常用杀虫剂对菜蛾绒茧蜂的影响及毒理机制研究

田间采集试虫室内测定结果表明,敌敌畏、灭多威和杀虫双对菜蛾绒茧蜂Apanteles plutellae高毒,乙酰甲胺磷对绒茧蜂毒性较低,而氰戊菊酯、氯氰菊酯、氟虫腈、阿维菌素、定虫隆和Bt则是低毒的。菜蛾绒茧蜂AChE的Km及Vmax值分别是小菜蛾的0.22和2.08倍,AChE对敌敌畏的敏感性(K/em>i值)分别是小菜蛾的10.37倍。100 mg/L的胡椒基丁醚(PB)或磷酸三苯酯(TPP)均可使氰戊菊酯明显增效,其中PB的增效作用显著高于TPP。体内抑制实验结果表明,PB和TPP对绒茧蜂AChE活力无显著影响,低浓度(100 mg/L)的PB即可显著抑制绒茧蜂的α-NA和β-NA CarE活力,且抑制率高于TPP,TPP仅在高浓度(1 000 mg/L)时对绒茧蜂的两种CarE活力有显著抑制作用。由此推断,与小菜蛾相比,菜蛾绒茧蜂对有机磷的高敏感性与其显著较高的AChE敏感性有关;此外,多功能氧化酶的解毒代谢在菜蛾绒茧蜂对氰戊菊酯的耐药性中具重要作用。     

海芋凝集素AML的原核表达及其多克隆抗体制备

为了制备海芋凝集素(Alocasia macrorrhiza lectin,简写AML)的多克隆抗体,分别构建了AML全长及部分片段的原核表达载体,并利用获得的原核表达的AML片段免疫新西兰雄兔获得抗血清。结果表明,含AML全长的原核表达载体pET30a(+)-AMLcDNA的原核表达宿主菌株Rosetta(DE3),在加入不同浓度的诱导剂IPTG后,菌液浓度出现短暂增加后逐渐下降,且下降幅度与加入的IPTG浓度呈正相关,同时用SDS-PAGE电泳法未检测到预期融合蛋白的形成;而含AML片段的原核表达载体pET30a(+)-AMLcDNA(270-613)的原核表达宿主菌株Rosetta(DE3),在IPTG诱导下能正常生长,且能诱导出预期大小的融合蛋白。利用制备型SDS-PAGE法纯化此融合蛋白作为抗原免疫新西兰雄兔获得抗血清,用该抗血清作为一抗进行Western blot,在海芋块茎、叶、叶柄和诱导菌体中均能检测到相应分子量的AML条带,表明制备的AML多克隆抗体可以用于检测AML。     

稻瘟病菌一假定几丁质酶多克隆抗体的制备及其检测

 为检测几丁质酶的表达,制备稻瘟病菌的一假定几丁质酶多克隆抗体,探索其可能运用。将稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) 几丁质酶基因克隆入融合表达载体pET\|32a,并在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行诱导表达。表达菌株经0.5 mmol/L IPTG诱导4～6 h后,用Ni²⁺\|NTA亲和柱纯化蛋白,得到可溶的几丁质酶\|His融合蛋白。以该融合蛋白免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体。ELISA分析表明该抗体效价达1∶204 800,特异性良好。用该抗体ELISA检测了稻瘟病菌4个不同田间菌株中,不同的菌株表达量不同。对稻瘟病菌侵染水稻3、5和7d后的病叶进行抗原Western验证,结果表明,稻瘟病菌不同的侵染时间其几丁质酶表达量有明显差异。 几丁质酶表达的差异是否与菌株间致病型等生物学和生理学差异有关,目前正在进一步研究。     

