3-1E/mChIL-15融合基因构建及在真核细胞中的表达

将鸡堆形艾美尔球虫(E.acervulina)子孢子和裂殖子表面抗原3-1E基因片段与鸡白细胞介素15成熟蛋白基因片段(mChIL15)通过四个柔性氨基酸SPGS连接,构建并鉴定真核表达质粒pcDNA3.1/3-1E-linker-mChIL-15。表达质粒纯化后应用磷酸钙法体外转染293T细胞,通过间接免疫荧光和免疫组织化学方法对重组质粒的体外瞬时表达进行检测。结果表明,成功构建了融合基因3-1E-linker-mChIL-15,转染后30h可检测到融合基因编码的融合蛋白在293T细胞中的瞬时表达。研究为鸡艾美尔球虫基因工程疫苗进一步研制及应用奠定了基础。     

pGEX-4T-1-cMC4R原核表达载体的构建与表达

[目的]构建犬MC4R基因编码区的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。[方法]以Beagle犬基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的片段,利用LP Recco PCR克隆技术将目的片段直接重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coliDH5α,筛选阳性克隆,BamHI、XhoI酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R转化到E.co-liBL21内,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE检测犬MC4R蛋白的表达。[结果]成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R,经DNA测序证实插入序列与设计基本一致,只有777位碱基T变成了C,这是由于犬MC4R编码区存在的多态性引起,对表达的犬MC4R蛋白序列无影响。大肠杆菌诱导后表达出犬MC4R融合性蛋白。[结论]成功构建犬MC4R原核表达载体,此重组体能在E.coliBL21内表达犬MC4R融合蛋白,为进一步获取犬MC4R的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究犬MC4R蛋白的结构和生理功能提供帮助。     

过表达H3K9me3 去甲基化酶对猪克隆胚胎体外发育效率的影响

为了探索过表达组蛋白H3K9me3去甲基化酶KDM4B/KDM4D对猪克隆胚胎体外发育效率的影响,研究构建了鼠源KDM4B/KDM4D表达载体,通过体外转录获得KDM4B/KDM4D mRNA并将其分别显微注射至猪克隆胚胎。结果显示两组注射的克隆胚胎的H3K9me3水平、卵裂率和囊胚率与对照克隆胚胎无显著差异,但两组注射的克隆胚胎的H3K9me3去甲基化酶表达水平显著高于无注射的对照克隆胚胎,且注射KDM4B mRNA的克隆胚胎的囊胚细胞数显著高于注射KDM4D mRNA的克隆胚胎及对照克隆胚胎,表明过表达组蛋白H3K9me3去甲基化酶KDM4B可以显著提高猪克隆胚胎的体外发育效率。     

人IL-1Ra基因的克隆及原核表达的研究

IL-1Ra是第一个被发现的天然存在的细胞因子拮抗剂,结合于IL-1受体后不引起IL-1效应。文章通过RT-PCR从人的胎盘组织中克隆了人IL-1Ra基因,使其在大肠杆菌DH5α中重组表达。结果表明,克隆到了460bp左右的目的基因,并在大肠杆菌中成功表达了18ku左右的目的蛋白,目的蛋白在大肠杆菌中表达量占总蛋白20%左右,为IL-1Ra的进一步研究及应用奠定了基础。     

父源性印记基因在牛早期胚胎中的表达

【目的】研究父源印记基因在牛早期胚胎中的表达模式。【方法】利用Real-time PCR技术,检测Gnas、Grb10和Xist这3个父源性印记基因在牛体外受精（In vitro Fertilization,IVF）和孤雌激活（Parthenogenetic Activation,PA）胚胎各发育阶段的表达情况。【结果】对于IVF和PA两种来源的牛胚胎,Gnas在胚胎各发育阶段的表达没有明显差异;Grb10在2细胞阶段的PA胚胎中的表达量明显高于在IVF胚胎的,但从4细胞阶段到囊胚阶段,Grb10在两种来源的牛胚胎中表达没有明显差异;从2细胞阶段到8细胞阶段,Xist在两种来源的牛胚胎中表达没有明显差异,但从16细胞期开始,Xist在PA胚胎中的表达明显高于IVF胚胎的表达量。【结论】对于牛IVF胚胎和PA胚胎,Gnas、Grb10和Xist从2细胞期到囊胚期都可以检测到表达,但表达模式不同。这3个父源性印记基因在牛胚胎发育过程中可能发挥着重要的作用。     

