有机磷降解酶及毒素解毒酶的分子改良与产品研制

针对当前已分离得到的有机磷降解酶、黄曲霉素解毒酶和N-酰化高丝氨酸内酯降解酶的缺陷与不足，以蛋白质组学和生物信息学为基础，利用基因改组、定点突变、随机突变、蛋白分子修饰等手段及蛋白质分子设计技术，结合生物信息学理论，对有机磷降解酶、黄曲霉毒素解毒酶关键氨基酸残基的分析，并通过理性设计和密码子偏好性改造等，着重对酶蛋白特性进行分子改良，     

课题名称：有机磷降解酶及毒素解毒酶的分子改良与产品研制

课题内容、目标： 针对当前已分离得到的有机磷降解酶、黄曲霉素解毒酶和N-酰化高丝氨酸内酯降解酶的缺陷,利用基因改组、定点突变、随机突变、蛋白质分子修饰等手段及蛋白质分子设计技术,着重对酶蛋白特性进行分子改良,筛选出具有更加优良特性的蛋白质分子,建立酶蛋白的分子改良和修饰技术的方法体系。进一步构建高效重组生物反应器,研究改良酶的高效发酵技术和酶的后加工技术,实现产业化廉价生产。     

解毒酶对小白菜中有机磷农药降解作用的研究

采用浸泡法，研究了解毒酶对有机磷农药马拉硫磷、对硫磷、甲基对硫磷等在小白菜降解作用。结果表明，该解毒酶对此类农药有较好的降解作用，反应时间短，降解效率高。     

基因工程技术在黄曲霉毒素生物降解中的应用

黄曲霉毒素具有强致癌性、致突变性和致畸性,影响动物生产性能,降低饲料转化效率,减少产肉量、产蛋量和产奶量,增加动物发病率和死亡率,给畜牧业造成巨大的经济损失。另外,黄曲霉毒素通过肉、蛋、奶食物链传递给人类,严重威胁人类健康。因此,黄曲霉毒素的防控已经成为全球性高度关注的问题。目前,饲料中黄曲霉毒素的脱毒方法主要采用物理吸附,如蒙脱石、活性炭、酵母细胞壁等,但物理吸附仅是吸附了黄曲霉毒素,并不能减少毒素的量,最终饲料中被吸附的毒素在体内解吸附后排出体外,可造成环境的二次污染。另外吸附剂效果不稳定,可能会吸附饲料中的维生素等营养物质,造成饲料品质下降。其中,生物降解法具有解毒彻底、专一性强,不影响饲料的营养价值且能够避免毒素的重新产生等优点,从而备受研究者的关注。目前,有越来越多的研究报道了真菌、细菌及其代谢产生的酶能够降解黄曲霉毒素,而鲜有关于降解黄曲霉毒素重组酶的报道。基因工程技术在黄曲霉毒素生物降解中的运用,可采用现代分子生物学的方法,从复合解毒酶中分离纯化出特定的蛋白。但因微生物降解酶分离纯化过程复杂、酶活不稳定、酶作用条件苛刻,较难用于实际生产。因此,人们利用基因工程手段将活性高的解毒酶基因进行基因克隆,实现降解酶基因在原核或真核工程菌种的异源高效表达,为酶制剂在降解霉菌毒素的实际生产中作用研究奠定了理论基础。文章就基因工程技术在黄曲霉毒素降解中的运用研究进展及未来发展方向进行综述,为饲料和食品中霉菌毒素生物降解酶的运用提供理论基础和实践依据。     

降解黄曲霉毒素B_1菌株的筛选及毒素降解酶的分离

为了筛选具有降解黄曲霉毒素B_1(AFB_1)作用的菌株,并分离纯化高效AFB_1降解酶,以AFB_1作为降解AFB_1菌株生长的能源和碳源进行初筛,将初筛得到的菌株接种于含有AFB_1的培养基中,选择降解率最高的菌株进行固体发酵培养后提取粗酶液,通过硫酸铵分级沉淀和葡聚糖凝胶对降解AFB_1的活性物质进行分离,SDS-PAGE蛋白质电泳检测降解酶蛋白质分子质量大小,并通过酶联免疫法测定不同分子质量的酶蛋白对AFB_1的降解率,26S rDNA和同源序列分析对降解率最高的菌株进行菌种鉴定。结果显示,降解AFB_1能力最高的菌株为Y8,降解率为77.05%,凝胶层析分离出的31.7 ku的酶蛋白对AFB_1的降解率达54.33%;菌种鉴定结果表明,真菌Y8为米曲霉。综上,筛选的米曲霉Y8能够高效降解AFB_1,可有效缓解黄曲霉毒素对畜禽的危害,具有提高养殖效益的潜在应用价值。     

