海狮非结核分枝杆菌病病例

非结核分枝杆菌（NTM）是指除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌，如堪萨斯分枝杆菌（M．kansasii）、海分枝杆菌（M．marinum）等。非结核分枝杆菌感染海狮后常导致肺部感染，引起结核样病变（结核结节、干酪样坏死及空洞形成），严重者可累及全身各个脏器。进食被非结核分枝杆菌污染的冷冻海水鱼可能是主要的感染途径。笔者在临床工作中遇到2例海狮非结核分枝杆菌感染的病例，总结经验教训，报告如下。     

非洲猪瘟病原学特征及其疫苗的研究进展

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起家猪或野猪感染的一种高度致死性、急性、出血性传染病。2018年8月,中国首次报道非洲猪瘟疫情,对我国养猪业的危害极其严重。本文以ASFV为研究对象,分别从病毒的结构特点、主要病毒蛋白、传播途径、致病机理等方面归纳总结了ASFV的病原学特点,分析讨论了ASF灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗的研究现状,提出目前我国ASF疫苗研发所面临的各种挑战,为疫苗的研发提供新的认识和途径,为科学防控非洲猪瘟提供参考。     

寄生虫细胞因子免疫的研究进展（二）

3．1细胞因子抗寄生虫作用机制3．1．1激活巨噬细胞细胞因子主要是调节机体细胞免疫发挥抗虫作用,保护机体不被感染,巨噬细胞（MФ）是主要功能的承担者。寄生虫侵入机体,首先接触的肠道上皮组织,肠道上皮中的细胞有15％是淋巴细胞,     

非洲猪瘟病毒EP364R蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及鉴定

非洲猪瘟病毒（ASFV）EP364R蛋白是ASFV的ERCC4核酸酶结构域。为了获得具有免疫原性的EP364R蛋白,本研究将ASFV EP364R基因构建到杆状病毒表达载体上,将重组质粒转座DH10Bac感受态中,经过3次蓝白斑筛选,获得重组BacmidEP364R质粒,将Bacmid-EP364R质粒转染至细胞中,收获上清,在正常细胞中传三代,以获得重组杆状病毒rBac-EP364R。使用Western blot和间接免疫荧光（IFA）实验鉴定重组蛋白得到表达及其免疫原性。本研究结果显示,在感染的细胞可检测到EP364R蛋白的表达,并可被His单克隆抗体特异性识别。结果表明杆状病毒系统成功表达EP364R蛋白并具有良好的反应活性,为后续开展ASFV血清学诊断和亚单位疫苗的研究奠定基础。     

非洲猪瘟病毒免疫调节基因的功能及其在病毒感染和致病中的作用

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，ASFV强毒株感染家猪的发病率和致死率可达100%。由于没有安全有效的疫苗和药物，ASF疫情已经给世界养猪产业造成了巨大的经济损失。ASFV是一种有囊膜的双链DNA病毒，能够编码150～200种蛋白。ASFV编码的一些蛋白参与病毒入侵、基因组复制、DNA修复和病毒粒子组装；另外一些蛋白还执行免疫调节功能，在逃逸宿主抗病毒免疫反应中发挥着重要的作用，如调控NF-κB信号、干扰素(IFN)信号和炎症反应，调控细胞死亡和细胞自噬等。本综述将编码调控NF-κB信号、天然免疫反应、炎症反应、细胞死亡和细胞自噬等功能的ASFV蛋白的基因，统一称为ASFV免疫调节基因。大量研究证据表明，ASFV免疫调节基因与病毒的致病力密切相关。缺失一个或多个ASFV免疫调节基因的ASFV毒株毒力降低，用这些减毒毒株免疫猪可以抵抗ASFV强毒株的攻击。然而，ASFV免疫调节基因在ASFV感染和发病过程中如何发挥作用仍然未知。因此，本综述对ASFV免疫调节基因的功能及其在病毒感染和致病中的作用进行了总结，以期为研究AS...     

非洲猪瘟病毒pK145R蛋白的原核表达及抗血清的制备

为制备兔抗ASFV pK145R蛋白的多克隆抗体,本研究以中国首次分离的ASFV HLJ/18毒株K145R基因的真核表达质粒p CAGGS-Flag-K145R为模板扩增K145R基因,构建重组原核表达质粒p ET-21a-K145R,利用镍亲和层析预装柱纯化p K145R蛋白并免疫新西兰大白兔,制备兔抗ASFV pK145R蛋白多克隆抗体,并通过免疫印迹（WB）、间接免疫荧光（IFA）及免疫沉淀（IP）试验对该抗体进行验证。结果显示：本研究成功构建了原核表达质粒p ET-21a-K145R,将该质粒转化细菌BL21(DE3)获得能够可溶性表达p K145R蛋白的重组菌,分子量约为16.0 kDa;利用高度纯化的ASFV pK145R蛋白,制备了兔抗ASFV pK145R蛋白的多克隆抗体,该抗体能够特异性地识别HEK293T细胞中瞬时表达的Flag-K145R蛋白和ASFV感染猪肺泡巨噬细胞中表达的ASFV K145R蛋白。本实验为深入研究p K145R蛋白的功能及其在ASFV感染致病性中的作用奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒基因分型与血清分群研究进展

