猪链球菌2型实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

试验根据猪链球菌2型荚膜多糖（CPS）抗原设计CPS2J基因特异性引物,建立猪链球菌2型实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法的标准曲线为y=-3.073x+36.87,r=0.995,熔解曲线只有单一的特异峰。敏感性试验显示,该方法可以检测出模板最低浓度为1.0×10¹拷贝/μL,是普通PCR的10倍;特异性试验显示,对猪链球菌2型具有良好的特异性,能够区分其他血清型猪链球菌和其他细菌;重复性试验变异系数为0.37%~0.63%,均低于2.5%。临床检测显示该方法的敏感性明显高于常规PCR方法和细菌分离的方法。以上结果表明,本研究建立的方法敏感性高、特异性强、重复性好,有利于对猪链球菌2型的快速检测。     

贝类派琴虫LUX荧光PCR检测方法的建立

为满足贝类派琴虫病的快速检测需要,本研究选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物,通过对反应体系和反应条件的优化,首次建立了LUX荧光PCR检测派琴虫的方法。试验表明,所建立方法检测质粒模板DNA的动态范围为1.0×101-1.0×108,敏感性为10拷贝质粒DNA。采用模拟阳性样品试验,可检测到100拷贝质粒DNA。而且与贝类的包拉米原虫、隐孢子虫等其它寄生性原虫无交叉反应,也不受组织DNA的干扰。50份采集样品的检测结果与RFTM培养方法一致。本研究所构建的派琴虫LUX荧光PCR检测方法具有快速、灵敏、特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。     

快速鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种双重PCR方法的建立

本试验旨在建立一种快速、特异、敏感的双重PCR鉴定猪链球菌和马链球菌兽疫亚种病原检测方法。根据猪链球菌GDH蛋白和马链球菌类 M 蛋白的基因保守区分别设计引物,优化了该双重PCR检测方法的引物浓度及比例,并筛选了其最佳退火温度;用该双重PCR反应体系以其他几株阴性菌株为对照,检测了该反应体系的特异性。以新鲜培养的猪链球菌倍比稀释后进行菌落计数,对该检测方法的敏感性进行了鉴定。M-like和GDH引物的加入量均为1 μL(20 pmol/L),最佳退火温度为52.3℃;该双重PCR反应体系有较高敏感性,检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌的敏感度分别达100和10 CFU;特异性试验结果显示,常见的5种病原菌在该双重PCR体系中无特异性条带出现;临床应用该方法分离鉴定了1株猪链球菌和2株马链球菌兽疫亚种。本试验建立了一种能同时检测猪链球菌和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法,且该方法应用快速、特异且敏感。     

猪链球菌种与9型猪链球菌二重PCR检测方法的建立及应用

为了建立猪链球菌(Streptococcus suis,SS)种与9型猪链球菌(SS9)的快速诊断方法,本研究根据GenBank已登录的SS种特异性基因gdh和SS9型特异性基因CPS9H设计引物,以标准SS9株基因组DNA为模板,建立了SS种和SS9的二重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的方法对检测疑似猪链球菌感染猪临床样品,并与常规细菌分离鉴定方法进行了比对。结果表明成功建立SS种和SS9型猪链球菌二重PCR检测方法,该方法的检测灵敏度可达100个CFU,特异性和重复性好;利用该方法对34份临床分离自疑似猪链球菌感染样品的细菌培养物进行了应用检测试验,其中有11份样品为gdh阳性,11份gdh阳性样品中有3份样品同时为SS9阳性。本研究成功建立了SS种与SS9型猪链球菌二重PCR检测方法,可用于猪链球菌种和SS9型猪链球菌的快速诊断。     

无乳链球菌恒温热隔绝式PCR快速检测方法的建立

为建立快速检测无乳链球菌的方法,本研究针对无乳链球菌表面免疫原性蛋白sip基因的保守区域设计特异性引物,建立了快速检测无乳链球菌的恒温热隔绝式PCR(iiPCR)方法。该检测方法能在30 min内迅速扩增出大量大小为105 bp的目的条带;并与肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、乳房链球菌、停乳链球菌均无交叉反应;检测下限为10~2拷贝/μL,优于普通PCR方法。本研究建立的检测方法具有操作简便、高特异性、高敏感性及高扩增效率的特点,适用临床或基层实验室使用。     

