一株鸭源H9亚型禽流感病毒的分离及鉴定

从发病雏鸭体内分离到1株具血凝活性病毒,并鉴定为H9亚型禽流感病毒。取发病鸭肺作为病毒分离病料,接种10日龄SPF鸡胚,死亡鸡胚尿囊液具血凝活性,且不能被已知鸡新城疫(ND)阳性血清、产蛋下降综合症EDS-76单克隆抗体、禽流感H5亚型阳性血清抑制,但能被禽流感H9亚型阳性血清抑制,血凝抑制价为211。该毒株经中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室鉴定为H9N2亚型。对分离株进行的研究结果表明,该毒株为低致病力毒株,其ICPI为0.26,IVPI为0。用第三代鸡胚尿囊液原液0.5 m l静脉注射8日龄樱桃谷鸭,雏鸭死亡率达50%。     

H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

从临床表现呼吸困难并伴有啰音、肺部和支气管黄色干酪样栓塞为特征的病鸡肝脾肺混合匀浆中分离到1株病毒（YD株）,该病毒能凝集鸡红细胞并能被AIVH9标准阳性血清抑制,对热不稳定且对热敏感;对鸡胚和番鸭胚的最小致死量分别为10^-7和10^-6,其MDT分别为78h和70h;鸡胚尿囊液毒的HA效价和EID50明显高于番鸭胚尿囊液毒;能扩增出大小约为1027bp的特异性目的片段。结果表明．该分离毒为H9亚型禽流感病毒。     

肉鸽H9亚型禽流感的诊断与病毒分离及鉴定

通过分子PCR检测,初步证明在湖北一发病肉鸽群感染H9亚型禽流感病毒。病原分离后,盲传3代,其血凝效价达到109~1011,经生物学特性进行测定,其鸡胚半数致死量为107.5,9日龄鸡胚平均致死时间为54.3 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数为1.8,6周龄小鸡静脉接种致病指数为2.0,证明该H9亚型禽流感为毒力较强。将该病毒回归非免疫肉鸽,能产生典型的H9亚型禽流感症状,采集其肺、喉头、泄殖腔等病变组织进行病毒分离,均可分离到H9亚型AIV。     

一株鸭源H9亚型禽流感病毒分离株生物学特性研究

对分离到的1株鸭源H9N2亚型禽流感病毒(NJ01株)的生物学特性进行了研究。研究结果显示:其静脉致病指数IVPI为0,脑内致病指数ICPI为0.26,血凝解脱时间NHAT为慢,血凝热稳定时间HOT为30 m in。以108.0ELD50/羽的剂量静脉感染26日龄非免疫鸭,可使40%鸭致死,且从攻毒后存活鸭1 d+2 d喉拭子中100%分离到该病毒;而以相同剂量静脉感染1月龄SPF鸡后不出现死亡,但攻毒后4~6 d的泄殖腔拭子中,均可100%再分离到该病毒。毒株血凝素基因的RT-PCR试验结果显示,与1997年香港3个分离株的同源性为94.8%~96.0%,其HA裂解位点处氨基酸序列为-RSSRG-。研究结果表明该NJ01株为低致病性禽流感病毒,属欧亚大陆分支,在SPF鸡及非免疫鸭体内均能很好地复制。     

H9N2亚型禽流感病毒株的分离和鉴定

用非免疫鸡胚从病死鸡的脑组织中分离到禽流感病毒。此病毒能凝集鸡红细胞,而且这种凝集可以被特异性抗血清所抑制。通过对分离株进行血清学试验、最小致死量致死鸡胚平均死亡时间测定、鸡致病力试验、回归试验,证明该分离株为H9N2亚型禽流感病毒。     