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）具有高传染性和致病性,给养猪业造成巨大经济损失。研究非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）基因分型有助于从分子水平追溯引发疫情的病毒来源,掌握潜在的传播途径及可能的传播方式。随着ASFV分型技术的不断演变,ASFV基因组遗传演变研究不断深入。截至目前,ASFV已被划分成24个基因型或8个血清群。本文综述了ASFV P72（B646L）基因分型、IGR分型、9RL/B602L基因分型、P54（E183L）基因分型等的研究历程,特别是最新的IGR分型研究。研究显示：P72基因相对保守,因此P72基因分型是国际最通用、快速、方便的分型方法,并且是新传入地域进行鉴别诊断的首选方法;其他基因分型及血清群分析,可有助于预判ASFV分子流行病学变化和毒力演变。本研究可为我国ASFV诊断技术及遗传演变研究提供参考。     

非洲猪瘟病毒拮抗宿主抗病毒免疫分子机制研究进展

非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）是核质巨DNA病毒,它引起的非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是一种高度接触性、致死性传染病。ASF的出现给全球养猪业和整个市场经济带来了巨大威胁和挑战。目前尚无针对ASF的有效疫苗,而对ASFV感染机制和免疫逃逸机制认识的不足是制约商品化疫苗研究的主要因素。本文对ASFV的结构和生命周期进行了总结,并从先天性免疫反应、适应性免疫反应和程序性细胞死亡3个方面,对ASFV调控宿主抗病毒反应的分子机制进行了归纳,以期为ASFV致病机制研究和新型疫苗靶点研究提供参考。     

非洲猪瘟病毒免疫逃逸分子机制研究进展

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)感染猪引起的一种急性、烈性、高度接触性传染病，至今没有研发出安全有效的疫苗，一旦暴发会造成重大经济损失。ASFV在和宿主长期作用过程中，通过抑制干扰素和炎症反应，调节凋亡、自噬及细胞免疫等多种途径逃逸机体免疫反应促进自身复制，但具体的机制仍不完全清楚。ASFV复杂的免疫逃逸机制可能是阻碍有效疫苗研发的关键因素之一。借助生物信息学技术对ASFV的基因组和蛋白质组深入分析，筛选病毒的免疫调控关键基因和保护性抗原表位，将在ASFV免疫逃逸分子机制的研究与疫苗研发中发挥重要作用。本文主要对ASFV感染引起的免疫应答反应及可能的免疫逃逸机制研究进行概述，以期为ASF疫苗研制及综合防控提供思路。     

表达非洲猪瘟病毒p54蛋白重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定

试验旨在构建能高效表达非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV） p54蛋白的重组伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）。通过无缝克隆构建含有PRV TK基因同源臂和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的PRV通用转移载体pCAGIG-TK_（l+r）,参考China/2018/AnhuiXCGQ株基因序列,优化合成E183L基因,并连入通用转移载体,构建重组中间转移质粒pCAGIG-TK_（l+r）-p54;重组质粒ScaⅠ酶切线性化后经脂质体介导转染BHK-21细胞,6 h后感染0.1个感染复数（MOI） PRV变异株,出现病变后通过空斑挑选和PCR鉴定纯化重组PRV,进一步通过Western blotting和间接免疫荧光试验（IFA）检测外源蛋白表达,并对重组病毒的遗传稳定性和增殖特性进行研究。结果显示,转染重组质粒pCAGIG-TK_（l+r）-p54的BHK-21细胞24 h后可观察到绿色荧光,说明重组质粒成功转入BHK-21细胞;纯化后的重组病毒表达绿色荧光蛋白且含有ASFV E183L基因,Western blotting和IFA结果证实重组PRV在BHK-21细胞中能表达p54外源蛋白,在26 ku处呈现特异性条带,且能与ASFV阳性血清发生特异性反应,免疫原性较好;重组病毒在BHK-21细胞上连续传代20次均能检测到ASFV E183L基因,遗传稳定性较好;一步生长曲线显示,重组病毒与亲本病毒的增殖特性差异不大,且二者的最高病毒滴度分别为10^7.34/0.1 mL和10^7.61/0.1 mL,外源片段的插入不影响重组病毒在细胞上的增殖能力。本研究成功获得了表达ASFV p54蛋白的重组病毒rPRV-p54,为进一步研究p54蛋白的免疫原性及开发非洲猪瘟多基因重组PRV载体疫苗奠定了基础。     