猪圆环病毒3型TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。该检测方法在4.78×10~1拷贝/μL～4.78×10~9拷贝/μL质粒标准品范围内均有良好的线性关系;该方法特异性试验结果显示,其与多种常见猪病病毒均无交叉反应,特异性良好;本研究建立的方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高;批内批间重复性试验变异系数均小于2.3%,重复性良好。对临床样品的检测结果显示,该方法对PCV3的检出率高于常规PCR方法,并且PCV3阳性样品多存在混合感染情况。该方法的建立为PCV3的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

猪流行性腹泻病毒和猪博卡病毒3/4/5型双重PCR检测方法的建立

为建立快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪博卡病毒(PBoV)3/4/5型的双重PCR方法,本研究根据Gen Bank中登录的PEDV ORF1基因序列和PBoV不同基因型VP1序列,设计2对特异性引物,通过对PCR扩增条件的优化,建立了能够同时检测PEDV和PBoV3/4/5型双重PCR方法,特异性检测结果显示该方法对猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、猪链球菌核酸扩增均为阴性;敏感性检测结果显示,对PEDV和PBoV3/4/5型重组质粒标准品的最低检出量分别为837拷贝/μL和1 000拷贝/μL;临床样品的检测结果显示,所建立的双重PCR方法可同时有效地检测出PEDV和PBoV3/4/5型混合感染及单独感染。本研究建立的双重PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效检测PEDV和PBoV提供了技术帮助。     

支气管败血波氏杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立支气管败血波氏杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,本研究根据波氏菌属毒力基因DNT设计一对特异性引物,通过优化,确定最佳反应条件,建立了支气管败血波氏杆菌荧光定量PCR检测方法。并对其进行敏感性、特异性、重复性试验以及临床样品的检测。以支气管败血波氏杆菌标准质粒为模板,建立标准曲线结果显示:标准品浓度在1.13×10~8拷贝/μL～1.13×10~2拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关数R~2=0.997;该方法的灵敏度可达1.13×10~1拷贝/μL。建立的荧光定量PCR方法与副猪嗜血杆菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌等12种细菌和伪狂犬病毒、猪瘟病毒等4种病毒无交叉反应,具有良好的特异性;批内变异系数(CV)均小于2%,批间变异系数均小于4%,具有良好的稳定性。对临床样品的检测结果显示该方法检测的阳性率为57.7%,与普通PCR的符合率为93.24%。本研究建立的方法可以用作支气管败血波氏杆菌感染的早期诊断、快速检测与定量分析。     

猪链球菌通用型和2型双重荧光定量PCR快速检测技术的建立和应用

为快速区分检测猪链球菌血清型2型和其他血清型,以猪链球菌的保守基因gdh和2型特异性基因cps2J为靶基因设计引物和TaqMan探针,建立猪链球菌通用型和2型特异性的双重荧光定量PCR检测方法,并与常规PCR方法一起对临床样品进行检测。结果显示:本方法在1.5h内可完成猪链球菌和2型猪链球菌同时检测,与其他细菌无交叉反应;检测灵敏度可达5拷贝数,标准曲线相关系数大于0.999,批内和批间CV均小于1.25%。对67份临床样品检测显示猪链球菌和2型猪链球菌检出率分别为79.1%和35.8%,与常规PCR检测结果的符合率为92.5%和89.6%,kappa值为0.800和0.757,具有极好的一致性。成功建立了灵敏、特异和稳定的双重荧光定量PCR方法,实现了猪链球菌和2型猪链球菌同时及快速诊断。     