鹌鹑H9亚型禽流感病毒的分离鉴定

2009年从湖北省某鹌鹑(Coturnix coturnix Linnaeus)饲养场送检的成年产蛋病死鹌鹑的肺、脑等实质器官中,分离到一株低致病力的禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV),经AIV-PCR检测、血清中和试验、AIVHA-HI试验、ND-HI试验,证明分离的AIV为H9亚型。人工感染30日龄鹌鹑做毒力测定,结果为低致病力毒株,该毒株自然感染能引起1%～3%的成年鹌鹑死亡。     

H9亚型禽流感病毒NJ01株动物回归试验前后生物学特性比较

将鸭源H9亚型禽流感毒株NJ01在SPF鸡胚上所传第四代（E4）,经静脉注射回归8日龄非免疫樱桃谷鸭,取死亡鸭肺组织作为病毒重分离材料,接种SPF鸡胚,收获24～96h死亡鸡胚尿囊液,混合为F1,取F1,按上述方法再次进行回归试验并分离病毒,收获的病毒液记为F2,取E4、F1及F2病毒液,对其生物学特性进行了比较研究。研究结果表明：F2较E4对鸡胚的敏感性增强,其MDT／MLD值减小,对44日龄非免疫樱桃谷鸭静脉攻击的感染性增强,以10^8.5ELD50／羽的剂量攻毒后1d＋2d喉拭子的病毒重分离阳性率由3／5增至4／5。     

禽流感病毒H5和H9亚型RT-PCR检测方法的建立

根据H5和H9亚型的HA基因,设计合成2对特异性引物,分别建立了RT-PCR检测方法,优化了反应体系及反应条件,该方法敏感性可达10^-3,特异性好,与NFV、IBV与H5与H9相互间无交叉反应。利用所建立的RT-PCR检测了10份活禽及禽产品中存在的H5和H9亚型禽流感病毒,其检测结果与病毒的分离培养一致,比电镜和琼扩的检出率高30％,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应,证明该方法具有很好的应用价值。     

禽流感H11N9亚型病毒东方白鹳分离株的基因特征

根据已知禽流感病毒(AIV)的8个基因序列设计合成12对特异引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,分别成功扩增出分离于东方白鹳(Ciconia boyciana)的1株H11N9亚型禽流感病毒的全基因序列,将其分别克隆到pMD18-T载体后进行序列测定。同时将8个基因片段与GenBank发表的相应序列进行比较,绘制各基因的进化树。结果表明:所克隆到的8个片段均包含相应病毒基因的完整开放阅读框架,长度分别为2280、2274、2151、1692、1497、1413、759、838bp核苷酸,分别编码759、757、716、563、498、470、252/97、230/121个氨基酸。该毒株HA有7个潜在糖基化位点;在HA裂解位点序列为PAIASR↓GLFG,无连续的多个碱性氨基酸插入,具有典型的低致病性禽流感病毒特征。根据该毒株与参考毒株的序列比较分析结果推测,该分离株可能是不同亚型禽流感病毒通过互相基因交换所形成的基因重组体。     

一株鸭源H9亚型禽流感病毒在鸡胚上传代及繁殖规律的研究

对一株从发病鸭体内分离到的H9亚型禽流感病毒株[A/Duck/NanJing/1/1999(H9N2),简称NJ01]进行了传代及繁殖规律的研究。将其在10日龄SPF鸡胚上传至15代,测定血凝价及平均死亡时间。取第3 (E3)、5(E5)、10(E10)、15(E15)代次的毒种稀释至不同浓度,接种10日龄、11日龄SPF鸡胚及非免疫鸡胚,对收获毒液量及血凝价(HA)、病毒含量(ELD_(50))进行比较。同时对接种10~(-4)稀释的第3代毒种死亡鸡胚各组织所含病毒的HA进行测定。结果显示,NJ01株经传代其平均死亡时间为53～64 h,HA为9～11 log_2;E3、E5、E10、E15毒种的ELD_(50)分别为10~(8．83)/0．1 ml、10~(9.0)/0．1 ml、10~(8.33)/0．1 ml、10~(8.32)/0．1 ml;将E3毒种稀释至10~3、10~4、10~5倍接种鸡胚,对病毒繁殖收获量有一定的影响,平均死亡时间延长,经10~(-4)稀释后接种11日龄SPF鸡胚的病毒繁殖效果最好;死亡鸡胚以尿囊液和尿囊膜所含病毒的HA最高,达9～10 log_2,肝、肺及其他组织HA较低,为1～5 log_2。     

