ALV-J和REV诱导雏鸡腔上囊细胞凋亡试验

禽白血病/肉瘤病毒群可引起禽类的多种肿瘤性疾病[1].1988年英国的Payne及其同事又从肉用型鸡群中分离得到了一株新的白血病病毒,命名为J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J, ALV-J).该亚型主要感染肉鸡,可使肉仔鸡早期发生白血病,并可造成免疫抑制[2].     

蛋种鸡ALV-J与REV共感染病变新特点

2009年8月,山西榆次某鸡场蛋种鸡群产蛋量急剧下降,部分鸡产蛋停止.病理组织学观察发现,病鸡肝脏、肾脏、肺脏、心肌等组织中出现小灶状淋巴细胞瘤,肿瘤细胞为成熟的淋巴细胞;聚合酶链式反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和间接免疫荧光(IFA)检测显示,被检鸡ALV-J感染率为8/8,而且7/8为病毒血症,与REV共感染率为2/8,未出现REV单感染;从发病情况看,淋巴细胞瘤均出现于共感染病例,特别是ALV-J病毒血症的共感染鸡病变最为严重,但未见ALV-J的特征性髓细胞瘤.囊膜蛋白氨基酸同源性分析显示,ALV-J毒株与英国HPRS-103原型株同源性最高(96.9％以上),共感染的REV毒株与suv-env株同源性最高(93.8％).本病例揭示,先天传播的ALV-J引起的病毒血症状态可能为REV的致瘤创造了环境,使临床罕见的REV淋巴瘤早于髓细胞瘤出现,因此,严格种鸡群的ALV-J净化是防控此病的重中之重.对于ALV-J与REV协同的机制还需进一步研究.     

REV和ALV-J共感染鸡病毒血症及抗体反应的相互影响

为了研究禽网状内皮增生病痛毒（REV）、禽J亚群白血病病毒（ALV—J）共感染时对彼此病毒血症及抗体反应的影响，2日龄SPF鸡分别接种REV、ALV—J或同时2种病毒造成共感染，对各感染组7周内的病毒血症及抗体反应进行动态检测。相对于单一感染，共感染时，2种病毒的病毒血症水平动态均无明显变化。在单独感染ALV—J后5周有30％（5／16）的鸡产生抗体，而有REV共感染时，没有鸡产生针对ALV—J的抗体（o／16），表明REV感染可明显抑制鸡体对ALV—J抗体的反应，而REV与ALV—J共感染对REV抗体反应无明显影响。     

鸡感染REV和ALV-J后血清指标动态变化的研究

研究禽网状内皮组织增生症病毒(REV)、禽J亚群白血病病毒(ALV-J)感染及混合感染引起血清指标动态变化与鸡群体重抑制的关系.3组1日龄哈伯德父母代肉种鸡,分别接种REV、LV-J和REV与ALV-J.定期称量体重,采外周静脉血,通过生化自动分析仪检测鸡血清中总蛋白(TP)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)的动态变化.结果表明,前7周,血清学指标TP、TG、LDL-c浓度变化与生长抑制的变化呈现相关性,随体重的增加,TP、TG、LDL-c浓度有上升的趋势,HDL-c、CHO浓度变化与体重的变化无相关性.因此,检测7周内的血清TP、TG、LDL-c浓度的动态变化与鸡群体重抑制的关系可作为这两种肿瘤性疾病早期诊断的依据.     

J亚群禽白血病病毒与禽网状内皮增生症病毒共感染对肉鸡生长和免疫功能的抑制作用

1日龄肉鸡感染J亚群禽白血病病毒(ALV—J)以及共感染禽网状内皮增生症病毒(REV)后，肉鸡生长发育明显受阻，体重增重明显下降(P＜0．05)，法氏囊、胸腺明显萎缩(P＜0．05)，在用新城疫疫苗免疫后，感染组血清中新城疫抗体效价显著低于对照组(P＜0．05)；在ALV—J和REV共感染后，这种抑制作用更为明显(P＜0．01)。ALV—J单独感染后，鸡对传染性法氏囊病病毒(IBDV)弱毒疫苗免疫后的抗体反应与对照组没有明显差别，但ALV—J与REV的共感染可明显延缓鸡对IBDV弱毒疫苗免疫的抗体反应。     

从病鸡肿瘤组织中同时检测出网状内皮组织增生症病毒(REV)和J亚群禽白血病病毒(ALV-J)

禽网状内皮组织增殖病病毒（reticuendotheliosis virus,REV）是禽网状内皮组织增殖病的病原,属反转录病毒科中C型致肿瘤病毒类的一种.该病毒主要侵害火鸡,但也能引起鸡、鸭等禽类以淋巴-网状组织增生为特征的肿瘤性的病理综合征[1～2].REV基因组两端的长末端重复序列（LTR）非常保守,同源性在94%以上[4].通过PCR方法,特异性地扩增REV LTR序列常被用作检测REV存在的方法[4～6].     

