不同感染剂量柔嫩艾美耳球虫对京海黄鸡血液指标影响及动态变化规律

为探究接种不同剂量柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊对京海黄鸡感染后不同时间点血液生化、抗氧化等指标的影响及动态变化规律,将180只30日龄京海黄鸡随机分为3组,分别感染0 (对照组)、0.75万个·只^-1(感染Ⅰ组)和1.5万个·只^-1(感染Ⅱ组)E.tenella孢子化卵囊,分别测定感染后第0、3、7天血液中23个生化、抗氧化和免疫指标,分析不同感染剂量和时间点对测定指标的影响。结果表明：感染后第3天,只有感染Ⅱ组碱性磷酸酶(ALP)显著高于感染Ⅰ组和对照组,感染Ⅱ组葡萄糖(GLU)显著高于对照组;感染后第7天,不同剂量组ALP、总蛋白质(TP)、球蛋白(GLB)、肌酐(CRE)、三酰甘油(TG)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素2 (IL-2)、过氧化氢酶(CAT)、白介素6 (IL-6)和白介素8 (IL-8)指标之间有显著或极显著差异。综合而言,不同剂量E.tenella孢子化卵囊感染后,对京海黄鸡不同时间点血液指标的影响不同,这为京海黄鸡球虫病感染后机体在防御过程中所起的作用提供了参考依据...     

IL-6基因启动子区单核苷酸多态对京海黄鸡柔嫩艾美尔球虫抗性指标的影响

为探究白介素6(IL-6)基因5′启动子区单核苷酸突变对鸡柔嫩艾美尔球虫抗性指标的影响,以京海黄鸡为试验材料,对IL-6基因5′调控区单核苷酸多态性(SNPs)进行检测,根据感染组与对照组血浆抗性指标酶联免疫吸附试验检测结果,分析SNPs突变形成的基因型与抗性指标的关联。结果表明:感染组与对照组间过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量差异极显著,超氧化物歧化酶(SOD)活性及IL-2、IL-16、IL-17、γ干扰素(IFN-γ)水平和体增重差异显著;通过京海黄鸡IL-6基因启动子区基因序列与GenBank上的SNPs数据库比对,发现3个新的SNPs(A-663G、C-447G和G-357A),其中A-663G位点只有1种基因型GG,C-447G和G-357A位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态且多态性丰富;C-447G突变位点各基因型间比较发现,血浆CAT、SOD、GSH-Px活性及IL-2、IL-16、IL-17水平和体增重差异极显著,MDA含量差异显著;G-357A突变位点各基因型间比较发现,血浆CAT、SOD活性及IL-16水平和体增重差异极显著,GSH-Px活性和IL-17水平差异显著。就主要抗性指标而言,C-447G和G-357A2个突变位点的CC和AA纯合型个体优于其他基因型个体,CC和AA基因型分别为2个突变位点鸡球虫抗性有利基因型,这一结果为京海黄鸡鸡球虫抗性分子标记辅助育种提供了参考。     

柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠菌群的影响

将60只健康罗曼粉鸡随机分为正常组和模型组,每组30只,模型组灌服1×104个孢子化卵囊进行人工复制鸡球虫病模型,正常组灌服等体积生理盐水,感染5 d,剖杀试验鸡,无菌采集鸡盲肠内容物,并通过Illumina PE250型高通量测序仪对肉鸡盲肠内菌群进行16SrDNA基因V3～V4可变区检测,对肠道菌群可操作分类单元(OTUs)数、α多样性、β多样性及差异菌门与菌属进行综合性分析与评价,探究柔嫩艾美耳球虫感染对鸡盲肠菌群结构和多样性的影响。结果表明：与正常组相比,感染柔嫩艾美耳球虫后鸡肠道菌群的OTUs数、Chao1指数极显著降低,Shannon指数显著降低,Simpson指数显著升高;门水平上,模型组变形菌门的相对丰度极显著升高,而厚壁菌门的相对丰度显著降低,拟杆菌门和柔膜菌门的相对丰度显著降低;属水平上,正常组的优势菌属为拟杆菌属、瘤胃菌属–UCG014、副拟杆菌属,而模型组瘤胃球菌属–uncultured、球藻菌属、埃希菌–志贺菌属相对丰度极显著升高。可见,艾美耳球虫破坏了盲肠菌群的完整性,促进潜在致病菌的建立和生长,尤其使埃希菌–志贺菌属大量繁殖,快速生长。     