SPF种蛋重量对H9亚型禽流感病毒分离培养的影响

[目的]探索SPF种蛋重量对病毒分离培养的影响。[方法]以蛋形正常稍重(62～72 g)的SPF种蛋为试验组,适宜重量(50～60g)SPF种蛋为对照组,进行H9亚型禽流感病毒的分离培养试验。[结果]试验组和对照组SPF种蛋的受精率无明显差异,而且尿囊液的HA和HI效价无明显差异。[结论]在实验室可选用稍重的SPF种蛋进行病毒分离培养,既可充分利用SPF种蛋资源,又可节省试验经费。     

左旋咪唑影响流感灭活疫苗（H9N2）抗体滴度

为了研究不同剂量的左旋咪唑对鸡流感病疫苗免疫效果的影响,将20只17日龄雏鸡,随机分成A、B、C、D四组,每组5只.分别皮下注射H9N2灭活疫苗0.5ml/羽,同时给试验组A(0.6mg)、B(0.3 mg)、C(0.15 mg)剂量的左旋咪唑,D组注射生理盐水作为对照.免疫后0、7、14、21和28天,翅下静脉采血检测抗H9N2亚型禽流感病毒抗体滴度.结果表明,给药组的抗体水平都明显高于对照组;不同给药剂量的组别的抗体水平也存在差别,0.6 mg、0.3 mg剂量组鸡只平均抗体水平基本一致,却明显低于0.15 mg的低剂量组.这表明左旋咪唑影响H9N2流感病毒疫苗抗体滴度,低剂量(0.15 mg)添加左旋咪唑,可提高疫苗的抗体水平.     

禽多杀性巴氏杆菌、H9亚型禽流感二联灭活疫苗研制及免疫效力试验

采用鸡胚共同增殖禽多杀性巴氏杆菌和H9亚型禽流感病毒的方法制备的抗原中含巴氏杆菌数≥4×1010CFU/mL、H9亚型禽流感病毒含量≥109.38EID50/mL,经灭活后制备3批二联灭活疫苗并进行了相关检验。结果表明,所研制的3批二联疫苗的物理性状、无菌检验以及安全检验均符合相关质量标准;用3批疫苗分别免疫试验鸡和试验鸭,21 d后对禽多杀性巴氏杆菌免疫保护率均为90%以上,对H9亚型禽流感免疫保护率均为85%以上。     

鸭H9亚型禽流感油乳剂灭活疫苗的免疫原性

对从发病雏鸭体内分离到的H9亚型禽流感病毒NJ01株[A/Duck/Nan jing/01/1999(H9N2)]进行了免疫原性研究。以含有108.0ELD50和108.5ELD50的NJ01进行静脉注射攻击无H9亚型禽流感抗体的26日龄、44日龄和140日龄鸭,结果显示,对小于44日龄和大于44日龄鸭分别以108.0ELD50和108.5ELD50病毒含量的NJ01株静脉攻击,攻毒后1~2 d的喉拭子病毒分离率均为80%以上。将病毒含量为107.9ELD50的NJ01株油乳剂灭活苗,肌肉途径免疫8日龄和28日龄鸭,在免疫后的第7 d、14 d和21 d用含108.0ELD50和108.5ELD50的NJ01静脉注射攻击,攻毒后取1~2 d喉拭子进行病毒重分离,结果表明,免疫后7 d产生抗体,14 d产生坚强免疫力,21 d相对保护率达100%。     