桑脉带相关病毒N蛋白多克隆抗体的制备

 桑脉带相关病毒(Mulberry vein banding associated virus,MVBaV)属于番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)的新成员,是广西桑树病毒病的主要病原病毒。本研究将MVBaV核外壳蛋白(nucleocapsid protein, N protein)基因连接到pET-30a原核表达载体上,获得重组表达载体pET-30a-MVBaV-N并转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),经IPTG诱导可表达产生一个含His标签、分子量约36.0 kDa的融合蛋白。用 Ni^{2 +} -NTA树脂纯化融合蛋白,将其免疫日本大耳兔制备多克隆抗体。间接ELISA测定抗体的效价为1∶256 000。Western blot 检测结果显示,该多克隆抗体在稀释倍数1∶1 000时与细菌表达的融合N蛋白及感病桑叶中的N蛋白产生特异性识别,但不与寄主蛋白产生交叉反应,表明具有良好的特异性和较高的灵敏度。将抗体按1∶2 500稀释后进行间接ELISA,可有效检出桑叶中的MVBaV。MVBaV N蛋白抗体的成功研制,为桑脉带病毒病的诊断及MVBaV与寄主相互作用机制的研究提供了重要的试剂。     

小麦赤霉病菌α-微管蛋白原核表达及纯化研究

 为了制备小麦赤霉病菌的α-微管蛋白,以小麦赤霉病菌cDNA为模板,PCR扩增出α₁-、α₂-微管蛋白基因,将其克隆到pET30a⁺表达载体上,转化到表达宿主菌Rossatta（DE3）pLysS,筛选阳性克隆,进行蛋白诱导表达。SDS PAGE及Wes-tern-b1ot结果表明：融合蛋白主要以包涵体形式存在;融合蛋白分子量约为52.1和55.9 kD;融合蛋白能与抗6×His的单抗发生特异性反应。通过对包涵体洗涤及透析复性后采用HisTrap^TM  HP Columns对融合蛋白进行纯化,可以得到纯度较高的融合蛋白。该研究为体外筛选以微管蛋白为靶标的杀菌剂提供了物质基础。     

宁波地区小菜蛾幼虫期和蛹期寄生蜂调查

小菜蛾Plutella xylostella是十字花科蔬菜最重要的世界性害虫,保护和利用寄生性天敌是控制小菜蛾的重要手段。为有效控制小菜蛾在蔬菜上的为害,减少农药用量,作者于2007年4月至2009年1月对宁波地区小菜蛾幼虫期和蛹期主要寄生性天敌种类及其田间自然被寄生率进行了调查。结果表明,宁波地区十字花科蔬菜上小菜蛾幼虫期和蛹期共有8种原寄生蜂（菜蛾盘绒茧蜂Cotesia vestalis、螟蛉盘绒茧蜂Cotesia ruficrus、颈双缘姬蜂Diadromus col-laris、东方长颊姬蜂Macromalon orientale、棉铃虫齿唇姬蜂Campoletis chlorideae、无脊大腿小蜂Brachymeria excarinata、齿唇姬蜂Campoletissp.、弯尾姬蜂Diadegmasp.）、1种兼性寄生蜂（菜蛾啮小蜂Oomyzus sokolowskii）和5种重寄生蜂（盘背菱室姬蜂Mesochorus discitergus、粘虫广肩小蜂Eurytoma verticillata、稻灿金小蜂Trichomalopsis oryzae、绒茧灿金小蜂Trichomalopsis apanteloctena和啮小蜂Tetrastichussp.）,其中优势种为菜蛾啮小蜂和菜蛾盘绒茧蜂,分别占62.23%和31.19%,同时,小菜蛾幼虫期田间自然被寄生率普遍高于蛹期。另外,菜地蔬菜品种的多样性有利于寄生蜂的保护和利用。     

松材线虫类毒过敏原蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

 利用重叠延伸PCR基因合成法,按大肠杆菌偏爱密码子,合成松材线虫类毒过敏原蛋白基因（Bxvap2）,将其连接到原核表达载体pET-29b(+)上。获得的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,目的蛋白以可溶形式高效表达,占细菌总蛋白的33.5 %。将表达产物经Ni-NTA亲和柱纯化后进行质谱分析,结果显示纯化的蛋白为BXVAP2蛋白。用制备的BXVAP2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接ELISA测得抗体灵敏度5.4 ng·mL^-1（效价为1∶1 360 000）,为进一步研究该蛋白的组织定位及功能,明确该基因在致病过程中的作用机理奠定了基础。     