H3K4和H3K9三甲基化在猪体外成熟卵母细胞和克隆胚胎中的表达分析

该研究主要运用单细胞免疫荧光技术分析猪卵母细胞和克隆胚胎发育过程中,H3K4和H3K9三甲基化(H3K4me3,H3K9me3)的表达情况.收集体外成熟0h,6h,12h,24h,30h,36h,42h的猪卵母细胞;同时通过体细胞核移植操作获得一细胞、四细胞、桑葚胚和囊胚期克隆胚胎,经过免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察H3K4me3和H3K9me3修饰在卵母细胞和胚胎中的变化情况.免疫荧光结果显示,在不同减数分裂阶段的猪卵母细胞内均能观察到H3K4me3的表达,并且呈现出逐渐下降的趋势;在生发泡期(GV),生发泡晚期(L-GV)和生发泡破裂(GVBD)阶段的卵母细胞中能发现明显的H3K9me3表达,随着减数分裂的进行,H3K9me3表达消失,在第一次减数分裂中期前阶段(Pre-MI)到第二次减数分裂中期(MⅡ)阶段卵母细胞中未发现H3K9me3荧光信号.H3K4me3和H3K9me3在不同发育阶段的猪克隆胚胎中都有表达,其中H3K4me3在不同阶段胚胎中荧光信号强度相近,H3K9me3在四细胞胚胎中荧光强度降低,在桑葚胚和囊胚中荧光强度出现升高的趋势.以上结果说明,H3K4me3参与调控猪卵母细胞体外成熟的整个过程,H3K4me3和H3K9me3在猪体细胞核移植胚胎早期发育过程中可能具有调控作用.     

呼肠孤病毒3型S1基因在Sf9昆虫细胞中的表达

利用杆状病毒表达系统对呼肠孤病毒3型S1在Sf9昆虫细胞中进行表达,为研究Reo-3σ1蛋白功能及建立呼肠孤病毒3型血清学诊断方法奠定基础。采用PCR方法扩增全长为1 416bp的Reo-3S1基因,将其插入杆状病毒转座载体pFastBacHTA,构建的重组质粒pFastBacHTA-S1再转化到DH10Bac感受态细胞中,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-S1,用脂质体介导法转染昆虫细胞获得重组病毒rBS。免疫荧光法（IFA）和western-blotting检测结果表明,S1基因在Sf9昆虫细胞中表达出约为50 kD的重组蛋白,且具有免疫原性。这是国内首次通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达出了具有免疫原性的Reo-3σ1蛋白,为进一步研究单克隆抗体的制备和血清学抗体水平检测研究奠定了基础。     

人IL-1Rα基因的克隆及原核表达的研究

IL-1Ra是第一个被发现的天然存在的细胞因子拮抗剂,结合于IL-1受体后不引起IL-1效应.文章通过RT-PCR从人的胎盘组织中克隆了人IL-1Ra基因,使其在大肠杆菌DH5α中重组表达.结果表明,克隆到了460bp左右的目的基因,并在大肠杆菌中成功表达了18 ku左右的目的蛋白,目的蛋白在大肠杆菌中表达量占总蛋白2...     