过表达非洲猪瘟病毒D1133L蛋白的MA-104细胞系建立及其初步应用

旨在研究非洲猪瘟病毒(African swine fever, ASFV)编码的D1133L基因功能,本文利用慢病毒表达系统构建了过表达D1133L的MA-104/D1133L细胞系,分析ASFV在MA-104/D1133L细胞系与MA-104细胞中的复制差异。利用RT-qPCR和Western blot技术分别检测了ASFV感染MA-104/D1133L细胞后p30和p72基因的转录和蛋白表达水平,同时测定病毒滴度和病毒拷贝数评价ASFV的复制能力。结果表明：ASFV p30和p72基因在MA-104/D1133L细胞系的转录和蛋白表达水平高于野生型细胞系,ASFV在MA-104/D1133L细胞系的病毒增殖能力高于野生型细胞。本研究成功构建了过表达ASFV D1133L基因的MA-104/D1133L细胞系,与野生型细胞相比,D1133L能促进ASFV增殖,MA-104/D1133L细胞系更利于ASFV的复制,本结果为进一步研究ASFV D1133L基因功能积累了生物材料。     

感染非洲猪瘟强毒株和弱毒株的野猪排毒方式的差异

自从非洲猪瘟病毒（ASFV）再次出现以来,该病在欧亚大陆以前所未有的动物大流行方式传播。目前,ASF是全球养猪业面临的最大问题。野猪是ASFV的关键宿主,病毒可以在其中独立循环传播,因此迫切需要研制一种有效的疫苗来抵抗该病毒。目前的科学争论在于：出于安全考虑,接种已经表现出交叉保护易感宿主方面良好效果的减毒活疫苗（LAVs）是否可行。因此,研究的目的是比较ASFV强毒株和弱毒株（LAV）感染野猪后的排毒情况。接种Lv17/WB/Rie1分离株和Armenia07强毒株的野猪表现出了不同的病毒排出途径（唾液和粪便）和病毒血症率。与感染Armenia07强毒株的动物相比,感染Lv17/WB/Rie1分离株动物的血液、唾液、粪便中较少检测出阳性。通过描述排毒特征来理解其传播动力学。这部分知识将有助于评估野猪中新弱毒株的排毒模式,其中还包括与目前最有应用前景的基因缺失突变减毒活疫苗进行比较。     

非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

为制备非洲猪瘟病毒（ASFV）p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化（IHC）检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示：基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。     

非洲猪瘟病毒载体疫苗研究进展

非洲猪瘟（ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）引起的一种烈性传染病，严重影响畜牧业发展，可造成巨大经济损失，目前对其仍缺乏有效的治疗手段，其疫苗也处于研究阶段。病毒载体疫苗作为一种经济省时的新型疫苗，免疫效果稳定且安全，可用于递送ASFV免疫原，对于发展ASF免疫防控技术研究有着重要意义。本文对ASFV病毒载体疫苗研究进展进行综述，重点介绍ASFV现有病毒载体疫苗免疫原选择和各病毒载体抗原递呈效果及其免疫原性，为后续ASFV的免疫学研究和病毒载体疫苗研发提供参考。     

非洲猪瘟病毒MGF 360-9L基因序列分析、蛋白结构预测及亚细胞定位

前期研究结果表明，非洲猪瘟病毒（ASFV） MGF 360-9L能显著抑制宿主天然免疫应答，故通过比较、分析ASFV中MGF 360基因序列，进一步研究MGF 360-9L基因结构和功能间的关系。本研究采用生物信息学方法，分析该基因的一级结构并预测该基因的表达蛋白二、三级结构；根据GenBank公布的Georgia 2007/1（FR682468.1）序列，合成MGF 360-9L基因并构建其重组真核表达质粒，Western blot验证该基因表达后，将重组质粒转染至PK-15细胞，经染色后观察其蛋白的亚细胞定位。结果表明，以Ⅱ型Georgia 2007/1基因组中MGF 360-9L基因为参照，其在Ⅱ型ASFV毒株中高度保守，在54株不同基因型毒株间的相似性与ASFV系统进化关系一致，保守序列为3'末端378 bp片段，高级结构以α螺旋为主，核定位序列预测其定位于细胞核内；构建真核表达质粒，成功表达目的蛋白且定位于细胞核内。本研究结果为进一步研究MGF 360-9L基因抑制免疫应答和明确MGF 360基因家族在ASFV的致病机制积累了资料。     