猪链球菌通用及2型TaqMan荧光PCR检测技术建立与应用

在对设计合成的引物和6-carboxy-fluorescein(6-FAM)荧光素标记的TaqMan水解探针进行筛选的基础上,通过反应体系优化,建立了检测猪链球菌通用和2型的2种荧光PCR检测技术,实现了对猪链球菌的快速检测和定型。敏感性、特异性、重复性、感染组织模拟试验及临床样品的检测结果均表明建立的方法快速、特异、灵敏,整个检测过程(包括样品的前处理时间)可在1.5 h内完成,检测培养物和模拟组织样品的灵敏度可达10 CFU～100 CFU。     

Detection of virulent strains of Streptococcus suis type 2 and highly virulent strains of Streptococcus suis type 1 in tonsillar specimens of pigs by PCR.

We developed a PCR assay for the rapid and sensitive detection of virulent Streptococcus suis type 2 and highly virulent S. suis type 1 in tonsillar specimens from pigs. The PCR primers were based on the sequence of the gene encoding the EF-protein of virulent S. suis type 2 strains (MRP+EF+) and highly virulent S. suis type 1 strains (MRP(s)EF+) and of the EF protein of weakly virulent S. suis type 2 strains (MRP+EF). The latter strains give rise to larger PCR products than the virulent strains of S. suis type 1 and 2. A positive control template was included in the assay to identify false negative results. The PCR was evaluated using tonsillar specimens from herds known (or suspected) to be infected and herds without an S. suis history. The results obtained with the PCR assay were compared with the results obtained with a newly developed bacteriological examination. In this bacteriological examination we were able to identify the EF-positive strains directly in the tonsillar specimens. From the 99 tonsils examined, 48 were positive in the PCR and 51 negative. All specimens from which EF-positive S. suis strains were isolated were also positive in the PCR assay. Three samples were positive in the PCR, but negative by bacteriological examination. The results demonstrated that the PCR is a highly specific and sensitive diagnostic tool for the detection of pigs carrying virulent strains of S. suis type 2 and highly virulent strains of type 1. Application of the assay may contribute to the control of S. suis infections.     

猪链球菌病双重PCR诊断方法的建立

根据猪链球菌2型荚膜多糖和马链球菌兽疫亚种类M蛋白的保守区序列分别设计了2对简并引物,建立了一种能同时检测猪链球菌2型和马链球菌兽疫亚种的双重PCR方法。结果显示,该双重PCR能从100个细菌的混合纯培养物中扩增出2条目的片段。而且可以直接从病料组织中检测到相应的病原菌。用建立的双重PCR方法和细菌分离培养法平行检测人工感染的组织病料,PCR方法与细菌培养法的阳性检出率基本一致,但PCR方法的特异性好、敏感性高,简便易行,可以用于猪链球菌病的流行病学调查和实验室的快速鉴别诊断。     

检测猪链球菌２型的溶菌酶释放蛋白（ＭＲＰ）的ＰＣＲ方法的建立

根据猪链球菌２型的mrp基因自设计和合成了一对可扩增长度为８８５bp目的片段的引物，成功地建立了检测溶菌酶释放蛋白（ＭＰＲ）的ＰＣＲ方法，用ＸbaⅠ内切酶进行酶切，获得了与预期一致的５７8bp和３０７bp２的２个片段，并进行了ＰＣＲ的特异性试验和敏感性试验。对马链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和猪肺炎支原体的ＰＣＲ检测结果均呈阴性；检测的敏感度可达１００个细菌。另外，对９株从病猪体内分离的猪链球菌２型菌株进行检测了８个呈阳性；对１５份正常屠宰猪扁桃体分离物的检测结果是１份为阳性。结果表明此法特异性敏感性均很高，可作为ＭＲＰ快速诊和流行病学调查的手段。     

猪链球菌2型多重PCR检测方法的建立及应用

设计3对引物,分别扩增链球菌属特异性gdh、猪链球菌种特异性16S rRNA和猪链球菌2型特异性cps2J等基因,目的片段大小分别为725bp、523bp和387bp。利用合成的3对引物并通过对反应条件与反应体系的优化建立了多重PCR。应用该多重PCR检测了分离到的链球菌1105株,检出猪链球菌667株,猪链球菌2型33株。研究结果表明,该方法特异性高、敏感性强,可广泛应用于猪链球菌病的快速诊断及流行病学调查。     

