山羊PGCs用于分离与克隆类ES细胞

选择健康成年本地白山羊，自然发情，配种后44d取胎儿，以传统的原始生殖细胞（PGCs)分离与克隆的方法和PGCs与其胎儿生殖嵴周围组织细胞共同培养的方法获得类胚胎干细胞（类ES细胞），并对山羊类ES细胞在不同饲养层上进行培养。结果表明，采用传统方法与共培养的方法并添加细胞因子均能分离获得类ES细胞。分离获得的类ES细胞在同源（山羊）胎儿细胞饲养层上生长效果较好，可传4代或5代，而在小鼠原代成纤维细胞饲养层上类ES细胞仅传3代。另外，共培养不添加细胞因子组仅获1个ES细胞集落，传代后丢失。     

山羊原始生殖细胞分离与培养的影响因素

以本地白山羊胎儿的生殖嵴为试验材料,从原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)中分离培养得到胚胎生殖细胞(embryonic germ cells,EGCs),对其进行体外培养和鉴定等。胎儿生殖嵴在室温(25℃)下消化15 min,使用0.125%胰酶+0.02%EDTA比0.25%胰酶+0.04%EDTA效果好,差异显著(P<0.05);挑取集落法和胰酶消化法均能将PGCs传至第2代,两种方法差异不显著(P>0.05);以GEF为饲养层,在培养液中添加不同浓度和种类的细胞因子:①LIF:10 ng/mL;②LIF:20 ng/mL;③LIF(10 ng/mL)+SCF(10 ng/mL);④LIF(20 ng/mL)+SCF(20 ng/mL)。4种情况对于原代集落形成率的影响差异不显著(P>0.05),均能得到传至第2代的EGCs;研究不同胎龄胎儿分离培养PGCs的效果,结果发现4例冠臀长小于15 mm的胎儿仅观察到一个原代集落,6例大于30 mm的胎儿没有观察到原代集落。     

从原始生殖细胞中分离克隆胚胎干细胞的研究

作者探讨了从原始生殖细胞（PGCs）中分离克隆胚胎干细胞的优势、用于分离克隆胚胎干细胞的PGCs获取方法及其向胚胎干细胞转化的能力。     

鸡胚胎生殖嵴中原始生殖细胞的分离培养研究

在鸡胚孵化的 19期以Ficoll密度梯度离心和酶解离两种方法分离生殖嵴中的原始生殖细胞 (PGCs)。探索在生殖嵴中PGCs分离、培养的适宜方法 ,以获得较多数量 ,较高活力的PGCs作介导生产转基因鸡。在倒置显微镜下进行形态观察 ,台盼兰染色比较存活时间 ,PAS特异染色法识别鉴定PGCs。结果表明两种分离方法均能分离到一定数量的PGCs细胞。与Ficoll密度梯度离心法相比 ,酶解离法分离到的PGCs的相对数量较多 ,存活时间较长 ,是一种较可行的分离方法。在鸡胚孵化的第 19期 ,PGCs大量聚集在肢体后端的生殖嵴原基处 ,此时的生殖嵴大小已达一定程度 ,分离其中的PGCs操作简便 ,有较强的可操作性 ;提取出的PGCs为转基因鸡的生产提供了介导材料     

影响山羊类胚胎干细胞分离克隆的因素分析

将本地槐山羊胎儿的原始生殖细胞(PGCs)与其生殖嵴周围组织细胞共同分离,经传代培养后获得了具有干细胞特征的山羊类ES细胞。结果表明高糖DMEM培养基和低糖DMEM培养基相比较,低糖DMEM更适宜于山羊类ES细胞的分离与克隆;类ES细胞在山羊胎儿成纤维细胞饲养层上生长效果较好,可传4代或5代,而在小鼠成纤维细胞饲养层上,类ES细胞仅传3代;联合添加白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)能显著提高山羊类ES细胞分离与克隆的效率;胎龄为30~45d的胎儿原代培养时可获得大量的细胞集落,克隆培养可传至5代,适合作山羊类ES细胞的分离培养。     

猪原始生殖嵴（PGCs）细胞分离、建系培养

从五指山近交系 (ＷＺＳＰ)培育群中 ,先后选用自然或同期发情 1 1头 5 8月龄青年母猪 ,分别于授精后 2 5～ 2 9ｄ采集胎儿 75个 ,进行原始生殖嵴 (ＰＧＣｓ)细胞分离、培养等建系技术研究。培养液为ＤＭＥＭ Ｆ1 2 ( 1∶1 ) ,并含 1 5 %胎牛血清、0 1ｍｍｏｌ/Ｌ硫基乙醇、40ｎｇ/ｍｌｈＳＣＦ、2 0ｎｇ/ｍｌｈＬＩＦ、2 0ｍｍｏｌ/Ｌ谷胱甘肽 ,另添加或不添加 2 0ｎｇ/ｍｌｂＦＧＦ作为对比试验。用ＳＴＯ细胞作饲养层 ,在 37 5℃、5 0 %ＣＯ2和湿润的气相中进行培养。分别冷冻保存胚胎生殖嵴细胞 (ＥＧ)细胞系 1 1个 ,其中 2个ＥＧ…     

