克隆及其序列特征分析

利用RT-PCR技术从马铃薯普通栽培品种‘陇薯3号’试管苗根部扩增得到StSnRK2.4基因的cDNA序列,并对其编码蛋白进行特性和结构分析.结果表明:该基因序列全长1 083bp,编码360个氨基酸,与烟草SnRK2家族基因具有较高的同源性,达95.56%,已注册该基因到GenBank(No.JX280914);该蛋白分子量为41.49kU,理论等电点为5.52,是一个不跨膜的膜内蛋白,主要存在于细胞核中,含有依赖cAMP/cGMP蛋白激酶磷酸化、蛋白激酶C磷酸化、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、酪氨酸蛋白激酶磷酸化和豆蔻酰化位点,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性位点信号序列和蛋白激酶ATP结合区域信号序列,推测该基因功能与植物抗逆境胁迫有关.     

林麝生长激素基因的克隆与生物信息学分析

了解林麝生长激素（GH）基因序列结构特点,为进一步研究GH基因的结构功能遗传变异规律及其与生长性能的关系提供科学依据。根据GenBank上已公布的绵羊全基因组GH基因序列设计合成4对特异性引物,以林麝基因组DNA为模板进行PCR扩增,将所获得的序列拼接,获得林麝GH基因CDS区序列,采用ExPASy等分子生物学工具对林麝GH蛋白的理化性质、二级结构、蛋白功能等进行预测。结果表明,林麝GH基因CDS区全长657 bp（GenBank登录序列号为KU296865）,编码218个氨基酸。α-螺旋结构和卷曲结构构成了林麝GH蛋白二级结构的骨架,为跨膜蛋白,同时第1~26位氨基酸为信号肽,第27~218位氨基酸残基为生长激素结构域。进化分析结果表明,林麝与羊的关系最为接近,在分子水平上符合物种进化理论。本研究成功克隆了林麝GH基因CDS区序列,其序列保守性强,为下一步林麝GH基因的表达调控、进化和多态性分析奠定了基础。     

油菜miR169基因家族的生物信息学分析及靶基因预测

为了解油菜miR169基因家族,采用生物信息学的方法对油菜miR169基因家族成员的染色体位置、分子进化、前体序列的保守性、启动子和靶基因进行了分析。结果表明:油菜miR169基因家族成员分布在9条染色体上;系统进化分析表明,这些基因共分成2个组;其前体序列在形成成熟miRNA的位置高度保守;油菜miR169基因家族上游启动子主要元件有13个,数量最多的是胚乳表达元件、厌氧胁迫元件、热响应元件和MBS;油菜miR169基因家族的靶基因一共有16个,大部分属于NF-YA基因家族。该结果为进一步研究油菜miR169基因家族的功能奠定了基础。     

抗性稗草1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因的克隆与表达分析

【目的】克隆稗草（Echinochloa crus-galli）乙烯生物合成途径关键酶1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因（EcACO）,对其进行表达分析和酶活性测定,以探究稗草抗二氯喹啉酸的机理。【方法】根据转录组测序所得EcACO部分序列设计引物,分别从二氯喹啉酸的抗性和敏感型稗草中克隆EcACO的全长序列,用DNAman以及GeneDOC等软件进行序列分析。用qRT-PCR方法分析抗性和敏感性稗草间的EcACO表达水平差异。最后分别将抗性和敏感性稗草EcACO的开放阅读框（ORF）序列连接至原核表达载体pMAL-c5x中,并转化至大肠杆菌菌株BL21,经终浓度为0.4 mmol·L^-1的IPTG于18℃诱导16 h后,检测EcACO蛋白的表达情况。采用MBP吸附柱分离纯化EcACO蛋白后,通过测定乙烯释放量,测定抗性和敏感稗草EcACO蛋白间的活性差异。【结果】克隆得到抗性稗草和敏感稗草EcACO,其编码区序列长度为936 bp,预测蛋白含311个氨基酸残基,蛋白分子量大小和理论等电点分别为35 kD和5.4。序列比对表明,抗性稗草EcACO氨基酸序列与粟（Setaria italica）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）同源性分别为93%、92%和91%;与敏感性稗草EcACO相比,抗性稗草EcACO的氨基酸序列存在5个突变位点,其中有3个突变位点位于保守功能域上。qPCR分析显示,EcACO在抗性和敏感性稗草中并无明显的表达水平差异。原核蛋白表达和酶活性测定结果表明,敏感型稗草MBP::EcACO融合蛋白单位时间内产生的乙烯释放量是抗性稗草MBP::EcACO融合蛋白的2.15倍,因而该基因可能解释了稗草的抗药性机理。【结论】从抗二氯喹啉酸的稗草中克隆了EcACO,发现了与抗性相关的5个氨基酸突变位点,其中的3个位点突变位于保守结构域,这可能是引起乙烯释放速率降低以及稗草产生二氯喹啉酸抗性的原因。     