菜蛾盘绒茧蜂滞育与非滞育预蛹过氧化氢、抗氧化酶及激素水平的比较

为了研究过氧化氢与激素在菜蛾盘绒茧蜂Cotesia vestalis滞育过程中的作用,本文测定了滞育与非滞育预蛹过氧化氢的含量,3种保护酶（SOD、POD和CAT）的活性以及20E和JHⅢ的滴度,结果显示,滞育预蛹过氧化氢含量、SOD和POD活性以及20E滴度显著低于非滞育预蛹,而CAT活性与JHⅢ滴度则相反。推测高浓度的JHⅢ抑制20E的合成和释放,20E滴度的下降又通过调节SOD活性的下降和CAT活性的上升来降低过氧化氢的浓度,使菜蛾盘绒茧蜂滞育。     

猕猴桃种传潜隐病毒外壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

猕猴桃种传潜隐病毒(actinidia seed borne latent virus, ASbLV),属于乙型线状病毒科Betaflexiviridae李属病毒属Prunevirus,是一种在我国猕猴桃上广泛发生的病毒。本研究通过RT-PCR方法克隆ASbLV的外壳蛋白基因,并连接到原核表达载体pET28a(+)上,转化大肠杆菌Rosetta (DE3),经IPTG诱导后可表达分子量约为28 kD的融合蛋白。经过Ni²⁺-NTA树脂纯化融合蛋白,然后以其为抗原制备多克隆抗体。Western blot结果表明,多克隆抗体的效价为1∶4 000。该多克隆抗体只与ASbLV发生特异性反应,而不与猕猴桃病毒1、猕猴桃病毒A、苹果茎沟病毒、柑橘叶斑驳病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒发生反应,说明该多克隆抗体特异性良好。利用间接ELISA对36份猕猴桃田间样品进行了ASbLV检测,检测结果表明其中20份样品被ASbLV侵染,且间接ELISA检测结果与RT-PCR检测结果一致。本研究建立的间接ELISA方法能够有效地应用于猕猴桃田间样品中的ASbLV检测。     

樱桃病毒A北京分离物外壳蛋白的原核表达及抗血清制备

根据前期研究获得的樱桃病毒A北京分离物(Cherry virus Aisolate Beijing,CVA-BJ)外壳蛋白基因序列设计引物,将此基因克隆到原核表达载体pET-28a后转化大肠杆菌BL21(DE3),以终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导表达。Ni珠吸附法纯化表达产物后免疫家兔制备抗血清。间接ELISA测得抗血清效价为1∶2048。以纯化后的蛋白和樱桃叶片总蛋白为检测材料,Western blot分析表明抗血清具有高度特异性。间接ELISA方法检测樱桃病叶,结果呈阳性,与RT-PCR检测结果一致。表明制备的抗血清可用于感病樱桃样品中CVA的检测。     

水稻条纹病毒NS2基因原核表达产物多克隆抗体制备及受侵染水稻和灰飞虱体内NS2检测

 The NS2 gene of Rice stripe virus (RSV) was amplified by RT-PCR, cloned into pGEM-T vector and sequenced. The NS2 gene was inserted into prokaryotic expression vector pET32a to produce recombinant plasmid pET32a-NS2. The recombinant plasmid was introduced into Escherichia coli strain BL21 (DE3) pLysS. SDS-PAGE and Western blot analysis confirmed that NS2 fusion protein was expressed after induction by IPTG. The recombinant NS2 protein was purified with Ni²⁺-NTA agarose affinity chromatography and the polyclonal antibody against NS2 protein was raised in rabbit. NS2 protein was successfully detected in small brown planthopper (Laodelphax striatellus) at 1:1 600 dilution of the total protein of single planthopper and in infected rice (Oryza sativa) at 1:800 dilution of 10 mg leave by dot immunobinding assay using the polyclonal antibody.     