鸡IL-2全基因和去信号肽基因的酵母表达研究

根据已发表的鸡白介素-2（ChIL-2）cDNA编码基因序列设计三条引物,利用RT-PCR技术从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出429bp的ChIL-2全长基因cDNA和363bp去除信号肽的ChIL-2基因cDNA。分别克隆到酵母表达载体pPICZαA中,并分别转化巴斯德毕赤酵母X-33中,经甲醇诱导,SDS-PAGE检测,在28kD和24kD处有两条清晰的蛋白带,相同条件下pPICZαA-△SIL-2表达量较高。RNAstructure软件分析表明,pPICZαA-IL-2的序列形成了较为稳定的二级结构,不利于翻译,证明信号肽序列的存在对ChIL-2基因在酵母细胞中的表达有一定的影响。     

鸡IL-2基因克隆及其重组质粒的构建与表达

利用一对自行设计的引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中扩增出鸡白细胞介素2(IL-2)基因片段,其长度为439 bp,经酶切鉴定,初步确定为鸡IL-2基因.再将该IL-2基因片段定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经DNA序列鉴定,表明构建的重组质粒含有IL-2基因,该基因的cDNA序列与Sundick报道的结果基本一致.然后,将IL-2基因片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,并导入菌株BL21, 经诱导培养、蛋白提取和SDS-PAGE,获得分子量约为42 000的蛋白条带,表明所克隆的鸡IL-2基因在原核细胞中得到表达.     

鸡IL-2全基因和去信号肽基因的原核表达

根据已发表的鸡白介素-2(ChIL-2)cDNA编码基因序列设计3条引物,利用RT-PCR技术从经诱导的卢氏鸡胚脾淋巴细胞中扩增出429 bp的ChIL-2全长基因cDNA和363 bp去除信号肽的ChIL-2基因cDNA.将ChIL-2全长和去信号肽的基因cDNA分别克隆到原核表达载体pET28a(+),构建原核重组表达质粒pET28a-IL-2和pET28a-△SIL-2,并分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE检测,在22 ku和18 ku处有2条清晰的蛋白带,相同条件下pET28a-△SIL-2表达量较高.RNAstructure软件分析表明,pET28a-IL-2的mRNA5′端序列形成了复杂且较为稳定的二级结构,不利于翻译的起始,证明信号肽序列的存在对ChIL-2基因在原核细胞中的表达有一定的影响.     

大豆异黄酮对去卵巢大鼠脾脏IL-2 mRNA表达的影响

目的探讨大豆异黄酮对去卵巢大鼠脾脏IL-2mRNA表达及分布的影响。方法在成功造模60只去卵巢青年大鼠的基础上,分别皮下注射补充大豆异黄酮高、中、低剂量(1.5、1.0、0.5mg·kg-1BW)和溶媒剂,补充至第2、4和6周时每组各宰杀5只,运用原位组织杂交方法,对大鼠脾脏IL-2mRNA的表达和分布变化进行观察。结果IL-2mRNA主要分布于被膜下方的红髓区,在白髓区的脾小结外周、边缘区、动脉周围淋巴鞘外层等处也有分布。大鼠去卵巢后脾脏中IL-2mRNA的表达强度和阳性细胞数目均显著下降,并且随着去除卵巢时间的延长更趋明显;而补充大豆异黄酮高、中、低剂量后,各组IL-2mRNA的表达强度和阳性细胞数目随着时间的延长均呈上升趋势,表现时间依赖性。在同一时间段内,随着补充大豆异黄酮剂量的升高,IL-2mRNA的表达强度和阳性细胞数目也均呈上升趋势,表现为剂量依赖性。结论大豆异黄酮对脾脏内IL-2mRNA的表达具有上调作用,并存在剂量和时间依赖性。     