大豆NIP类水孔蛋白基因的鉴定及表达特性分析

NIPs(nodulin 26-like intrinsic proteins)是类根瘤菌26膜内在蛋白,属于水孔蛋白的一个亚类,在植物逆境胁迫应答过程中发挥重要作用。利用大豆基因组数据库,在全基因组水平共鉴定得到13个GmNIPs。染色体定位分析显示,这些GmNIPs基因分布在大豆11条染色体上。理化性质分析显示,GmNIPs蛋白氨基酸数目为261~296,蛋白分子量为27~32 ku,蛋白等电点为6~10。蛋白多序列比对分析发现,所有GmNIPs均含有水通道蛋白的典型结构,6个保守的跨膜螺旋(TM1-TM6)和2个保守的氨基酸元件NPA盒(Asp-Pro-Ala box)。进化树分析发现,大豆GmNIPs与拟南芥和水稻NIPs分类完全一致。基因结构分析显示,所有GmNIPs基因均由5个外显子和4个内含子组成。启动子分析表明,多数GmNIPs基因的上游启动子区含有逆境和激素应答元件。组织表达分析发现,5个GmNIPs的基因表达量相对较高。进一步,利用荧光定量PCR对GmNIP1;5的干旱胁迫表达特性进行了分析。     

西花蓟马气味结合蛋白的cDNA克隆、序列分析及时空表达

【目的】鉴定西花蓟马(Frankliniella occidentalis)气味结合蛋白（odorant binding protein,OBP）并对其序列特征及分布情况进行研究,为阐明该虫嗅觉识别的机制、利用干扰昆虫嗅觉识别来进行害虫防治提供依据。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆西花蓟马气味结合蛋白基因,用DNAMAN软件进行序列分析,用BLAST进行同源性比较,并用MEGA6.0的邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树,应用服务器Chou & Fasman预测蛋白的二级结构,通过实时荧光定量PCR检测该基因在西花蓟马不同发育期以及成虫不同组织中的分布情况。【结果】克隆了一个西花蓟马气味结合蛋白基因,命名为FoccOBP1（GenBank登录号：KM527948）;该基因cDNA序列全长660 bp,其中开放阅读框450 bp,编码149个氨基酸,3′端非编码区长172 bp,具有真核生物polyA加尾结构,5′末端非编码区长38 bp,预测成熟蛋白分子量为16.39 kD,等电点为7.46,N端有22个氨基酸组成的信号肽序列,具有气味结合蛋白典型的6个保守半胱氨酸位点特征,其排列方式为C1-X₂₆-C2-X₃-C3-X₄₀-C4-X₉-C5-X₈-C6,符合典型OBP 6个保守的半胱氨酸位点结构模型。氨基酸序列中有3个亲脂性区域,第74-83位的氨基酸残基形成的亲脂性口袋尤为明显,可能是脂溶性气味分子的结合位点;FoccOBP1氨基酸序列与3个半翅目和10个同翅目昆虫OBP聚在同一分支,其中与绿盲蝽（Apolygus lucorum）的AlucOBP8（GenBank登录号为AFJ54049.1）、苜蓿盲蝽（Adelphocoris lineolatus）的AlinOBP5（GenBank登录号为ACZ58031.1）、牧草盲蝽（Lygus lineolaris）的LlinOBP2（GenBank登录号为AHF71029.1）同源相似性最高,其次是棉蚜（Aphis gossypii）的AgosOBP7（GenBank登录号为AGE97637.1）、大豆蚜（Aphis glycines）的AglyOBP7（GenBank登录号为AHJ80893.1）、禾谷缢管蚜（Rhopalosiphum padi）的RpadOBP7（GenBank登录号为AHL30243.1）等昆虫的OBP,表明FoccOBP1与这些基因的亲缘关系也较近;经FoccOBP1蛋白的二级结构预测,FoccOBP1以α-螺旋为主,其次是β-折叠,转角含量较少;经不同发育阶段检测发现,FoccOBP1在西花蓟马若虫期和初羽化成虫期的表达量较高,且随成虫羽化后天数的延长表达量逐渐降低,在雌雄成虫间的表达量也有差异;在初羽化成虫的不同组织检测发现,FoccOBP1几乎在初羽化成虫触角中特异性表达;构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1。【结论】明确了FoccOBP1的核苷酸、氨基酸序列特征,分析了该蛋白的二级结构特征,根据FoccOBP1在西花蓟马中的时空表达情况,推测该基因可能在西花蓟马嗅觉识别、定位寄主植物、信息素合成或性行为方面扮演重要角色;成功构建了重组表达质粒pET-30a/FoccOBP1,为下一步该蛋白表达纯化及其功能的深入研究打下基础。     

