BADH/pepB双价基因无选择标记表达载体转化苜蓿的初步研究

选用公农1号紫花苜蓿,以5～7d莆龄的无菌子叶为外植体,通过农杆菌介导法将含有甜菜碱醛脱氢酶(BADH)和酸性蛋白酶(pepB)双价基因的无选择标记表达载体导入苜蓿子叶中,并用含有Na2CO3和NaHCO3碱性盐溶液的培养基进行筛选,得到抗盐碱转化植株.碱性盐浓度48mmol/L宜于子叶愈伤诱导,有利于转化植株的获得.对转化植株进行PCR检测,初步证明目的基囚序列已经整合剑苜楷基因组中.移栽成活的13棵碱性盐抗性植株经PCR检测有3棵植株呈阳性.     

双价抗虫植物表达载体p3300-bt-pta转化苜蓿的初步研究

以中苜1号无菌苗子叶为外植体,采用农杆菌介导的叶盘法,将含有CryIA(a)/CryIA(c)基因、半夏凝集素(pta)基因和bar基因的双价抗虫植物表达载体p3300-Bt-pta导入苜蓿子叶中,在含除草剂的筛选培养基中连续筛选,获得抗性转化植株.研究了农杆菌菌液浓度、浸染时间、共培养时间等因素对苜蓿转化效率的影响,结果表明:各因素对苜蓿转化率均有不同程度的影响,当转化的菌液浓度OD600为0.6、浸染时间为10min、共培养时间为3d时转化效率较好.载体的抗性基因为除草剂草丁膦抗性的Bar基因,对子叶外植体的最佳筛选浓度为8mg/L;抑制农杆菌所用Carb的有效工作浓度为400mg/L,以后继代逐次减少用量到100mg/L;按此方法以根癌农杆菌菌株EHA105介导,将双基因Bt和pta导入紫花苜蓿品种"中苜1号",最终获得122棵除草剂草丁膦(ppt)抗性的植株,经过初步的PCR及RT-PCR分子生物学检测,有30棵检测到特异性条带,表明外源基因已成功整合到苜蓿基因组中,并在转录水平得到表达.     

口蹄疫病毒抗原决定簇融合基因转化苜蓿

摘要：通过农杆菌的介导,以携带O型和A型口蹄疫抗原决定簇融合基因O21 O14 A21 HBcAg的植物表达载体转化苜蓿(Medicago sativa)愈伤组织,并再生得到抗性植株。试验建立了苜蓿甘农1号愈伤组织再生系统;优化了农杆菌介导的苜蓿遗传转化系统;获得抗性再生植株4棵;GUS报告基因在转化的愈伤组织中得到瞬时表达;抗性植株PCR检测结果证实目的基因已经成功整合到苜蓿基因组中。     

农杆菌介导犁苞滨藜NHX基因转化苜蓿的影响因素

以新牧1号杂花苜蓿(Medicago varia Martin.cv.Xinmu No.1)和新疆大叶苜蓿(Medicago sativa L.cv.Xinjiang Daye)无菌苗叶片和子叶为材料,通过根癌农杆菌EHA105介导转化犁苞滨藜NHX耐盐基因,提高植株耐盐性。本文对农杆菌转化条件进行研究,结果表明:以预培养3d的子叶为转化受体,菌液浓度OD₆₀₀为0.4～0.5时,浸染10～15min,然后转入附加20～30mg/L乙酰丁香酮的共培养基,培养4d,可以获得较高的转化效率;对抗性芽的PCR检测初步证明,外源基因整合到苜蓿的基因组中。     

牛皮蝇HA抗原基因转化紫花苜蓿的研究

以“甘农1号”紫花苜蓿(Medicago sativa)7 d苗龄子叶和下胚轴为受体材料,建立了高效的苜蓿再生体系和遗传转化体系,筛选出MS+2,4 D 2.0 mg/L+6 BA 0.5 mg/L和MS+6 BA 0.5 mg/L+NAA 0.03 mg/L+GA3 2.0 mg/L为苜蓿子叶愈伤组织诱导和分化的适宜培养基;探讨了农杆菌浓度OD600约0.5、感染时间8~10 min、共培养时间2 d为适宜的转化条件。采用农杆菌介导法将Hyperdomin A（HA）基因导入紫花苜蓿,经PCR检测和Southern分子杂交分析,结果表明HA基因已经整合到苜蓿基因组中,可为牛皮蝇蛆病可食性疫苗的研究提供理论基础。     

农杆菌介导的xynB基因转化苜蓿的初步研究

构建了PBI121-xynB表达载体,利用农杆菌介导法进行紫花苜蓿遗传转化研究,将xynB基因的cDNA序列导入苜蓿。转基因植株生长发育良好,RT—PCR检测xynB基因已经导入到苜蓿中,DNS方法检测转基因植株的木聚糖酶活性为10.5 U/g鲜叶片。     