鸡IL-2基因cDNA输卵管组织特异性表达载体的构建与表达

将克隆并测序的鸡卵清蛋白基因5′端调控序列和鸡IL-2基因cDNA,以串联方式置于真核表达载体pcDNA3的CM V启动子下游,构建了鸡输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2。将真核表达载体pcDNA3-IL 2和构建的输卵管定位表达载体pcDNA3-OVP-IL 2分别转染鸡输卵管上皮细胞,激素诱导72 h后,用淋巴细胞转化试验检测细胞培养液中IL-2的表达水平及生物学活性。结果显示,转染细胞均可表达IL-2,且所表达的IL-2有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性;转染pcDNA3-OVP-IL 2的输卵管上皮细胞表达产物在1∶256稀释水平下仍具有促进T淋巴细胞转化和淋巴母细胞成熟的活性。转染pcDNA3-IL 2载体的输卵管上皮细胞虽有IL-2表达,但水平较低。     

鸡IL-6、IL-17和IFN-γ实时荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]建立针对鸡白介素6（IL-6）、白介素17（IL-17）和γ干扰素（IFN-γ）的实时荧光定量PCR检测方法,为细胞因子的定量检测及病毒致病机制的研究奠定基础.[方法]根据GenBank已发表的鸡IL-6、IL-17、IFN-γ和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因保守序列,设计并合成4对相应的特异性引物,以鸡胚成纤维细胞的cDNA为模板构建重组质粒,对退火温度、引物浓度等SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应条件进行优化,建立各基因的标准曲线,并进行特异性、敏感性、重复性试验.[结果]GAPDH、IL-6、IL-17和IFN-γ的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增效率分别是98.2％、99.2％、102.0％和100.8％,相应的标准误差为0.00666、0.00813、0.00365和0.00458.特异性试验结果显示各基因的溶解曲线均呈单一溶解峰,敏感性试验结果表明各基因的检测下限均为100拷贝,重复性试验结果表明组内变异系数均小于2.00％.[结论]建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、特异性强等特点,为快速检测和定量鸡源IL-6、IL-17和IFN-γ的表达水平提供了技术平台.     

9例囊虫病患者治疗前后TNFα、IL-6、IL-8和sIL-2R血清水平的观察

目的 :检测囊虫病患者血清肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素 - 6(IL - 6)、白细胞介素 - 8(IL - 8)和血清可溶性白细胞介素 2受体 (s IL - 2 R)治疗前后的变化。方法 :用酶联免疫法测定囊虫病 9例治疗前后的血清 TNFα、IL - 6、IL - 8和 s IL - 2 R的含量 ,并进行统计学分析。结果 :经 5个疗程治疗 ,9例治疗后的血清 TNFα(0 .2 3± 0 .35) μg· L- 1、IL- 6(0 .0 7± 0 .0 9) μg· L- 1、IL- 8(0 .1 0± 0 .0 1 ) μg· L- 1和 s IL- 2R(1 52 .62± 56.34) U/ m L的水平与治疗前比呈显著下降 (P<0 .0 5)。结论 :囊虫病患者血清 TNFα、IL- 6、IL - 8和 s IL- 2 R水平的变化与囊虫病患者体内囊虫的多少存在有一定关系     

猪白细胞介素-2基因的克隆与表达

根据GenBank上发表的猪白细胞介素-2（Interleukin．2,IL-2）基因序列,设计1对引物。采用RT-PCR技术,以ConA刺激的猪外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出484bp的特异性片段,将其克隆入pGEM-Teasy载体。序列测定表明;扩增片段为猪IL-2基因,该基因与GenBank上发表的猪IL-2基因的核苷酸序列同源性达99．8％。将其定向克隆至原核表达载体pET32a,构建了表达重组猪IL-2的基因工程菌株,经IPTG诱导表达和层析纯化,获得了纯化的重组猪IL-2蛋白。     