青海省马铃薯黑胫病病原菌的鉴定

为明确引起青海省马铃薯黑胫病的病原菌,从青海省不同地区马铃薯黑胫病病样分离病原菌,研究病原菌的形态学特征、致病性、生理生化特性,并结合16S rRNA序列进行病原学鉴定。结果表明:引起马铃薯黑胫病的5个菌株均为黒腐果胶杆菌(Pectobacterium atrosepticum),来源不同的菌株接种马铃薯后致病力有差异;其中,3株强致病力菌株主要来自于乐都、湟中和大通,2株中等致病力菌株来自于民和和湟源。综上,黒腐果胶杆菌是引起青海省马铃薯黑胫病的病原菌。     

马铃薯StUOXs基因家族的生物信息学分析

马铃薯(Solanum tuberosum)是世界第三大粮食作物,其产量和品质受到生物与非生物胁迫的影响。泛醌氧化酶(ubiquinol oxidase,UOX)是一种由核基因编码的线粒体末端氧化酶,在植物生长发育及胁迫应答中发挥重要作用。为了解StUOXs在马铃薯抗病过程中发挥的应答反应,利用生物信息学方法在马铃薯基因组中鉴定出5个StUOXs基因,对其理化性质、染色体定位、三级结构、进化关系、保守结构域、启动子元件和表达谱尤其是受青枯菌(Ralstonia solanacearum)诱导的表达模式进行了分析。结果表明:马铃薯StUOXs基因编码的氨基酸数在279~366,相对分子质量为31~42 ku,亚细胞定位在线粒体中;系统进化分析发现,马铃薯StUOXs成员与番茄、辣椒的UOXs成员的亲缘关系最近,较之拟南芥、烟草亲缘关系稍远;FPKM数据分析发现,StUOXs主要受盐、激素和生物胁迫诱导而在叶片中表达,这与其启动子中的存在的激素应答等顺式作用元件相对应。青枯菌接种后的qRT-PCR实验表明,StUOX4参与马铃薯青枯病的早期应答反应。     

青花菜钙依赖蛋白激酶基因BoCDPK1的克隆与表达

钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)为Ca²⁺传感蛋白,在植物生长发育和逆境响应中起着重要作用。在克隆青花菜BoCDPK1基因的基础上,开展序列分析、系统发育分析和表达分析,为后续的基因功能鉴定和抗逆育种奠定基础。该研究以青花菜为材料,利用PCR法克隆1个CDPK 基因,利用生物信息学对序列进行分析,并采用qRT-PCR研究该基因在霜霉菌和核盘菌侵染下的表达模式。测序结果表明,BoCDPK1的基因组DNA全长为2 414 bp,具6个内含子,编码区全长为1 647 bp,编码548个氨基酸;BoCDPK1有1个S_TKc和4个EF手性结构域。多序列比对结果表明,BoCDPK1与芸薹属植物同源序列的相似性最高,仅个别氨基酸残基存在差异,它们在系统发育树上聚于一组。qRT-PCR结果表明,BoCDPK1的表达受霜霉菌和核盘菌的诱导,表达量均呈现先上升后下降的规律。在霜霉菌的诱导下,BoCDPK1的表达量在72 h达最大值,为对照的3.4倍;而在核盘菌侵染下,BoCDPK1的表达量在36 h达最大值。该研究明确了青花菜BoCDPK1基因的序列特点、系统发育关系和表达特征。     

百子莲2个ARF基因与2个Aux/IAA基因的全长克隆与序列分析

采用不同浓度外源生长素类调节物质毒莠定(PIC)对百子莲(Agapanthus praecox ssp. orientalis)进行继代培养,并对其胚性愈伤组织进行比较转录组学研究,获得了百子莲生长素信号转导途径中的2个ARF和2个Aux/IAA家族基因,推测其为体胚发生过程中生长素信号传导途径相关的重要调控因子。采用RACE技术获得ApARF1、ApARF2、ApAux/IAA2与ApAux/IAA3的cDNA全长,分别为2 343、2 888、1 034和821 bp,开放阅读框(ORF)长度分别为1 770、2 349、480和549 bp,分别编码589、782、159和182个氨基酸残基。生物学分析表明,ApARF1与ApARF2蛋白均具有ARF家族的典型结构,ApAux/IAA2蛋白结构域Ⅳ不完整,ApAux/IAA3结构域Ⅱ部分缺失,但仍具有Aux/IAA蛋白的典型功能。转基因实验表明,ApAux/IAA过表达植株表现出生长延缓及发育受阻的表型,ApARF过表达植株表现出生长促进、花期提前的表型,验证了百子莲ApARF和ApAux/IAA家族蛋白对植物生长发育的调控作用。     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF) 1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

