威宁绵羊SOCS7和GFAP基因组织表达研究

试验旨在检测细胞因子信号传导抑制蛋白7（suppressor of cytokine signaling 7，SOCS7）和胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）基因在威宁绵羊不同组织中的表达水平。以6月龄、1周岁和2周岁的威宁绵羊公、母羊为研究对象，采用实时荧光定量PCR测定威宁绵羊不同性别及不同生长阶段心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及脑6个组织中SOCS7和GFAP基因的相对表达量，从mRNA水平上的探究两个基因之间的表达规律。结果显示，SOCS7基因在威宁绵羊不同组织中均有不同程度的表达，其中脾脏中相对表达量最高，其次是肺脏、肾脏、心脏、肝脏和脑组织，随着威宁绵羊年龄的增大，SOCS7基因在组织中的相对表达量呈现小幅度上升的趋势；GFAP基因在威宁绵羊脑组织中相对表达量最高，其余组织中表达量较低，随着年龄增长总体呈现下降趋势。从性别差异来看，威宁绵羊SOCS7基因相对表达量母羊普遍高于公羊，而GFAP基因则是公羊普遍高于母羊，推测SOCS7基因很有可能负向调控GFAP基因的表达。     

实时荧光定量PCR检测PrP基因在金黄地鼠脑组织的动态表达

金黄地鼠是研究动物传染性海绵状脑病的理想模型动物之一,其脑组织内朊蛋白基因动态表达数据的测定对探讨该类疾病的发生、发展和分子致病机理具有重要意义。我们利用实时荧光定量RT-PCR技术,对不同年龄金黄地鼠大脑、小脑、丘脑和脑干PrP基因的表达进行了定量。结果发现,脑的四个检测部位都呈现高的表达量,但是同一年龄段不同组织每纳克总RNA中朊蛋白基因的表达量和每毫克组织中朊蛋白基因的表达量有显著的差别,不同组织在不同年龄出现表达高峰。本研究的结果对于探讨朊蛋白的基本功能和脑组织在传染性海绵状脑病病理发生中的作用,提供了基础数据。     

猪PAANCR组织表达谱分析及其对脂质生成的影响

前期通过高通量测序比较去势和非去势猪皮下脂肪长链非编码RNA （long non-coding RNA，lncRNA）的表达差异，筛选到一个表达差异极显著的novel lncRNA——PAANCR，本试验旨在研究PAANCR在猪育肥不同阶段不同组织中的表达规律及其与脂质生成的关系。选用10头健康长×大二元杂交仔猪，在90和210 d各随机选取3头屠宰取样，使用实时荧光定量PCR方法检测PAANCR的表达谱，同时在3T3-L1细胞中使用siRNA干扰PAANCR的同源体lncRNA_{B130024G19Rik}，通过油红O染色和实时荧光定量PCR分析其对脂肪沉积的作用。结果发现，PAANCR具有明显的组织特异性和发育特异性，其在肺脏、子宫、脾脏、肾脏和脂肪组织中表达量较高，而在肝脏、小肠和脑中的表达量随着年龄增长而增加，在肌肉组织中几乎不表达。同时，通过siRNA介导的干扰能够显著抑制PAANCR同源体的表达量，PAANCR同源体表达量降低后，关键成脂分化和脂质沉积调控基因表达量也随之减少。提示PAANCR可以作为调控猪脂质生成的候选因子，对于深入研究lncRNA参与调控猪脂质生成的分子机制具有重要意义。     

STING基因荧光定量检测方法的建立及其在鸭组织中的分布

根据鸭STING基因预测序列,设计了2对特异性引物,通过试验条件摸索,首次建立了基于SYBR Green荧光定量PCR检测鸭STING基因方法,并使用该方法对STING在鸭不同组织中的含量进行检测。结果:本研究建立的检测方法,能检测低至4.8×10~3拷贝数/μL的样品;其标准曲线线性范围是3.5×10~(-5)~0.27 ng/μL,具有良好的重复性。组织分布研究发现,STING在腺胃中表达量最高,在气管、肺脏和小肠中表达量较高,在脾、肾、法氏囊、肌胃、肝、盲肠呈中等表达,在肌肉和皮肤中表达量最低。本研究成功建立了鸭STING基因的荧光定量PCR检测方法,为深入研究STING基因在鸭抗病毒感染中的作用奠定了基础。     