葡萄醛脱氢酶（ALDH2）基因进化、表达及启动子功能的生物信息学分析

【目的】研究葡萄醛脱氢酶ALDH2基因家族中ALDH2B4、ALDH2B8和ALDH2B9 3个成员的进化关系,对其在病原菌侵染、非生物胁迫及激素处理下的表达进行分析,为揭示ALDH2基因在植物逆境胁迫下的作用机理提供理论依据。【方法】运用生物信息学方法,鉴定葡萄ALDH蛋白序列;通过葡萄和拟南芥ALDH2基因的系统发育树、基因结构及同线性分析探讨其进化关系;利用葡萄Affymetrix芯片数据,分析葡萄ALDH2（ALDH2B4、ALDH2B8和ALDH2B9）基因在病原菌侵染、非生物胁迫和激素处理下的表达谱;采用在线软件PlantCARE分析3个葡萄ALDH2基因的启动子元件组成差异。【结果】在葡萄基因组中共鉴定出23个ALDH基因,并发现了ALDH2基因的可变剪接现象。基因结构分析结果表明,3个葡萄ALDH2基因的内含子/外显子组成高度相似,且均是通过大规模基因倍增产生的;仅有ALDH2B4具有剪接变体。葡萄与拟南芥的ALDH2基因位于同线区域,表明葡萄与拟南芥的ALDH2基因具有共同的祖先,ALDH2基因先于植物分化而存在。表达分析结果表明,VvALDH2B8是一个多病原菌和非生物胁迫响应基因,VvALDH2B4是一个渗透胁迫响应基因。葡萄的3个ALDH2基因的启动子区域均含有逆境胁迫响应元件,在VvALDH2B8上还发现了病原菌侵染响应元件Box-W1。【结论】葡萄的3个ALDH2基因虽然具有共同的祖先,但其在逆境条件下的表达差异很大,VvALDH2B8和VvALDH2B4可能在植物抵抗逆境胁迫中起重要作用。     

PCV-2陕西株ORF2基因的克隆、分析及原核表达

【目的】克隆猪圆环病毒2型陕西分离株(PCV-2SX株)ORF2基因,并进行序列分析及原核表达。【方法】根据GenBank公布的PCV-2ORF2基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,应用PCR方法扩增PCV-2SX株ORF2全长基因,将其克隆入pGEM-T载体中,进行测序及序列分析。然后,将ORF2基因亚克隆入原核表达载体pET-32a中,在大肠杆菌BL21中进行IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。【结果】扩增到了702bp的PCV-2ORF2全长基因。序列分析结果表明,PCV-2SX株ORF2基因与广西分离株(EF675237,ChinaGX)和巴西分离株(DQ861802,am21)的核苷酸序列同源性均达98.0%,氨基酸序列同源性均达98.3%,与其他毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在89.9%～97.9%和88.5%～98.0%。SDS-PAGE可检测到分子质量约为48ku的融合蛋白,主要以可溶性蛋白形式存在。Western-blotting分析表明,重组蛋白可被PCV-2阳性血清所识别。【结论】成功克隆了PCV-2SX株ORF2基因,并进行了原核表达。     

山羊血管紧张素转换酶2基因的克隆表达与生物信息学分析

[目的]血管紧张素转换酶2(ACE2)是RAS系统的关键调控酶,在动物上的研究较少,本试验研究了山羊ACE2的相关理化性质和功能。[方法]利用同源克隆及RT-PCR技术,根据牛的ACE2基因mRNA序列设计引物,从山羊肾脏组织中扩增出ACE2基因编码区的特异性片段,TA克隆到p MD19-T载体并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,对生长出的单菌落进行验证后测序分析。根据测序分析结果设计引物,经PCR扩增和酶切连接,构建原核表达载体p ET-28a-ACE2,经过验证后转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导表达ACE2蛋白。[结果]山羊ACE2基因c DNA编码区共包括2 415个核苷酸,编码804个氨基酸残基。同源性比对发现,山羊ACE2基因核苷酸序列同源性与绵羊ACE2最高,为99%,与斑马鱼最低,仅为60%。遗传进化分析也表明该ACE2基因与绵羊的遗传距离最近,与斑马鱼处在两个不同的分支上。蛋白结构及理化性质分析预测该山羊ACE2蛋白属于稳定型蛋白,蛋白信号肽序列位于第1氨基酸(aa)~18氨基酸(aa)之间,蛋白跨膜螺旋预测为Ⅰ型跨膜蛋白。成功构建山羊ACE2蛋白胞外部分(19~738 aa)表达载体,表达出的蛋白相对分子质量约为90×103,主要以包涵体的形式在BL21(DE3)中表达。[结论]本试验首次成功克隆了山羊ACE2基因编码区(基因序列号:KF921008.1),并对其蛋白结构及理化性质进行了初步预测,同时在大肠杆菌中高效表达了其胞外区蛋白。     