芥蓝1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因BaDXS1的克隆及原核表达

本研究以芥蓝为实验材料,采用同源克隆的方法分离出BaDXS1基因,其开放阅读框为2 139 bp,编码712个氨基酸。理化性质分析表明,BaDXS1蛋白的分子量为77.21 ku,等电点pI为8.59,不含跨膜区域,位于植物细胞叶绿体内。氨基酸序列比对发现,芥蓝DXS1与甘蓝、拟南芥、烟草、番茄等植物的DXS蛋白序列的一致性达到79%以上;系统进化树分析显示,芥蓝DXS1与甘蓝DXS的亲缘关系最近。构建原核表达载体pEASY-Blunt E1-BaDXS1,并对其进行诱导表达,发现该蛋白在大肠埃希菌体内主要以包涵体的形式存在。     

不同植物查尔酮合成酶CHS基因的生物信息学分析

采用生物信息学方法对GenBank中已登录的10种不同植物中的查尔酮合成酶基因的核苷酸序列及所推测的氨基酸序列的理化性质、信号肽、跨膜结构、亲/疏水性、功能结构域以及其二级结构进行了详细的分析,构建了不同植物CHS的系统进化树。结果表明,10种植物中CHS基因的开放阅读框的全长在1.2 kb左右,大约编码399个氨基酸;不同植物中的CHS的氨基酸序列均包括1个N-糖基化位点(32NMSS),4个蛋白激酶c磷酸化位点(69TIR、158SVK、202TFR、359SAK)和1个查尔酮合成酶活性位点(161RLMMYQQGCFAGGTVLR),均不存在信号肽、无跨膜结构域,是一个疏水性蛋白。     

油菜素内酯参与调控植物生长发育与抗逆性的机制及其育种应用研究

油菜素内酯（brassinosteroids,BRs）是一类重要的植物促生激素,参与调控植物生长发育。最近的研究表明,BRs能增加作物产量和增强作物抗逆性。在BRs信号转导过程中,蛋白激酶的磷酸化功能与转录因子的磷酸化和脱磷酸化过程是BRs信号重要的生化调控机制,其中起始BRs信号由胞外向胞内转导的蛋白激酶BRI1和 BAK1,以及BRs信号下游调控不同性状基因表达的转录因子BZR1和BZR2/BES1,是BRs信号途径中关键的功能基因。基于重要蛋白激酶和转录因子的蛋白结构和功能分析,通过不同氨基酸功能位点的基因定点突变和修饰技术,能实现BRs信号途径的功能研究与植物性状改良,从而提高植物对环境的适应性。综述了BRs信号途径与植物生长发育和环境胁迫的研究,期望为植物分子育种提供很好的借鉴。     

少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-483基因的克隆及生物学活性

为弄清少孢节丛孢菌几丁质酶的生物学功能,对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-483基因进行克隆及分子特征分析,并在大肠埃希菌中进行诱导表达;采用DNS还原糖法检测经镍柱纯化的重组几丁质酶活性,将其作用于秀丽隐杆线虫幼虫,分析其生物活性。结果显示,AO-483基因编码309个氨基酸,与少孢节丛孢菌标准株(ATCC 24927)的几丁质酶AO-483基因序列的同源性为96.88%,氨基酸序列同源性为97.73%;AO-483含有1个Glyco-hydro-18结构域,位于20~297位氨基酸,属于糖苷水解酶18家族,还含有特征序列GMLGG和LDGLDLDVE;三级结构为典型的三磷酸异构酶桶形结构。SDS-PAGE分析结果表明,重组蛋白AO-483分子质量约为52 ku,与预测大小一致;Western blot分析证实,该重组蛋白能与小鼠抗少孢节丛孢菌多克隆血清抗体发生特异性反应。经DNS还原糖法检测,该重组几丁质酶活性为223.31 U·mL^-1;重组几丁质酶对秀丽隐杆线虫Ⅰ期和Ⅳ期幼虫有较强的降解活性。