赤水乌骨鸡ExFABP基因序列生物信息学及组织表达分析

本研究旨在对赤水乌骨鸡的ExFABP基因编码区（Coding Sequence,CDS）序列进行测序及生物信息学分析，检测其在不同组织中的表达，探究ExFABP对赤水乌骨鸡肉质性能的影响。运用RT-PCR对赤水乌骨鸡ExFABP基因的编码区序列进行扩增测序，并对其氨基酸序列进行生物学特性分析，构建物种进化树揭示亲缘关系，同时通过实时荧光定量PCR检测了赤水乌骨鸡不同组织中ExFABP的差异表达情况。结果显示，赤水乌骨鸡ExFABP基因编码区长537 bp，编码178个氨基酸。赤水乌骨鸡ExFABP编码氨基酸序列与原鸡的同源性最高，达到100%。系统进化树分析表明，赤水乌骨鸡与原鸡的亲缘关系最近。ExFABP基因在各组织中均有表达，在肺脏中的表达量最高，显著高于其他组织，在胸肌中的表达量最低。研究结果为进一步研究改善赤水乌骨鸡肉品质、风味提供基础材料。     

马身猪和大白猪不同组织DECR1基因的表达

旨在研究DECR1基因在猪不同组织和品种中mRNA和蛋白水平的表达规律,探讨该基因与脂肪代谢的关系。以山西马身猪与大白猪为试验材料,提取肝脏、心脏、肾脏、脾脏、肺脏、胃、小肠、皮下脂肪和背最长肌组织的总RNA和总蛋白,应用实时荧光定量PCR技术检测DECR1基因在2个品种各组织中mRNA的相对表达量,采用Western blot技术对各组织中DECR1蛋白进行半定量分析。实时荧光定量PCR结果显示:DECR1基因在各组织中均有表达,组织之间的表达量存在极显著差异(P<0.01),DECR1基因在肝脏、皮下脂肪与心脏中为高丰度表达;在不同品种的皮下脂肪组织中,大白猪DECR1的mRNA表达极显著高于马身猪(P<0.01)。Western blot检测结果显示:DECR1在各组织中均有表达,不同组织的表达量存在极显著差异(P<0.01),在皮下脂肪、肝脏与小肠中高表达;不同品种的皮下脂肪组织中,大白猪DECR1蛋白的表达显著高于马身猪(P<0.05)。猪DECR1基因在不同组织的表达差异可能与脂肪代谢和脂肪沉积有关。     

HSP27在牦牛不同组织器官中的表达差异分析

本试验旨在探究正常生理条件下牦牛热休克蛋白27基因（HSP27）在雄性牦牛心、肝、脾、肺和肾5种脏器中的表达差异。试验采用普通聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-q PCR）检测HSP27基因在雄性牦牛组织器官样本中的表达情况。结果表明，HSP27基因在雄性牦牛5种脏器样本中均有表达，并存在表达差异，在肾脏中的表达量占试验总表达量的比例最低，在脾脏和肺脏中的表达量占试验总表达量的比例较低（分别为肾脏表达量的4倍和7倍），在肝脏中的表达量占试验总表达量的比例较高（为肾脏表达量的95倍），在心脏中的表达量占试验总表达量的比例最高（为肾脏表达量的96倍）。通过对HSP27基因在牦牛不同组织器官中的表达差异分析，推测其表达差异性可能与牦牛生活环境有密不可分的关系，为进一步探索牦牛在高原低氧高寒环境下机体内HSP27基因在其生长发育过程中发挥的作用提供了理论依据。     

牦牛HOXA1基因的时空表达及其对机体调控机制的研究

试验旨在获得牦牛HOXA1基因序列并进行生物信息学分析,同时分析其组织表达谱和时序表达谱,为进一步研究多脊椎骨形成的原因及其机制奠定基础。通过RT-PCR技术克隆多脊椎骨牦牛HOXA1基因,利用半定量RT-PCR技术检测该基因在多脊椎骨牦牛组织中的表达情况,利用实时荧光定量PCR技术检测该基因在多脊椎骨牦牛不同发育时期各组织中的表达情况。RT-PCR结果表明,多脊椎骨牦牛HOXA1基因序列全长为885 bp,其中开放阅读框（ORF）为870 bp,编码290个氨基酸。同源性分析表明,牦牛与普通牛、野牦牛、人、野猪、马、家鼠、黑猩猩、原鸡和野猪的同源性为75.4%～98.1%。组织表达分析表明,HOXA1基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、肌肉、胃、卵巢、子宫、输卵管、乳腺、睾丸中均有不同程度的表达;时序表达分析表明,随着年龄的增长HOXA1基因在多数组织中的表达量呈逐渐升高趋势。     