猪链球菌2型的PCR快速检测

根据猪链球菌 2型的荚膜多糖抗原基因 cps2 J,合成 1对可扩增长度为 6 75 bp目的片段的引物 ,建立了检测猪链球菌 2型的 PCR法。应用 PCR对 9株经玻片凝集试验检测为猪链球菌 2型的菌株进行了检测 ,均呈阳性 ;而对马链球菌兽疫亚种 (C群 )、猪葡萄球菌、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌、猪肺炎霉形体等检测结果均呈阴性 ,表明了本方法的特异性。用此法对 88份正常猪的扁桃体样品的细菌分离物进行了检测 ,36份呈阳性 ,同时用玻片凝集试验进行对照检测 ,也全部呈阳性。而此法不需进行细菌的纯分离培养 ,即可用于猪链球菌 2型的快速诊断以及流行病学调查。     

湖南省猪链球菌的分离与鉴定

从病猪脏器病料中通过细菌培养、生化试验分离鉴定出了121株猪链球菌.经PCR技术鉴定马链球菌兽疫亚种28株,占23.1%,猪链球菌24株,占19.8% ,其中猪链球菌2型4株,占3.3%,猪链球菌9型2株,占1.7%,猪链球菌1型和7型都没检测到,证实省内除了猪链球菌2型外,也存在其他血清型的猪链球菌.     

四川猪2型链球菌病的PCR检测

2005年7月中下旬,四川贵阳等地人、猪陆续发生一种发病惠、死亡快、高度散发的疾病,从病死猪组织中分离出19株链球菌,设计合成3对引物,分别对分离菌株进行了猪链球菌16SrRNA、CPS2J、MRP基因片段扩增,有15株菌3个基因的扩增结果均为阳性,表明此次疲情的病原为猪2型链球菌。     

猪链球菌2型荧光PCR检测方法与常规检测方法的比较

为验证猪链球菌2型荧光PCR检测方法对临床样品检测的敏感性和适用性以及该方法所拥有的独特优点,分别用荧光PCR法、常规PCR法和细菌分离法对人工感染猪链球菌2型的小鼠肝脏和发病猪的心、肝、脾、肾等实质器官和血液、喉拭子进行抗原检测。结果显示,荧光PCR法检出率为70.8%,明显高于普通PCR法（检出率为20.8%）,也高于常规细菌分离法（检出率为45.8%）。由于临床样品常常会被其他细菌污染,细菌分离法很难准确分离到链球菌。但荧光PCR法不受其他细菌污染的影响,对实验室培养的猪链球菌2型菌液,该方法检测滴度可达10-6/0.1mL（42～52 CFU/0.1 mL）,而普通PCR方法检测滴度仅为10-4。     

猪链球菌1、7、9型多重PCR诊断方法的建立及初步应用

为了建立猪链球菌（Streptococcus suis,SS）1、7、9型（SS1、SS7、SS9）的快速鉴别诊断和分型方法,本研究根据GenBank已登录的SS1型特异性的CPS1I基因、7型CPS7H基因、9型CPS9H基因设计引物,以标准SS1、SS7、SS9株基因组DNA为模板,建立了SS1、SS7和SS9的多重PCR检测方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的多重PCR检测方法对11份猪链球菌的临床分离纯化菌株进行了的应用检测。结果表明,成功建立了SS1、SS7和SS9的多重PCR检测方法,该方法的检测灵敏度可达100 CFU/mL,特异性和重复性好;利用多重PCR检测方法对11份猪链球菌临床分离纯化菌株检测结果表明,11份样品中有3份样品为SS9阳性、2份样品为SS7阳性、1份样品为SS1阳性。本研究为临床上SS1、SS7、SS9的快速鉴别诊断提供了一种新方法。