哺乳动物原始生殖细胞与EG细胞研究进展

本文综述了哺乳动物原始生殖细胞的来源、增殖、迁移及生物学特点及近年来国内外用原始生殖细胞分离EG细胞的研究进展，探讨了EG细胞作为另一种多能性干细胞的优越性。     

从原始生殖细胞分离克隆绵羊胚胎干细胞

为了研究绵羊胚胎干细胞在体外培养过程中的生长行为,试验采用30～45日龄的绵羊胎儿生殖嵴及其周围组织共培养的方式分离克隆胚胎干细胞。结果表明:在不添加任何细胞生长因子的情况下,也能分离克隆到具ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞系,即具有连续传代能力、细胞集落有典型鸟巢状结构、AKP染色阳性等。说明该细胞具有多能性,类似ES细胞。     

从原始生殖细胞分离和克隆兔的胚胎生殖细胞

研究采用 1 4～ 1 8d兔胎儿的生殖嵴及周围组织与其同源成纤维细胞共培养 ,低糖DMEM +1 0 %NBS +1 0 %FCS +1 0ng/mLLIF +1 0ng/mLSCF+0 1mol/Lβ 巯基乙醇 +1 0 0U/mL青霉素 +80U/mL链霉素作培养基 ,分离出兔原始生殖细胞 (PGC) ,克隆并多次传代。从原始生殖细胞 (PGC)中获得胚胎生殖细胞 (EG)细胞集落 ,1 4d胎儿原代观察到类EG细胞集落 ,传至 4代后丢失。 1 6d胎儿的类EG只传 2代 ,1 8d胎儿没有得到EG细胞集落。EG细胞具有干细胞的诸多特征 ,呈典型的团块状聚集生长 ,碱性磷酸酶 (AKP)染色呈阳性 ,在衰老饲养层的培养基中生长形成类胚体、上皮细胞、神经细胞和成纤维细胞等     

山羊类ES细胞的分离与克隆

采集山羊交配后6～8d的桑椹胚、囊胚和孵化囊胚,将桑椹胚和囊胚分别放在小鼠原代胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层和同源原代胎儿成纤维细胞(PGEF)饲养层上比较其脱带时间及脱带率。脱带后,将各自一半胚胎切割,把含ICM的半胚分别放在相应饲养层上进行培养,另一半整胚在各自饲养层上继续培养,而孵化囊胚直接于PGEF饲养层上培养。当ICM增殖一定程度时进行传代,以比较其类ES细胞分离与克隆的效果。结果表明,在2种不同饲养层上,囊胚的脱带时间均短于桑椹胚,囊胚的脱带率均高于桑椹胚,而饲养层的种类对胚胎的脱带时间以及脱带率影响不大。脱带切割囊胚不论在PMEF还是在PGEF饲养层上,其贴壁时间均短于脱带整胚及孵化囊胚,而贴壁率高于脱带整胚,与孵化囊胚相似。脱带整胚及脱带切割胚在PMEF饲养层上所获类ES细胞只能维持3代,而在PGEF饲养层上,脱带切割半胚和孵化囊胚所获类ES细胞传至5代。由此认为,对脱带后的胚胎进行切割处理,有利于ICM的贴壁和增殖;应用同源原代胎儿成纤维细胞饲养层培养系统,有利于类ES细胞的分离与克隆。     

鸡胚血液中PGCs的分离及原代培养

在鸡胚孵化48,50,54,56,60h的不同时期，分离血液中原始生殖细胞（PGCs)，分离前的浓度分别为0.011%,0.007%,0.006%,0.006%,0.004%,0.001%,分离后的浓度分别为0.245,1.21%,1.02%,0.64%,0.27%,孵化48－54h，血液中PGCs浓度差异不显著，但孵化48h的鸡胚液较少，PGCs绝对量较低。孵化52－54h的鸡胚血液量较大，获取PGCs的绝对值较高，故分离PGCs的时间以孵化52－54h为宜，鸡胚血液中PGCs在未中任何外源生长因子而含10％FCS的TCM－199培养基中体外培养，能够存活3－4d。     

内蒙古绒山羊原始生殖细胞(PGCs)的培养与鉴定

本试验从内蒙古白绒山羊胎儿的生殖嵴中分离出原始生殖细胞体外培养并进行了鉴定。为建立内蒙古绒山羊原始生殖细胞(pri mordial germcells,PGCs)的培养体系,试验对比了A、B、C3组不同的培养条件对内蒙古绒山羊原始生殖细胞传代数的影响。RT-PCR鉴定结果表明,β-actin、hTERT、GAPDH、Nanog、Oct3/4为阳性、AKP染色为阳性;免疫荧光检测胚胎干细胞特异标志物Oct3/4、SSEA-3、SSEA-4呈阳性。未添加任何因子的A培养体系仅能传1代,添加LIF及Insulin的B培养体系可以传至4代,添加LIF、Insulin及优质胎牛血清的C组培养体系可以传至9代。     