从江香猪和大白猪不同组织中GYS1、GYS2基因表达水平的研究

旨在研究糖原合成酶(GS)基因mRNA在从江香猪和大白猪表达情况,探究肌肉类型糖原合成酶(GYS1)和肝脏类型糖原合成酶(GYS2)基因表达规律。以大白猪和从江香猪为试验动物,分别提取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、大肠、小肠、背最长肌、脂肪10个组织的总RNA,设计各自实时荧光定量引物,以猪GAPDH基因作为内参基因,应用实时定量PCR技术检测GYS1和GYS2基因不同组织中mRNA的相对表达量。结果发现:GYS1基因在大白猪和从江香猪所检测的组织中均有表达,在背最长肌中的表达量最高,且在大白猪背最长肌中表达量显著高于从江香猪(P0.05);GYS2基因在肝脏中表达量最高,其他组织中几乎不表达,具有肝脏组织特异性,且发现在从江香猪肝脏中表达量显著低于大白猪(P0.05)。本研究为GYS1和GYS2基因后续真核表达的研究提供了理论依据。     

实时荧光定量RT-PCR检测犬乳腺肿瘤血管内皮生长因子(VEGF)基因方法的建立及初步应用

为了准确地分析血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）在犬乳腺肿瘤形成过程中的作用,试验设计了针对犬VEGF基因的特异性引物,提取乳腺肿瘤组织RNA并扩增出目的片段,将PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体,经质粒PCR扩增、酶切和测序鉴定重组质粒,构建标准曲线等,成功建立了乳腺肿瘤VEGF基因实时荧光定量PCR检测方法。运用实时荧光定量PCR检测了40例不同的犬乳腺肿瘤病例、2例正常乳腺组织。结果发现：在犬恶性乳腺肿瘤组织中,VEGF基因表达量明显高于良性乳腺肿瘤和正常乳腺组织（P〈0.001）;在伴有淋巴结转移的犬乳腺癌组织中,VEGF基因表达量明显高于没有发现转移的乳腺癌组织（P〈0.01）,但VEGF基因的表达量与肿瘤的大小和发病动物年龄无关（P〉0.05）。VEGF基因在犬乳腺癌组织中的表达量远高于其在正常乳腺和良性乳腺肿瘤组织中的表达,且与淋巴结是否发生转移相关。因此,VEGF可作为犬乳腺癌转移、复发的预测指标之一。     

Quantification of ovine and bovine calpain I, calpain II, and calpastatin mRNA by ribonuclease protection assay.

We developed a ribonuclease protection assay (RPA) to quantify the mRNA mass of calpastatin and the catalytic subunits of calpains I and II in ovine and bovine tissues. The method is based on constructing standard curves using predetermined amounts of in vitro synthesized sense cRNA of the calpain system, hybridized with excess radiolabeled antisense counterprobes. This is possible because the vectors used for riboprobe preparation can be used to transcribe the sense cRNA required to generate the standard curves to quantify absolute calpain I, calpain II, and calpastatin mRNA levels. We used the RPA to study calpain I, calpain II, and calpastatin gene expression in ovine liver, heart, and skeletal muscle. The results revealed that calpain II gene expression was similar in the three tissues. However, the expression of calpain I and calpastatin genes indicates that each tissue has its unique pattern. We also analyzed the activity of calpain I, calpain II, and calpastatin by the conventional DEAE chromatographic method for comparison. The results indicated that the RPA is more repeatable than the DEAE method. Special features of the RPA as compared with DEAE chromatography are as follows; 1) the RPA is a reliable method for quantifying the expression of calpains in all tissues because it is not affected by the presence of inhibitors or activators, 2) the RPA method can be expanded to analyze the expression of the tissue-specific calpains simply by designing specific probes for them, and 3) the RPA requires a small amount of tissue. The described method will facilitate future studies on the gene expression of calpains and will contribute to determining their physiological functions.     

文昌鸡GnRHR基因在不同组织中差异表达的研究

采用半定量RT-PCR方法检测文昌鸡处于性腺轴(下丘脑-垂体-性腺)的不同组织中GnRHR基因的表达水平,结果表明:GnRHR基因mRNA表达于鸡的3种组织--下丘脑、垂体和卵巢;GnRHR mRNA在3种组织中的表达量不同:下丘脑和垂体中表达量较高,卵巢中表达量较弱.     

Effects of Diets with Different Energy and Protein Levels on mRNA Expression of Glucose Transporters in Tan Sheep