脱水素基因转化紫花苜蓿及其初步抗旱性分析

为了获得抗旱性较强的转基因苜蓿,试验以紫花苜蓿品种"中苜2号"作为基因转化受体,将沙冬青脱水素基因通过农杆菌介导,转化到"中苜2号"中。试验结果表明,子叶和下胚轴作为外植体愈伤组织诱导频率最高,外植体与农杆菌的共培养时间以5d为最佳,试验共获得126株抗性再生植株;PCR和RT-PCR鉴定后,得到了11株阳性转基因苜蓿;通过干旱处理后,经初步的表型和脯氨酸分析显示,转基因苜蓿具有较强的抗旱能力。     

水稻金属硫蛋白基因(rgMT)遗传转化的紫花苜蓿耐盐性分析

采用根癌农杆菌介导法将从水稻(Oryza sativa)中克隆出的一个金属硫蛋白基因(rgMT)转化到紫花苜蓿(Medicago sativa)品种"农菁1号"中,经PCR和Northern blot技术对获得的抗性植株进行了检测,证明rgMT基因已整合到苜蓿基因组中并在转基因植株中转录表达。以野生型苜蓿为对照,对获得的转基因苜蓿株系在不同浓度NaCl、NaHCO3胁迫下的表型和生理指标测定发现,NaCl、NaHCO3胁迫处理后,野生型苜蓿受胁迫严重甚至死亡,转基因苜蓿受胁迫较轻。转基因苜蓿的脯氨酸含量和超氧化物歧化酶活性显著高于野生型(P0.05),细胞膜透性显著低于野生型,野生型苜蓿叶片中积累的过氧化氢高于转基因苜蓿的叶片中积累的过氧化氢。研究结果表明,rgMT基因已在苜蓿中表达,并且提高了转基因苜蓿的耐盐性。     

农杆菌介导的smt1富硒基因转化紫花苜蓿研究

利用遗传转化,将硒富基因转入紫花苜蓿（Medicago sativa）是提高苜蓿富硒能力,解决当前硒不足问题的有效途径之一。本研究以“中苜1号”紫花苜蓿为受体材料,通过农杆菌介导法将来自硒超富集植物二沟黄芪(Astragalus bisulcatus)的硒代半胱氨酸甲基转移酶基因(smt1)转入苜蓿,并以3 mg·L-1潮霉素进行筛选,获得转化植株10株。结果表明,5株均能扩增出与smt1基因大小相符的条带。RT PCR检测结果表明,2株目的基因表达呈阳性,这表明smt1基因已成功转入紫花苜蓿基因组中,且可以在植株中正常表达。     

Transformation of alfalfa with smtl gene mediated by agrobacterium

利用遗传转化,将硒富基因转入紫花苜蓿（Medicago sativa）是提高苜蓿富硒能力,解决当前硒不足问题的有效途径之一。本研究以＂中苜1号＂紫花苜蓿为受体材料,通过农杆菌介导法将来自硒超富集植物二沟黄芪（Astragalus bisulcatus）的硒代半胱氨酸甲基转移酶基因（smt1）转入苜蓿,并以3mg.L-1潮霉素进行筛选,获得转化植株10株。结果表明,5株均能扩增出与smt1基因大小相符的条带。RT-PCR检测结果表明,2株目的基因表达呈阳性,这表明smt1基因已成功转入紫花苜蓿基因组中,且可以在植株中正常表达。     

甜菜碱合成酶基因转化羊草的研究

以吉生1号羊草根茎为外植体诱导愈伤组织,通过基因枪法分别将甜菜碱合成酶基因CMO、BADH以及CMO)+BADH双价基因导人羊草中,用含有Na2CO3和NaHCO3碱性盐溶液的培养基进行筛选,得到了抗盐碱转化植株.对转化植株进行PCR扩增后电泳检测及Southern杂交,初步证明目的基因序列已经整合到羊草基因组中.在混盐高pH值胁迫下,羊草叶片甜菜碱含量的检测结果表明,转双基因植株的甜菜碱含量高于转BADH基因植株、转CMO基因植株及对照.     

根癌农杆菌介导的1─磷酸甘露醇脱氢酶基因转化百脉根的研究

本文以百脉根子叶外植体为受体材料，通过根癌农杆菌介导的方法，导入外源目的基因1－磷酸甘露醇脱氨酶（mtlD）基因和npt－Ⅱ基因，建立了转化系统，获得转基因植株，转化频率为9．7％．转化处理的外植体再生植株的茎段在含卡那霉素的分化培养基上膨大，再生成苗和植株。抗性植株的形态正常，移入盆栽后生长良好。PCR扩增与扩增产物的Southern杂交证明外源基因已整合到百脉根基因组上。     

农杆菌介导白三叶草高效遗传转化和转基因植株再生

利用子叶下胚轴为外植体,通过农杆菌Ti质粒介导途径,建立了白三叶草高效遗传转化及转基因植株高频率再生体系。PCR检测及Southern印迹鉴定结果表明,外源T-DNA片段已整合到转基因植株的基因组中,且多以1~2个少数拷贝存在。Northern印迹结果和对报告基因GusA编码蛋白的活性检测结果表明,目的基因在部分转基因植株中高水平表达。适宜条件下外植体遗传转化后的植株再生比例达58.23%~62.12%。与对照相比,转基因植株在外部形态上没有发生改变。     

DREB2A基因对苜蓿遗传转化的研究

以黑龙江紫花苜蓿Medicago sativa主栽品种:肇东苜蓿、敖汉苜蓿、公农1号和公农2号为受体材料,系统地探讨了除菌剂种类和浓度以及卡那霉素筛选浓度等,建立了高效的苜蓿再生体系和遗传转化体系;分别构建了由诱导型启动子rd29A和组成型启动子E12调控的DREB2A基因的2个植物表达载体pB2A29A和pB2AE12;采用农杆菌介导法进行遗传转化,获得大量转基因抗性植株并进行了分子生物学(PCR和Southern blot)检测.结果表明,DREB2A基因已整合到苜蓿基因组中.     