番茄黄化曲叶病毒V 2基因原核表达及多克隆抗体制备

 通过PCR的方法,从番茄黄化曲叶病毒江苏分离物DNA中扩增到V2基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果显示其与报道的XH2分离物序列完全一致,核苷酸序列全长351 bp,编码115个氨基酸,推测分子量约13 kD。将该V2基因亚克隆到原核表达载体PET32a中获得重组表达载体PET32a-V2,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG可诱导1个分子量约为32 kDa的融合蛋白（含His标签）表达,经Ni⁺ NTA亲和柱纯化,获得纯化的重组蛋白,免疫家兔制备TYLCV-V2蛋白的多克隆抗体Anti-V2,间接ELISA测定Anti-V2的效价达1∶655 360,Western blot及DIBA分析结果表明Anti-V2可与V2蛋白发生特异血清反应,可为进一步研究V2蛋白的功能提供参考。     

百合斑驳病毒CP与CI基因的融合表达、多抗制备及其应用

采用RT-PCR方法从甘肃地区引种的切花百合上克隆了百合斑驳病毒(Lily mottle virus,LMoV)的外壳蛋白(coatprotein,CP)基因与细胞质内含体(cytoplasmic inclusions,CI)基因的3′端600 bp片段,连接到原核表达载体pET-28a(+)上,构建了融合表达的重组质粒pET-28a-CP-CI200。重组质粒转化大肠杆菌BL21成功表达了融合蛋白CP-CI200。经镍柱亲和层析获得纯化的融合蛋白,进一步用其免疫家兔制备了多克隆抗体。Western Blot结果显示,该多抗与感染LMoV的百合叶片中的病毒CP与CI均发生特异性反应,而对健康百合叶片无反应。用该多抗建立双抗夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)检测百合叶片样品,相对于RT-PCR方法其灵敏度和特异性均达到了93.3%。研究结果为快速、准确检测百合斑驳病毒的试剂盒研制奠定了基础。     

烟草曲茎病毒AC4基因的原核表达与免疫定位

 利用PCR方法从烟草曲茎病毒(TbCSV) Y3 5分离物的病株中获得AC4基因,将其克隆到原核表达载体pET-30a上获得重组质粒pET-Y35AC4,重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3) pLysS中,IPTG诱导后SDS-PAGE发现,AC4蛋白已在大肠杆菌中获得了表达。利用Ni²⁺-NTA亲和树脂纯化了AC4重组蛋白,免疫家兔获得AC4蛋白的多克隆抗体。利用免疫胶体金技术对感病烟草中AC4蛋白进行定位发现,TbCSV AC4蛋白主要在细胞质的叶绿体和线粒体中积累。     

番茄环纹斑点病毒核壳体蛋白抗血清制备及其血清学特性分析

 番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus, TZSV)是番茄斑萎病毒属的一个新种,对云南番茄、辣椒生产造成严重危害。用RT-PCR 从感病番茄中扩增得到长度为837 bp TZSV 的核壳体蛋白基因(N 基因),将其克隆到原核表达载体pET-28a( + ),获得重组原核表达载体pET-TZSV-N,在大肠杆菌BL21 中表达,SDS-PAGE 分析表明,该载体高效表达33kDa 的融合蛋白;以纯化的融合蛋白作为抗原免疫家兔制备TZSV 核壳体蛋白(N 蛋白)的多克隆抗体,间接酶联免疫测定(ID-ELISA)表明效价为1 / 6 000;Western blot 分析表明,该抗血清能与西瓜银色斑驳病毒(WSMoV)血清组的辣椒褪绿病毒(CaCV)反应,而与番茄斑萎病毒(TSWV)、凤仙花坏死斑病毒(INSV)无血清交叉反应,说明获得的抗血清能用于WS-MoV 血清组成员的检测,TZSV 属于WSMoV 血清组成员。     