无血清培养关中奶山羊胚胎生殖细胞的研究

山羊胚胎生殖细胞是一种来源于胎儿原始性腺的多能干细胞,建立该细胞体外稳定分离培养体系对研究山羊繁殖育种具有重要价值。本试验通过酶消化法和组织培养法分离培养关中奶山羊胚胎生殖细胞,检测无血清培养基对细胞体外增殖的影响。结果发现,该培养基可以分离得到山羊胚胎生殖细胞,细胞集落形态典型,表达AKP、Oct4、TERT及SSEA-1。经体外分化试验表明,细胞可以分化为类胚体、成纤维样细胞、成脂细胞和卵母细胞样形态。无血清培养基可以用于山羊胚胎生殖细胞的分离与培养,本试验对进一步建立山羊胚胎生殖细胞长期培养体系提供了新的参考。     

雄性关中奶山羊胎儿生殖细胞增殖分化的研究

旨在阐明山羊胚性腺的发生规律,这对于山羊的繁殖育种、丰富胚胎学有关研究内容都具有重要意义.该研究对22枚从39日胎龄胎儿至初生奶山羊性腺进行石蜡组织切片,用组织学和免疫组化、免疫荧光方法对山羊胎儿性腺发育的组织学特点,山羊胎儿性腺发育过程中VASA及细胞增殖核抗原(PCNA)的表达规律进行了系统研究.结果表明:奶山羊性腺在39～47日胎龄时已出现精索和白膜,已发生性别分化,并可分辨出生殖细胞、支持细胞及间质细胞,细胞增殖率较高.在大约50日胎龄前生殖细胞可称作性原细胞,细胞为球形、核质比高.在51～59日胎龄,生殖细胞发生剧烈变化:体积增大、核质比降低.此后逐渐由性原细胞发育为前精原细胞,并且在此期间表达VASA的生殖细胞增多.50～90日胎龄,生殖细胞增殖率最高,生殖细胞所占比例也达到峰值.在90日胎龄后生殖细胞增殖率下降,比例下降,间质细胞大量退化.结果表明,山羊胎儿的生殖细胞在50日胎龄后由性原细胞发育为前精原细胞,生殖细胞在50～90日胎龄的增殖率最高,VASA可作为雄性山羊胎儿前精原细胞的标记.     

牛胚胎生殖细胞的分离与培养

以牛胎儿为材料,从原始生殖细胞（PGC）分离培养出胚胎生殖细胞（EG）,并进行传代和鉴定,对影响胚胎生殖细胞分离与培养的因素进行了探讨,研究发现以共培养方式培养牛原始生殖细胞时,原代培养都可以出现大量形态较好的EG细胞集落,说明同源的体细胞可以很好地支持PGC的生长和增殖,组织块培养细胞克隆数目较少,PGC很难增殖,不能形成典型的集落,传代也不理想,只传了一代.同时比较了不同传代方法对牛胚胎生殖细胞细胞传代的影响,发现消化＋机械分离法和消化＋吹打法都可以用于EG细胞的传代.消化＋吹打法操作简单,省时省力,也能够很好的保持细胞的增殖活力.原代培养的牛原代胚胎生殖细胞进行了细胞表面标志抗原SSEA-1,3,4鉴定,呈弱阳性.细胞体外培养可以分化为成纤维样细胞、上皮样细胞和类胚体.     

绒山羊原始生殖细胞用于胚胎干细胞培养的研究

该研究将20～45d的绒山羊胚胎生殖嵴及其邻近组织用机械剪和胰蛋白酶+EDTA消化处理,未加任何细胞生长因子,仅添加DMEM+10%犊牛血清,在38℃、5%CO2,饱和湿度条件下,将原始生殖细胞(PGCS)与其胎儿成纤维细胞共培养,在原代培养至1周左右时观察到了鸟巢状类胚胎干细胞(ES细胞)和集落团,贴壁生长于成纤维细胞层上面。经电镜观察,类胚胎干细胞体积小、核大,有多个核仁,细胞形态不规则,无明显界限等特点。     

不同时期鸡胚原始生殖细胞的分离及存活时间的研究

采用Ficoll密度梯度离心，提取第14期(孵化53h)血液、第19期(孵化72h)和第28期(孵化132h)性腺中的PGCs．以比较这3个时期的PGCs在相同的体外培养条件下存活时间的差别。培养基为TCM-199，添加10％的小牛血清，不添加其他的细胞因子，培养后采用台盼蓝染色，以比较其在这种培养液中存活时间的差别。结果发现，第14期提取的PGCs存活时间最短，第19期的最长，第28期的介于两者之间。