αV,β3整合素在绵羊体外受精胚胎的表达模式研究

[目的]探讨胚胎附植调控因子αV,β3整合素在绵羊早期体外胚胎的表达情况,为早期胚胎发育及附植调控机理提供理论依据.[方法]采用RT-PCR和间接免疫荧光染色技术,检测绵羊体外受精个发育阶段胚胎中αV及β3整合素mRNA的表达模式及蛋白表达定位情况.[结果]在绵羊2-细胞至桑椹胚体外胚胎中未能检测到整合素αV及β3 mRNA的表达,但可以检测到囊胚期胚胎有微量整合素αV及β3 mRNA的表达.并且在绵羊第7d扩张囊胚和第8d孵化囊胚上均可检测到整合素αVβ3蛋白的表达,且蛋白表达主要分布在胚胎滋养层细胞周围,孵化囊胚蛋白表达量略高于扩张囊胚.[结论]αV,β3整合素在绵羊早期胚胎发育及附植过程中具有重要调控作用.     

IL-1β及其受体在雌牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中的表达定位

为探索正常生理条件下IL-1β和IL1R1参与雌性牦牛生殖调控及早期胚胎发育的生物学作用,试验采集雌性牦牛主要生殖器官(卵泡期:输卵管、卵巢、子宫;黄体期:输卵管、卵巢、子宫;妊娠期:输卵管、卵巢、子宫),并生产孤雌激活胚胎。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测IL-1β和IL1R1 mRNA在组织和胚胎发育过程中的表达;并采用蛋白质免疫印迹(Western-blot,WB)和免疫组织化学方法从蛋白水平分析IL-1β和IL1R1在各生殖器官的表达水平与定位。结果显示IL-1β和IL1R1在牦牛主要生殖器官和孤雌激活胚胎中均有表达。其中卵泡期输卵管中IL-1β和IL1R1表达均高于黄体期和妊娠期,卵泡期卵巢和妊娠期卵巢中IL-1β和IL1R1的表达高于黄体期,妊娠期子宫中IL-1β和IL1R1的表达高于卵泡期和黄体期,孤雌激活胚胎中IL-1β和IL1R1的表达桑椹胚最高,8细胞次之,2细胞和囊胚期最低。免疫组织化学结果显示IL-1β和IL1R1在输卵管黏膜上皮、卵泡颗粒层、黄体细胞、子宫上皮和子宫腺体均有表达。研究结果表明IL-1β和IL1R1参与牦牛生殖周期和胚胎发育的调控作用,为进一步探究IL-1β和IL1R1的作用机制提供了理论基础,有助于牦牛胚胎体外培养技术的改进。     

人类饲养层及无血清培养体系培养人类胚胎生殖细胞研究

使用人类胚胎皮肤成纤维细胞(hESF)作饲养层,以血清替代物及一些细胞因子作无血清培养基,培养人类胚胎生殖(hEG)细胞。结果显示,在该培养体系下,人类胚胎生殖细胞能够存活、增殖,并表现出干细胞特有的形态学特征,具有很高的碱性磷酸酶(AP)活性,在体外能够保持未分化状态50 d左右。接种hEG细胞后,该体系能够比以前的人类胚胎生殖细胞培养体系形成更多的集落,并且这些集落AP活性维持更久。结果为人类胚胎生殖细胞的基础研究和临床应用提供了一种更为安全的培养方法。     

牛原始生殖细胞的分离与培养

从4～15周龄的牛胎儿生殖嵴中分离得到牛原始生殖细胞,以STO(一种建系的小鼠胎儿成纤维细胞)及MEF(小鼠胎儿成纤维细胞)为饲养层抑制分化培养,其中1个细胞系传至4代。研究发现,STO较MEF更有利于牛类EG细胞的分离与培养,体长小于5cm的胎儿适合牛EG细胞分离与克隆。同时观察到这些细胞在体外进行自发性分化,可形成上皮样细胞、神经样细胞和成纤维样细胞。     