从J亚群禽白血病肿瘤中检测出禽网状内皮组织增生症病毒

将表现为典型 J亚群禽白血病肿瘤的病料分别接种于鸡胚成纤维细胞和 DF1细胞 ,采用间接荧光抗体试验(IFA)和 PCR方法 ,从这些肿瘤病料中分离和鉴定出 8株 J亚群禽白血病病毒 (AL V- J)。对证明感染了 AL V- J的细胞继续培养 ,并用禽网状内皮组织增生症病毒 (REV)的特异性单抗及引物做 IFA和 PCR,在 8株 AL V- J中 ,有 3株AL V- J的感染细胞中同时有 REV感染。由此表明 ,发生肿瘤的肉鸡中 ,AL V- J和 REV的共感染已相当普遍。将这 3株 REV- SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和 SD0 10 2的 3′- L TR用 PCR扩增、克隆和序列比较 ,发现分离的 SD0 0 0 3、SD0 0 0 4和SD0 10 2与国内的另外 2株 REV- SD990 1和 HA990 1的同源性为 96 .7%和 96 .1% ;而与另 1株 REV参考株鸭脾坏死性病毒 (SNV)的同源性高达 99%。     

我国部分地区蛋鸡群ALV-J及与REV、MDV、CAV混合感染检测

为了解J亚群禽白血病病毒(ALV-J)及其与禽网状内皮细胞增生症病毒(REV)、马立克氏病病毒(MDV)和鸡传染性贫血病病毒(CAV)的混合感染现象,本研究从宁夏、湖北、广东、山东、辽宁、吉林、黑龙江7个省的39个蛋鸡群收集临床表现和剖检病理变化疑似禽白血病的病料样品184份,采用PCR、病毒分离和IFA检测样品中ALV-J、REV、MDV和CAV。结果表明,7个省蛋鸡场均存在ALV-J感染,病料样品阳性率为60.9%,检测鸡群阳性率为82.1%,与REV、MDV、CAV的混合感染率分别为13.6%、24.5%、22.8%,其中存在较为严重的双重感染(29.0%)和3重感染(18.8%),甚至4重感染(1.7%)。研究结果表明,我国蛋鸡群中普遍存在ALV-J感染,而且与REV、MDV、CAV混合感染严重;提示ALV-J已经可以引起蛋鸡群发病,在临床诊断和致病性研究中,应考虑到多重感染的影响。     

四川地区商品代蛋鸡REV、ALV-J感染情况调查

禽网状内皮增生症病毒(REV)和J亚群禽白血病病毒(ALV-J)是引起免疫抑制疾病中最常见的两种病毒.REV日可诱发慢性肿瘤,ALV-J能造成血瘤、肿瘤.但它们在感染鸡群中更多呈业临床感染,并诱发一些非特异性的并发症或免疫抑制,造成禽流感、新城疫等的免疫失败[1].正是由于其呈亚临床感染,无症状往往被养殖户忽视,引起巨大的经济损失.     

禽白血病病毒J亚群(ALV-J)免疫抑制特性研究

本研究人工接种1日龄及7日龄SPF雏鸡禽白血病病毒J亚群(ALV-J),模拟先天感染及早期感染,检测ALV-J不同感染时间对机体的影响。对感染鸡体质量、免疫器官质量、组织病理学、血细胞、CD4+及CD8+T淋巴细胞进行了检测。结果发现,ALV-J对免疫器官抑制显著,尤其是中枢免疫器官,1日龄感染组的抑制程度显著高于7日龄感染组。免疫器官的抑制是产生体质量抑制的根源。病理学观察发现,1日龄感染组中枢免疫器官淋巴细胞流失严重,间质结缔组织明显增生;而7日龄感染组在3周前表现为免疫细胞增殖,在3周以后淋巴细胞逐渐坏死流失,其他器官主要表现炎性浸润及出血,未见肿瘤增生灶。血细胞检测发现,ALV-J感染组粒细胞、淋巴细胞和红细胞均有下降,但对粒细胞的影响更加明显,1日龄感染鸡更为严重。对胸腺和脾脏CD4+及CD8+T淋巴细胞检测发现,CD4+细胞数量明显下降,而CD8+细胞数量明显升高,说明机体的免疫抑制和这两种细胞的变化高度相关。无论是1日龄还7日龄感染,均在4周龄时达到免疫抑制最低值,因此可以确定ALV-J感染在体内潜伏期约为3～4周的时间。ALV-J造成机体免疫力极其低下,为肿瘤的形成及混合感染创造了条件。     