两种免疫增强剂对肉鸡H9N2禽流感病毒感染的保护试验

[目的]研究囊素肽和中草药添加剂——抗感康对肉鸡预防H9N2禽流感病毒感染的保护效果。[方法]选择120羽1日龄AA鸡,随机分为3组,即中草药组、囊素肽组和对照组,40只/组。中草药组从1日龄起饲喂添加有0.1%抗感康的混合饲料;囊素组在13日龄时颈部皮下注射囊素肽0.4ml;对照组在13日龄颈部皮下注射0.85%灭菌生理盐水0.4ml,并观察鸡的临床表现。在1、7、18、27、35和45日龄时,记录采食量和体重,计算试验各阶段和全期平均日增重、采食量和料重比。[结果]囊素肽和抗感康能阻止H9N2禽流感病毒的水平传播,提高肉鸡抵抗力,并显著提高鸡的生产性能（P〈0.05）。[结论]囊素肽和抗感康能明显增强鸡的免疫力并提高鸡的生产性能。     

H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法建立

【目的】2013年3月,中国国家卫生和计划生育委员会宣布在上海、安徽地区发现了人感染H7N9亚型流感病毒事件,由于这种新型重组H7N9流感病毒未曾有过感染人或者动物的报道,因此出现了一系列亟待解决的问题,引起了全世界范围的广泛关注。根据H7N9亚型禽流感病毒 HA和NA核苷酸序列,设计并合成靶基因为HA和NA的2对引物,建立快速检测H7N9亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR检测方法。【方法】根据测序结果,用DNAStar生物软件进行同源性分析比较,选出H7和N9基因中高度保守且特异的核苷酸区域,用oligo6.0软件设计针对H7和N9基因的引物。用Trizol LS提取RNA,采用一步法Access RT-PCR扩增反应液,建立了一步法检测H7N9亚型禽流感病毒RT-PCR 方法。以H7N9亚型流感病毒为阳性对照,其他亚型流感病毒以及新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊等其他禽病病原作为阴性对照,按所建立的反应体系和反应程序进行RT-PCR反应,验证所建立方法的特异性。对病毒含量为 10^6.5 EID₅₀·mL^-1 的 H7N9 亚型禽流感病毒尿囊液依次进行 10 倍倍比稀释,提取RNA用RT-PCR 方法检测,评价其敏感性。另外,采取双盲试验用荧光定量RT-PCR对该方法进行了比对验证。【结果】用H7亚型特异性引物检测 H1-H15 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原,除H7亚型流感病毒外,其他样品均为阴性;用N9亚型特异性引物检测N1-N9 亚型禽流感病毒和其他禽病病原,仅当前流行的H7N9 亚型 AIV 样品有特异性目的条带,与其他N1-N9 亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他禽病病原均无交叉反应。通过对 H7N9亚型禽流感病毒尿囊液进行10倍倍比稀释检测,证实该方法最低检出量为 1.4×10^2.5 EID₅₀·mL^-1,并可以从阳性棉拭子浸出液中扩增出目的基因片段。【结论】该RT-PCR 方法具有特异性强和准确率高的特点,可以作为H7N9亚型AIV核酸检测的一种有效候选方法。     

检测H9亚型AIV的压电免疫传感器研究(英文)

[目的]研制检测H9亚型禽流感病毒的压电免疫传感器。[方法]用巯基丙酸在镀银电极石英晶体自组装巯基丙酸单分子膜再通过N-乙基-N'-(3-二甲氨基)丙基碳化二亚胺盐酸(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)偶联抗H9亚型禽流感病毒的特异性单抗构建传感器芯片,建立可以检测H9N2亚型禽流感病毒的免疫传感器。[结果]该方法具有较好的特异性,不与H5亚型流感病毒和新城疫病毒(NDV)反应,检测灵敏度达到20～100个EID50。[结论]该结果为检测禽流感病毒免疫传感器的进一步深入研究奠定了基础,这为其他相关病毒的监测提供了一种新途径。