山羊原始生殖细胞的分离与培养

从46例山羊胎儿中分离培养原始生殖细胞,发现胎龄在25～38d的胎儿原代培养时都可获得大量的细胞集落,适合做胚胎生殖细胞的分离培养,最高传至6代。以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)、山羊胎儿成纤维细胞(GEF)、牛胎儿成纤维细胞(BEF)为饲养层,在不添加细胞因子情况下,都可以培养出原代山羊的胚胎生殖细胞。传代结果表明,MEF的培养效果较好,但与GEF组差异不显著(P>0.05),BEF组培养效果较差(P<0.05)。以3个不同质量浓度LIF的培养液培养山羊原始生殖细胞(PGC)结果表明,在原代培养时,效果差异不显著(P>0.05);而在传代过程中,以含LIF10ng/mL组培养效果最好,但与含LIF5ng/mL组差异不显著(P>0.05),LIF1ng/mL组培养效果较差(P<0.05)。     

自原始生殖细胞分离克隆小鼠ES细胞研究初报

自交配后 9.5～ 13.5 d小鼠胎儿生殖嵴 /腺或其类似物及周围组织 ,采用与其同源胎儿成纤维细胞共培养的方式分离克隆到具小鼠 ES细胞诸多特征的胚胎生殖细胞 ( EG细胞 )系。即具有连续传代的能力 ( 1例来自交配后 11.5 d胎儿类 ES细胞传至 10代 ) ,部分细胞集落呈典型鸟巢状结构 ,AP染色呈阳性 ,体外分化或延迟传代、堆叠培养具有分化形成类胚体、上皮细胞、成纤维细胞或神经细胞等的能力。同样培养交配后 7.5～ 8.5 d和14.5～ 15 .5 d的小鼠胎儿 ,原代观察到类 ES细胞集落 ,继代培养未观察到类 ES细胞集落 ,16 .5～ 18.5 d小鼠胎儿原代培养未观察到 ES样细胞集落     

人类原始生殖细胞的体外培养

为了探讨人原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的体外分离培养条件及相关影响因素,以小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)作为饲养层,室温下用1．25 g／L胰蛋白酶+0．2 g／L EDTA消化人胚胎组织5～9 min,或用1 g／L胶原酶(IV型)消化20～40 min,分离得到PGCs,然后用不同培养液培养,从培养液角度较为系统的研究原代培养人原始生殖细胞的条件。结果表明,在KSR培养液(体积分数15％ Knockout serum replacement+高糖DMEM+10 ng／mL人重组白血病抑制因子(LIF)+4 ng／mL人重组碱性成纤维细胞生长因子+10 ng／mL Forskolin)和STO(建系的小鼠胚胎成纤维细胞)条件培养液中培养的原代人原始生殖细胞,有较高的克隆形成率;培养液中添加不同质量浓度的LIF对克隆形成率影响差异不大。     

山羊胚胎原始生殖细胞的分离与培养

选择受精后30～50d的关中奶山羊胎儿为材料,参照小鼠原始生殖细胞(PGCs)分离得到了山羊的PGCs,将其分别培养在STO饲养层上,或与同源山羊成纤维细胞(GEF)及山羊睾丸支持细胞(GSCs)共培养。结果表明,3种方法均能获得类EG细胞。分离得到的类EG细胞在STO饲养层上仅传4代;培养在GEF上的效果最差,传至第3代时丢失;而在GSCs上培养的效果最好,可传6代。     

表达绿色荧光蛋白的猪胚胎生殖细胞分离

以质粒DNA为增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体，对处于快速增殖期的8株猪胚胎生殖(EG)细胞(4—9代)进行转基因试验。用1μg DNA和2μL LipofecTamine 2000转染EG细胞后，共获得4株转染EGFP基因的EG细胞系(EG—EGFP)，可发出强绿色荧光；EG—EGFP细胞连续培养2周以上可分化为多种细胞类型。显微注射EG—EGFP细胞至卵裂期胚胎、桑椹胚卵周隙内或囊胚腔中，共注射135枚胚胎，其中112枚存活并发育至囊胚(83．0％)；86枚嵌合体胚培养后含有荧光细胞，其中57枚囊胚在内细胞团(ICM)上发现有EG—EGFP细胞。     