酶联免疫吸附法检测大米中黄曲酶毒素B1初报

黄曲霉毒素是常见霉菌黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物。由于其具有极强的毒性、致癌性以及在自然界中存在的普遍性，已成为各国食品安全严格限量的指标。我国大米安全质量国家标准对黄曲霉毒素的含量限制为小于10ppb。目前检测黄曲霉毒素的方法有薄层层析法、液相色谱法、酶联免疫吸附法。其中薄层层析法的样品处理繁琐，且分析时间长；液相色谱法则仪器昂贵，技术要求高；而酶联免疫吸附法具有灵敏度高、分析时间短的优点，能提高检测效率，适应社会需求。为此，本站开展了应用酶联免疫吸附法检测大米中黄曲酶毒素B1的方法测试。     

有机磷农药降解酶的研究进展

有机磷农药污染严重,利用有机磷农药降解酶是治理有机磷农药残留的新技术,综述了有机磷农药降解酶的作用机理、基因、应用等方面的研究现状。     

黏细菌降解黄曲霉毒素B_1的产酶条件优化

本研究对一株具有降解黄曲霉毒素B1活性的黏细菌的产酶条件进行了优化。通过单因素实验和正交实验得到最优化的培养基以及培养条件。优化后的培养基为:酵母粉7 g/L、CaCl2.2H2O为1 g/L、MgSO4.7H2O为0.5 g/L、VB12为750μg/L;并确定其最佳培养条件为:初始pH 7.5、接种量20%、发酵时间50 h、发酵温度30℃。在上述最佳培养基和最佳发酵条件下,该菌株降解黄曲霉毒素B1的能力为78.2%。     

二氧化硅纳米花固定化酶及其有机磷农药降解性能

有机磷农药在蔬菜、水果及土壤中的残留严重影响了环境和人类的身体健康。有机磷水解酶(organophosphate pesticides, OPH)能高效降解有机磷类化合物残留，利用具有开放孔道的二氧化硅纳米花固定有机磷水解酶，可以优化固定化条件，固定化OPH的最适温度为45℃,最适pH值为8,与游离OPH相比，在温度为35～55℃、pH值为7.5～9.0的范围内均能保持较高的催化活性。与游离有机磷水解酶相比，固定化有机磷水解酶具有更好的热稳定性、pH值稳定性和重复使用性。研究结果表明，固定化酶在保证降解效率的同时，可有效降低有机磷水解酶的使用成本，是一种具有发展前景的固定化酶降解有机磷农药技术。     

黑曲霉有机磷农药降解酶的纯化及其性质

采用细胞破碎、硫酸铵分级沉淀和Sephadex G-75凝胶过滤的方法,对黑曲霉(Aspergillus niger)J6产生的有机磷农药降解酶进行分离和纯化,并对其酶学性质进行研究。结果显示:黑曲霉J6有机磷农药降解酶定位在细胞膜上,其分子量为66 000。该降解酶最适pH值为7.0,最适反应温度为70℃,Fe3+、Cu2+、Li+、Zn2+、Mg2+、NaN3、EDTA、SDS、PSMF对该降解酶有不同程度的激活作用,而Mn2+对其有轻微的抑制作用,Ca2+和Triton对其有强烈的抑制作用。     

微生物降解有机磷农药的研究进展

综述有机磷农药降解微生物的种类、降解机理及代谢途径、有机磷降解酶、降解酶基因克隆与表达等研究现状,并探讨有机磷农药微生物降解的发展趋势。     

微生物降解黄曲霉毒素的研究进展

黄曲霉毒素是一组由黄曲霉、寄生曲霉等多种真菌产生的次级代谢产物,具有强烈的毒性,可以引起动物肝脏肿大、病变甚至癌变,对人和家畜的健康产生极大的威胁。运用安全、高效的微生物方法降解黄曲霉毒素是目前黄曲霉毒素研究的热点。文章对黄曲霉毒素的一般特性、污染现状以及微生物方法降解黄曲霉毒素的机理和应用现状等进行综述。     

与花生黄曲霉抗性相关的几丁质酶基因的克隆与分析

以高抗黄曲霉花生品种J11为试验材料,用黄曲霉毒素诱导的花生叶片和种子RNA为模板,经反转录及PCR反应得到几丁质酶的部分序列;以未做诱导处理的花生作为对照,经反转录及PCR反应未获得特异性的条带。将花生几丁质酶基因的核苷酸序列与GenBank数据库进行核苷酸同源性比较分析,发现与已报道的花生几丁质酶核苷酸相似性较低,推测该基因为一新基因。研究结果同时表明:该花生几丁质酶基因所表达的蛋白是一种诱导酶,与花生对黄曲霉毒素的抗性有关。     

有机磷降解酶在烟草中的高效表达研究

有机磷化合物在农业生产中作为杀虫剂被广泛使用,在使用的同时也造成大面积的污染.本研究在烟草中表达细菌来源的有机磷降解酶基因ophc2,将有机磷降解酶分泌到植物体外,希望通过植物根系降解环境中的农药残留.构建了植物表达载体,包含CaMV 35S启动子序列、extensin序列、有机磷降解酶编码基因ophc2和nos终止子序列,命名为pBI-E-opphc2.胡萝卜extensin 基因的信号肽序列引导ophc2基因表达产物分泌到胞外.经过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草（Nicotiana tabacum cv. Xanthi）,共获得101株转化植株,PCR检测证实有80株含有目的基因片段.从80株中随机挑选60株经western杂交检测,有24株呈阳性.酶活性测定实验结果表明,转基因植株可以释放有机磷降解酶到培养基中,并且具有有机磷水解酶活性.对于转基因植物降解培养介质中和吸入植株中的有机磷农药的实际效果将在以后报道.     