泡桐丛枝植原体pPaWBNy-1-ORF5编码蛋白的原核表达和抗体制备

 利用含泡桐丛枝植原体质粒pPaWBNy-1的3.0 kb片段的克隆为模板,PCR扩增pPaWBNy-1-ORF5的亲水性肽段编码区。目的片段连接到原核表达载体pET28a(+),重组质粒pET28a-ORF5-5转化大肠杆菌(Escherichia coli)Rosseta (DE3)感受态细胞,菌液处在对数生长期时(OD₆₀₀=0.52),添加IPTG诱导5 h后收集菌体,提取蛋白并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。用六聚组氨酸标签抗体进行Western blot检测,发现分子量约为15 kDa的含多聚组氨酸标签的目的蛋白得到表达。切胶回收融合蛋白,免疫德国大白兔以制备抗血清,间接ELISA法测定抗血清的效价约为1∶8 100。用制备的ORF5编码蛋白的抗血清进行Western blot分析,结果在带菌的介体昆虫茶翅蝽(Halyomorpha halys)中检测到大小约为17 kDa的特异蛋白条带,但在健康和感病泡桐(Paulownia sp.)及无菌茶翅蝽中均未检测到,由此推测pPaWBNy-1-ORF5蛋白与介体昆虫传播植原体有关。     

绿木霉Sm1基因的克隆、原核表达及蛋白纯化

木霉菌(Trichoderma spp.)是土壤内普遍存在的习居菌,具有多种生物防治功能,其中诱导植物免疫反应是重要的生物防治功能之一[1].木霉菌Sm1蛋白(small one protein)是从绿木霉(Trichoderma virens)中分离得到的一种低分子量、富含半胱氨酸的疏水性蛋白,属于蛋白类激发子,与Cerato-platanin基因家族有很高的同源性,具有诱导植物免疫抗性的作用[2].     

双叉犀金龟表皮蛋白Td14144表达纯化及性质研究

表皮蛋白是昆虫表皮的重要组成成份，在昆虫的生长发育过程中起着重要作用，有可能成为农业害虫的防治靶标。双叉犀金龟Trypoxylus dichotomus是铁皮石斛的一种重要害虫，且对其表皮蛋白的研究较少。本文通过研究双叉犀金龟表皮蛋白Td14144的表达纯化及与几丁质结合的相关性质明确Td14144功能的重要性。根据双叉犀金龟转录组测序数据，利用RT-PCR获得表皮蛋白Td14144基因（GenBank登录号：MZ463195），并对其进行生物信息学分析。序列分析表明表皮蛋白Td14144属于CPR家族中RR-2亚族，含有R&R保守结构域；系统进化分析结果表明，Td14144与光肩星天牛Anoplophora glabripennis的AgCP的亲缘关系最近。随后将基因片段与pET-28a载体同源重组构建表达载体pET28a-14144，在大肠杆菌Escherichia coli BL21中原核表达，并使用金属螯合层析进行分离纯化，SDS-PAGE及Western blot验证重组蛋白的表达纯化，成功获得95%以上纯度的Td14144蛋白。利用几丁质结合试验评估Td14144与不同类型几丁质结合的能力，发现Td14144可以与壳聚糖、α-几丁质、β-几丁质和胶体几丁质结合，其中对壳聚糖和α-几丁质的结合能力最强。     

李属坏死环斑病毒CP基因在大肠杆菌中的表达及其抗血清制备

本实验用RT—PCR的方法获得李属坏死环斑病毒的印基因，并将其连接到表达载体pET-22b（＋）上，得到重组质粒pET—PNRSVCP，转化大肠杆菌BL21（DE3）后，用IPTG进行诱导表达。SDSPAGE和Westernblot分析结果表明，印基因在大肠杆菌中获得了高效表达，获得的融合蛋白分子量约为29．0kDa。将该融合蛋白免疫兔子，获得PNRSV特异性抗血清。酶联法（ELISA）测定的效价为1／1024。为用血清学方法检测该病毒提供了基础条件。