农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白基因VP7转化紫花苜蓿的研究

以公农1号紫花苜蓿5～7日龄无菌苗子叶为材料,通过农杆菌介导法将轮状病毒抗原蛋白基因VP7转入紫花苜蓿子叶中,并用卡那霉素进行筛选获得抗性植株.提取转化抗性植株叶片DNA作模板,用VP7基因特异引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳分析表明有7株扩增出了960bp的特异条带.对7株PCR阳性植株进行PCR- Southern杂交和Southern杂交分析,有4株出现阳性杂交信号,表明目的基因已经整合到紫花苜蓿基因组中,并且是1～2个拷贝.     

日本血吸虫铁蛋白基因在油菜中的表达

根据GenBank日本血吸虫铁蛋白基因(SjFer)的序列设计1对特异性引物,利用PCR从cDNA文库中扩增SjFer基因,与T载体连接并测序。常规方法构建植物表达载体SjFer/pBI121,采用根癌农杆菌介导法转化油菜子叶,组织培养卡那霉素抗性筛选,获得转化植株。转化植株通过PCR和Northern-blot杂交进行鉴定。结果表明SjFer可在油菜中正确表达。该研究为进一步研究转基因油菜工程疫苗奠定了基础。     

MsNHX1基因转化紫花苜蓿及转基因植株的鉴定

以紫花苜蓿"中苜1号"(Medicago sativa L.cv.Zhongmu No.1)7日龄无菌苗子叶为外植体,建立适用于农杆菌介导的转基因组织再生体系,并进行MsNHX1基因转化试验。MsNHX1基因编码"中苜1号"液泡膜Na /H 逆向转运蛋白,将其转化到"中苜1号"中,以期获得耐盐性更好的苜蓿材料。利用PCR技术、RT-PCR技术及Dot Blotting技术对转基因植株进行鉴定,结果显示:MsNHX1基因已经整合到"中苜1号"基因组内,并且可以转录为mRNA。     

抗菌肽基因导入桑树获得抗病转基因植株

用携带抗菌肽基因的农杆菌处理桑子叶,在含有羧苄青霉素（Cb）400～500mg／L和卡那霉素（Km）20mg／L的MS培养基上,有32.4％的子叶产生了不定芽;66.5％的不定芽在含有Cb300mg／L和Km30～40mg／L的培养基中,正常生长成2～3cm高的新稍;新梢在含Cb50mg／L和Km10mg／L的生根培养基中有72．6％形成完整根系。3次转化共获得12个株系55株KmR植株。不同株系桑苗叶片DNA点杂交分析显示,7个株系有阳性杂交信号。KmR株系桑苗的抗病性测定显示,5个株系共14株桑苗对青枯病具有较强抗性.     

干燥体细胞胚用作转基因苜蓿人工种子的研究

为探明干化的体细胞胚作为转基因苜蓿(Medicago sativa)人工种子的可行性,采用农杆菌菌株GV3101 感染苜蓿叶柄的遗传转化方法,获得转化苜蓿植株并诱导转化出苜蓿植株的体细胞胚。将成熟的子叶期体细胞胚先置于含10 mM脱落酸的胚形成培养基BOi2Y中培养14 d,然后将胚置于一系列的6种干燥剂中缓慢干燥7 d,最后将胚转到1/2MSO萌发培养基中,直到茎叶萌发和根形成。分析不同转基因株系干化人工种子的萌发率和再生植株中的GUS表达,并利用Southern杂交分析转基因干化人工种子再生植株的遗传变异。结果表明:干化后的转基因人工种子萌发率达到74.3%,产生的植株从形态上相似于没有干化处理的体细胞胚再生植株。在随机的3个转基因株系中,Southern杂交结果表明再生植株仍能稳定表达GUS,每个株系基因整合位点一致。因此,干化体细胞胚用作转基因植物种质保藏的方法是有效可行的。     

紫花苜蓿MsZIP基因RNAi表达载体的构建及苜蓿转化

根据已经得到的MsZIP基因序列(GenBank序列号:HQ911778),设计两对含有酶切位点的引物ZIPF1/ZIPF2和ZIPR1/ZIPR2,合成用于构建干扰载体的正反义片段。将正反义片段插入到载体pART27中,构建成为含有发夹结构的RNAi干扰载体pART-F-R。采用农杆菌介导的方法,将该干扰载体成功转化到苜蓿中,得到9株抗性苗,选取其中的3株进行PCR鉴定,结果表明成功得到转基因苜蓿。