人类胚胎干细胞与小鼠囊胚嵌合的探讨

【目的】探讨人类胚胎干细胞(Human embryonic stemcells,hESCs)能否在小鼠胚胎环境中生存并参与其各个组织器官的分化,为hESCs与小鼠囊胚嵌合的可行性研究提供依据。【方法】将154枚受精后3.5 d(3.5days postcoitum,3.5 dpc)ICR品系小鼠囊胚随机分为3组:试验组(注射hESCs)、模拟注射组(注射针仅刺破透明带及滋养层细胞,但不注射细胞和溶液)及对照组(未注射),于注射后培养24 h统计囊胚完全孵化率。将稳定转染增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)的含有9~15个hESCs的小细胞团块,显微注射入3.5 dpcICR品系小鼠囊胚腔内,注射后分别于3,24,48,69,77,94和116 h,在普通荧光显微镜下观察EGFP阳性细胞的定位与动态分布情况,并将嵌合体胚胎移植入假孕母鼠子宫内,分别于移植后第4天和第6天处死孕鼠,普通荧光显微镜下观察EGFP阳性细胞在整个小鼠胚胎中的分布情况。【结果】注射后24 h,试验组和模拟注射组的囊胚完全孵化率分别为73.6%和77.1%,均极显著高于对照组(38.3%)(P<0.01),有88.9%(32/36)的胚胎中的hESCs迁移并定位在小鼠内细胞团(ICM)及其临近的滋养层细胞上;体外培养48 h后,EGFP阳性细胞数进一步减少;116 h后,只有1枚胚胎仍残留3~4个EGFP阳性细胞,且散在分布于ICM克隆之外。体内发育试验结果显示,将43枚注射后的嵌合体囊胚移植入6只代孕母鼠子宫内,获得了22枚脱膜,有17枚脱膜中含有胚胎,其中形态正常胎儿14枚,没有胚胎含有EGFP阳性细胞。【结论】hESCs很难与小鼠囊胚正常嵌合。     

pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与表达鉴定

[目的]构建pEGFP-N1-hTERT真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达。[方法]利用pC1-neo-hTERT和pEGFP-N1质粒构建重组质粒,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)片段的准确性。将pEGFP-N1-hTERT真核表达载体转染到大鼠胎儿神经干细胞(NSCs)中,通过绿色荧光蛋白间接观察人端粒酶逆转录酶蛋白在细胞中的表达定位,通过RT-PCR、WesternBlot验证所构建的真核表达质粒pEGFP-N1-hTERT的正确性。[结果]所构建的pEGFP-N1-hTERT真核表达载体结构正确并能够在真核细胞中表达。[结论]该研究为建立大鼠永生化NSCs系奠定了基础。     

Wnt3a和Activin A共同促进人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化

【目的】研究Wnt3a和Activin A在限定性内胚层诱导中共同作用的最佳时间窗。【方法】在无饲养层体系培养的人胚胎干细胞中,加入25 ng/mL Wnt3a和100 ng/mL Activin A,共同作用不同时间(1~4 d),收集不同作用时间点(0,1,2,3,4,5 d)细胞,对原条、内中胚层前体标记Brachyury及限定性内胚层标记Sox17分别进行免疫荧光染色,统计阳性细胞总数,计算阳性细胞率。以看家基因β-actin作为对照,采用RT-PCR方法对原肠作用基因(Goosecoid(GSC)、Mixl1)及三胚层发育相关基因(内胚层基因Sox17、Foxa2,内中胚层前体基因Brachyury,中胚层基因Flk-1,外胚层基因Pax6,胚外内胚层基因Sox7、CDX2)的表达进行检测。【结果】Wnt3a与Activin A共同作用1~4 d,均能获得限定性内胚层细胞,其中二者共同作用1 d分别能获得(78.9±7.3)%Brachyury阳性细胞和(85.2±3.8)%的Sox17阳性细胞。RT-PCR结果显示,在Wnt3a与Activin A共同作用下,原肠作用基因及三胚层发育相关基因表达的时间有差异。【结论】Wnt3a和Activin A共同作用1 d,是有效促进人胚胎干细胞向限定性内胚层细胞分化的最佳作用时间窗。