非洲猪瘟病毒多基因家族MGF360-13L基因功能的初步研究

旨在初步探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)多基因家族MGF360-13L基因的功能。使用生物信息学软件对MGF360-13L基因进行分析;构建真核表达质粒pVAX1-MGF360-13L并转染至293T细胞进行表达;利用同源重组方法构建基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L,以相同的感染复数(MOI=0.01)在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中感染基因缺失毒株和亲本毒株(ASFV CN/GS/2018)后,利用红细胞吸附试验(HAD)计算病毒滴度并绘制体外生长曲线;以MOI=1将ASFV-ΔMGF360-13L和ASFV CN/GS/2018分别感染猪骨髓巨噬细胞(BMDM),利用qPCR和ELISA测定细胞炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平。结果表明,MGF360-13L基因在ASFV基因Ⅱ型中相对保守,编码蛋白属于非分泌型、无跨膜区、亲水性好;构建的真核表达质粒pVAX1-MGF360-13L被293T细胞表达;成功获得MGF360-13L单基因缺失毒株ASFV-ΔMGF360-13L,与ASFV CN/GS/2018相比,其体外复制没有显著性差异;在ASFV-ΔMGF360-13L感染BMDM后,IL-1β、IL-6和TNF-α炎性细胞因子在转录和分泌水平都显著高于ASFV CN/GS/2018。本研究成功制备了ASFV的MGF360-13L基因缺失毒株,并证实了MGF360-13L基因作为ASFV复制非必需基因具有抑制炎性因子表达的功能,这为进一步注释ASFV MGF360-13L基因功能提供了线索。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫原性分析

非洲猪瘟病毒（ASFV）p54蛋白由晚期基因E183L编码,是主要的结构蛋白之一。为了获得免疫原性强的p54蛋白,本研究将E183L基因克隆至pFastBac1载体中,取1μg重组质粒转座DH10Bac感受态细菌,经三轮蓝白斑筛选后,获得重组Bacmid-p54。将提取的Bacmid-p54质粒DNA转染Sf9细胞,出现明显病变后,收获细胞培养上清,在正常Sf9细胞中传三代,获得的杆状病毒命名为rBac-P54。利用SDS-PAGE检测rBac-P54感染后昆虫细胞的蛋白表达情况,并通过间接免疫荧光（IFA）和Western-blot鉴定p54蛋白的免疫原性。结果显示,在感染的Sf9细胞中,p54蛋白能获得高效表达,并可被ASFV阳性血清特异性识别。这表明杆状病毒系统表达的p54蛋白具有良好的免疫原性,为后续开展非洲猪瘟血清学诊断和p54功能研究奠定基础。     

抗非洲猪瘟病毒单链抗体的构建、表达及活性鉴定

制备抗非洲猪瘟病毒（ASFV）猪源单链抗体（ScFv）,并对其生物学活性进行鉴定,筛选出具有ASFV反应活性的猪源单链抗体（ScFv）,为ASFV的诊断提供新的材料。采集ASFV感染康复猪的外周血,分离淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,以此为模板通过PCR扩增得到猪源IgG重链可变区与轻链可变区基因,利用SOE-PCR技术扩增拼接得到猪源ScFv基因;构建pET-30a-ScFv表达载体,进行蛋白的表达与纯化,用ELISA和IFA鉴定ScFv抗体的反应活性。结果显示,成功扩增出猪源ScFv（VH-VLκ、VH-VLλ）基因,鉴定到1株与ASFV存在反应活性的ScFv（VH-VLλ₁₁）抗体。结果表明,成功筛选到1株与ASFV存在反应活性的ScFv（VH-VLλ₁₁）抗体,为ASFV诊断和防控提供了新型原材料。     

非洲猪瘟很容易通过饲料和饮水传播

正美国最新研究表明,非洲猪瘟病毒(ASFV)可以通过水和饲料2种途径很容易地通过口腔传播。这是堪萨斯州立大学动物诊断医学和病理学助理教授Megan Niederwerder博士领导的研究小组得出的结论。Niederwerder博士的团队发现,引起液体感染所需的病毒水平极低,表明ASFV通过口腔途径具有很高     

饮水消毒及关联措施对预防ASFV经口途径感染的效果探讨

<正>非洲猪瘟(ASF)来势汹汹,给养猪业造成巨大的损失。非洲猪瘟病毒(ASFV)感染途径很多,其中经口感染是最主要的感染途径。由于目前尚无有效的疫苗与药物防控ASF,生物安全是最主要也是最重要的措施。生物安全措施涵盖许多方面,其中饮水消毒是常用的措施之一。那么,饮水消毒对预防ASFV经口途径感染起到多大的作用?