鸡感染J亚群禽白血病病毒的免疫抑制机理

通过人工接种建立了雏鸡感染J亚群禽白血病病毒（ALV-J）后发生免疫抑制的病理模型。对免疫抑制的机理进行了初步研究。结果表明：ALV-J感染早期可诱导胸腺、法氏囊的淋巴细胞凋亡，这种早期的淋巴细胞凋亡是胸腺和法氏囊萎缩的重要原因之一。病理组织学动态观察表明。ALV-J主要引起骨髓的髓系细胞灶状或弥漫性增生，病变导致骨髓机能受损，使机体免疫机能下降。是引起免疫抑制的根本原因。病毒感染组免疫器官均发生了严重的实质萎缩性病变．这种病变的发生除与骨髓的病变及淋巴细胞凋亡有关外。还与中后期淋巴细胞的坏死有关．从而导致严重的免疫抑制。ALV-J感染可引起免疫器官及部分内脏器官中嗜酸性粒细胞样的瘤细胞浸润增生，这可以作为病毒感染早期的病理诊断指标。     

J亚群白血病的病理学观察及PCR诊断

从某肉种鸡场取疑似J亚群白血病的自然发病鸡，剖检，观察病理学特征(光镜、电镜)。随后对该场进行ALV-J抗体ELISA检测，发现感染率达28％，从中选取部分抗体阳性鸡及阴性鸡剖检，取肝进行ALV-J特异性PCR检测。结果：自然发病鸡病变明显，在肝、脾、肾、睾丸(卵巢)肺等多种组织肿大，并有大小不等的灰白色结节。镜检：病灶内及肿瘤主要由密集的髓细胞组成，在大脑、小脑坐骨神经中未见。电镜，肿块中的髓细胞样瘤细胞呈圆形、核圆形或椭圆形，体积大小不一、染色质边集，胞浆中溶酶体增多，有些电子密度较高，有些趋于溶解，肝细胞体积增大，核浓缩或淡染，胞浆中线粒体增多，肿胀，嵴减少或消失，在胞浆膜下有病毒粒子存在。PCR结果：6例抗体阳性鸡和部分自然病例PCR阳性而2只对照鸡PCR阴性。通过以上证据可知，病变明显的和抗体阳性的鸡PCR结果全部为阳性，证明鸡体内病毒与抗体共存，而抗体阴性，病毒阳性的结果未出现，说明此肉种鸡场感染的ALV-J大部分是由于水平传播造成的。     

IMC10200株ALV-J实验诱发禽骨髓性白血病的研究

对分离自肉种鸡群亚临床感染的J亚群禽白血病病毒IMC1o200株进行了实验感染诱发禽骨髓性白血病的病理学研究.IMC10200株J亚群禽白血病病毒尿囊腔接种11日龄肉鸡胚和SPF蛋鸡胚,孵出后跟踪观察.9周龄时随机抽检感染鸡,感染肉鸡特异引物PCR检测全部为阳性;组织病理学观察感染鸡无明显病变.至21周龄时感染肉鸡出现第一例典型骨髓性白血病病例;感染SPF蛋鸡未见明显J亚群禽白血病相关病变.     

用ALV-J gp85单克隆抗体证明蛋鸡存在J亚群禽白血病

采用免疫组化法，对病理学初步诊断为蛋用型鸡J亚群白血病的自然发病鸡的肿瘤、骨髓、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、心脏、胰脏、输卵管、卵巢、腺胃、骨骼肌、大脑、坐骨神经，用特异性抗J亚群禽白血病病毒(ALV—J)囊膜糖蛋白gp85的单克隆抗体进行检测，待检的组织切片中均检出阳性抗原，免疫组化的研究结果与病理学诊断结果相一致。在国内外首次发现并报道蛋用型鸡J亚群禽白血病的自然病例。     

J亚型禽白血病病毒的拯救与鉴定

为鉴定含J亚群禽白血病病毒(ALV-J)全长cDNA分子克隆(pBlALV)的感染性,首先将pBlALV转染CEF细胞,拯救出病毒(rALV),然后连续传代3次,对拯救病毒进行增殖培养.分别利用RT-PCR、western blot、IFA等方法,对拯救病毒进行鉴定,并应用实时荧光定量PCR方法对拯救病毒的复制动力学进行了测定.研究结果证明,本研究成功拯救出了具有感染性的rALV-J,为研究禽白血病的致病机理和探讨新的防制措施等提供了良好的ALV的反向遗传操作技术平台.