地黄纤维素合酶基因的克隆与生物信息学分析

根据以前克隆的地黄Rgh BNG基因碱基序列,利用Primer Premier 5.0设计特异引物,采用hi TAIL-PCR技术从怀地黄基因组DNA中扩增出578 bp DNA片段。经生物信息学分析发现,它与根癌土壤杆菌、土壤杆菌的纤维素合酶基因的同源性达81%~91%;它所含的453 bp的开放阅读框(ORF)编码蛋白质的氨基酸序列与根癌土壤杆菌、土壤杆菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌纤维素合酶基因编码蛋白质氨基酸序列的同源性高达83%~99%,说明蛋白质可能具有纤维素合酶的结构域。用hi TAIL-PCR技术克隆怀地黄纤维素合酶基因,为进一步研究其分子作用机制和在地黄分子育种中的应用奠定了基础。     

木霉菌REMI突变菌株在降解敌敌畏中的作用

本研究对木霉菌T30野生株和限制性内切酶介导的DNA整合技术(REMI)构建的突变株进行降解敌敌畏能力和最佳条件的研究。结果表明,野生株和几个REMI突变株均能降解有机磷农药敌敌畏,但以突变株TK-3降解活性最高,其降解效率达98％。TK-3突变株降解有机磷农药效率取决于葡萄糖剂量、敌敌畏初始浓度、初始pH等。突变株降解敌敌畏的葡萄糖最佳浓度为1 000 μg/mL,最适pH为7.0,敌敌畏浓度500 μg/mL。敌敌畏浓度超过1 000 μg/mL则会抑制木霉菌降解能力。     

密码子优化的重组黄曲霉毒素解毒酶（rADTZ）在毕氏酵母中组成型分泌表达的研究

黄曲霉毒素解毒酶（ADTZ）来源于真菌Armillariellatabescens，它能够有效地分解黄曲霉毒素。为了使重组蛋白rADTZ能在毕氏酵母中高效分泌表达，根据毕氏酵母密码子的偏好性对rADTZ的5’末端的编码区域进行了优化，利用two-stepDNAsynthsis技术合成出ADTZ优化的基因序列OPT-ADTZ，并与组成型表达载体pGAPZaA连接，构建重组质粒pNOA，线性化pNOA后转化至毕氏酵母GS115中，实现了密码子优化的rADTZ组成型分泌表达。     

JSO18菌有机磷农药降解酶的纯化

实验对一株能高效降解几种有机磷农药菌株JSO18的降解酶进行分离和纯化。经分析该降解酶主要位于细胞间质，最适盐析硫酸铵饱和度为60％～70％，粗酶液经硫酸铵沉淀、Sephade。G-100凝胶过滤和DEAE-52柱层析得到较高纯度的酶液。通过PAGE和SDS—PAGE电泳测定该酶分子量约为37KDa．N末端16个氨基酸残基测序的结果为：GAPFQNDVPPACYRFR。     

微生物和酶在烟叶发酵中的应用

生物技术尤其是酶解和微生物发酵技术在烟草中的应用研究，已成为当前科技工作者关注的热点。其研究内容包括利用某些有益的优势增香菌种对烟叶进行发酵，以增加烟叶香气，缩短发酵时间；用蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等处理低等级烟叶、烟丝或烟梗，以降解叶中的蛋白质、纤维素、淀粉等生物大分子，减少烟叶燃烧是产生的蛋白臭气和辛辣刺激性，提高低次烟的工业可用性等。文章对目前国内外有关微生物和酶在烟草发酵中应用的研究进展作一简要综述。     

酶/蛋白质与土壤组分界面作用的研究进展

矿物、有机质等是土壤重要的固相组分,它们构成了土壤活性界面,调制着土壤中重金属、有机污染物、生物大分子等的迁移转化及生物可给性。土壤酶/蛋白质多吸附于土壤有机质、矿物、有机质-矿物复合物上。综述了酶/蛋白质在界面上的吸附机制及其主要影响因素,分析了吸附态酶/蛋白质生物活性、构象的变化,以及构象变化与生物活性的内在关联性,总结了酶/蛋白质与界面作用的主要研究手段,并对分子模拟技术对酶/蛋白质与土壤界面的作用过程与机制、固定化酶作为降解有机污染物的环境材料进行了展望。