小麦胁迫相关基因TaLEA2的克隆、生物信息学及表达特性分析

【目的】克隆小麦Triticum aestivum晚期胚胎发育丰富蛋白基因并对其进行基因结构、蛋白特性及表达模式分析,为其耐盐性研究奠定理论基础.【方法】搜索小麦EST数据库,通过同源克隆分离并获得小麦晚期胚胎发育丰富蛋白基因,用生物信息学软件分析该基因结构及蛋白特性,荧光定量试验分析该基因的表达模式.【结果和结论】获得1条1 100 bp的核苷酸序列,该序列包含了1个981 bp的开放阅读框,编码1个由326个氨基酸残基组成的蛋白,该蛋白含有2个LEA2结构域,属于第2组LEA蛋白,该蛋白命名为TaLEA2.生物信息学分析显示TaLEA2蛋白具有LEA2家族的典型特征,富含赖氨酸(Lys),不含半光氨酸(Cys),无明显的高级结构,平均亲水系数(GRAVY)为-0.405,稳定系数为25.28,这种氨基酸组成及结构均有利于蛋白的热稳定性及亲水性.实时荧光定量PCR分析表明,TaLEA2基因为组成型表达,同时该基因存在组织表达差异,且表达受不同发育时期影响;该基因调控表达受高盐、低温、病原菌及干旱等胁迫的影响,尤其在干旱胁迫中上调表达明显,但该基因不受外源ABA刺激的影响.推测TaLEA2基因参与了小麦正常条件下的生长发育,同时也广泛地参与了小麦抵御逆境胁迫的响应,尤其在小麦的抗旱胁迫过程中发挥重要作用.     

羽衣甘蓝β-胡萝卜素羟化酶基因的克隆及表达分析

以羽衣甘蓝(Brassica oleracea L. var. acephala)为试验材料,采用同源克隆和RT-PCR技术,克隆得到羽衣甘蓝β-胡萝卜素羟化酶的cDNA全长,命名为BoBCH(GenBank登录号为MH016242)。序列分析表明,该cDNA序列长906 bp,编码301个氨基酸,分子量33.8 ku,理论等电点为9.67。保守结构域分析表明,BoBCH属于FA_hydroxylase蛋白超家族。系统发育分析结果表明,羽衣甘蓝与结球甘蓝处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和Wolf-Psort进行跨膜区分析及亚细胞定位,结果表明BoBCH蛋白有4个跨膜区域,可能定位于叶绿体中发挥作用。qRT-PCR检测结果表明,BoBCH在紫叶羽衣甘蓝DH系D07的根、茎、叶中均有表达,在叶片中表达量最高,茎次之,根中表达量最低;不同发育时期的检测结果表明,BoBCH在观赏期叶片中表达最高,在幼苗期和莲座期表达水平较低。     

陆地棉小GTP结合蛋白基因GhROP1和GhROP8的克隆及表达分析

为探究棉花ROP基因在非生物逆境胁迫及外源激素处理下的表达模式,利用同源克隆的方法获得2个陆地棉(Gossypium hirsutum L.)ROP基因GhROP1和GhROP8,通过生物信息学方法分析其理化性质、结构及进化关系,并利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术对其组织表达的特异性及不同逆境胁迫和外源激素处理下的表达模式进行分析。结果表明：1)GhROP1和GhROP8基因的开放阅读框(ORF)分别为591和630 bp,各编码197和210个氨基酸,均含有1个保守的RHO结构域。2)多序列比对显示2个GhROPs蛋白均符合ROP蛋白结构特征且与其他物种ROP蛋白具有高度的相似性,聚类分析表明,GhROP1蛋白属于Ⅰ类ROP蛋白,GhROP8蛋白属于Ⅱ类。3)2个GhROPs基因在不同组织中均有表达且存在组织特异性：GhROP1基因在真叶中表达量最高,在根部和茎部表达量较低;GhROP8基因在根部表达量最高,其他组织中均为低表达量。2个GhROPs基因对于干旱、高盐、低温及高温等非生物逆境胁迫和外源脱落酸(ABA)、生长素(IAA)的处理均有响应：2个GhROPs基因表达均受...