This experiment was conducted to study the effects of the diets with different energy and protein levels on mRNA expression of glucose transporters in the small intestine and muscle of Tan sheep. A total of 112 healthy Tan sheep (half male and half female) with similar initial live weight were randomly divided into four groups with four replicates per group and seven sheep per replicate. According to the Feeding Standard of Meat-producing Sheep and Goats (NY/T 816—2004),each group was fed diet with different levels of energy and protein respectively:0.84×standard level (group Ⅰ),0.96×standard level (group Ⅱ),1.08×standard level (group Ⅲ) and 1.20×standard level (group Ⅳ). The test period were divided into two stages by body weight of sheep (29-35 and 36-40 kg). At the end of each stage,one sheep was slaughtered at each replicate,and small intestine and muscle samples were collected to study mRNA relative expression of SGLT1,GLUT4 and GLUT5 genes by Real-time PCR. The results indicated that:SGLT1 gene mRNA expression levels of group Ⅲ was significantly higher than other groups in small intestine at the end of 29-35 kg stage (P< 0.05);At the end of 36-40 kg stage,the SGLT1 gene mRNA expression levels had no significant difference among the four groups (P> 0.05).In muscle,the SGLT1 gene mRNA expression level increased with the rise of energy and protein levels at both stages ,and that of group Ⅳ were the highest.In small intestine,at the end of 29-35 kg stage,the GLUT4 gene mRNA expression levels had no significant difference among the four groups (P> 0.05);At the end of 36-40 kg stage,the GLUT4 gene mRNA expression level increased with the rise of energy and protein levels,and that of group Ⅳ were significantly higher than the other groups (P< 0.05).In muscle,the GLUT4 gene mRNA expression level were the highest in group Ⅳ at both stages,and significantly higher than group Ⅰ (P< 0.05). The GLUT5 gene mRNA expression did not show any regularity at both stages. In conclusion,diets with different levels of energy and protein could significantly affect the mRNA expression of SGLT1 and GLUT4 genes,and affect absorption of glucose in sheep.     

荧光定量PCR法检测副溶血弧菌tdh基因的表达差异

以pvuA为内标基因,运用实时荧光定量PCR检测不同来源以及不同应激条件下副溶血弧菌热稳定直接溶血素基因tdh的表达量。pvuA和tdh基因的荧光定量PCR融解曲线分析表明,两者均为特异性扩增。尽管相同来源的不同菌株间tdh表达量存在显著差异,副溶血弧菌临床分离株的tdh mRNA平均表达量显著高于海产品分离株((57.2比13.8)。在pH4.0、0.5%和8%NaCl应激条件下,临床株ZJ2和海产品分离株FJ14A的tdh mRNA表达量显著高于对照组;另一海产品分离株KP34在8%NaCl条件下的表达量显著提高,而低pH应激时tdh mRNA的表达量显著降低。结果表明,不同副溶血弧菌分离株的tdh mRNA表达差异显著,临床分离株的tdh mRNA表达量总体上高于海产品分离株,副溶血弧菌在不同应激条件下主要表现为tdh mRNA表达上调。     

日粮能量及蛋白质水平对滩羊糖类转运载体mRNA表达的影响

试验旨在研究日粮能量及蛋白质水平对滩羊小肠和肌肉组织中主要糖类转运载体mRNA表达的影响。选取112只健康、体重相近的滩羊（公、母各半）,随机分为4组,每组4个重复,每个重复7只羊。参考肉羊饲养标准（NY/T 816-2004）,分别饲喂不同能量及蛋白质水平日粮,即0.84×标准水平（Ⅰ组）、0.96×标准水平（Ⅱ组）、1.08×标准水平（Ⅲ组）和1.20×标准水平（Ⅳ组）。试验分两个阶段（29~35和36~40 kg）,于每个阶段末,每个重复屠宰1只试验羊,取其小肠和肌肉组织样,运用实时荧光定量PCR技术,研究SGLT1、GLUT4、GLUT5基因mRNA的表达量变化。结果显示,在29~35 kg阶段末,Ⅲ组小肠中SGLT1基因mRNA的表达量最高,显著高于其他组（P< 0.05）,在36~40 kg阶段末各组间无显著差异（P> 0.05）,各组肌肉中SGLT1基因mRNA的表达量在两个阶段都随着能量及蛋白质水平的提高而增加,Ⅳ组均最高;在29~35 kg阶段末,各组间小肠中GLUT4基因mRNA表达量无显著差异（P> 0.05）,而在36~40 kg阶段末,GLUT4基因mRNA的表达量随着能量及蛋白质水平的提高而增加,Ⅳ组显著高于其他组（P< 0.05）,在肌肉中,Ⅳ组GLUT4基因mRNA在两个阶段末表达量均最高,均显著高于Ⅰ组（P< 0.05）;在两个试验阶段,GLUT5基因mRNA的表达量无规律性。综上所述,日粮能量及蛋白质水平会影响滩羊小肠和肌肉中SGLT1、GLUT4基因mRNA的表达量,从而影响机体对葡萄糖的消化吸收。     

Reference genes for canine skin when using quantitative real-time PCR

Quantitative real-time PCR (qPCR) facilitates the quantification of mRNA expression. Accurate qPCR analysis of gene expression requires the normalisation of data using a reference or housekeeping gene which is expressed at a similar level in all tissues tested. GAPDH is the most well known and most widely used reference gene but many papers have demonstrated that it is not stably expressed in different tissues. The aim of this study was to measure reference gene stability in canine skin using real-time qPCR. Skin samples from healthy control dogs (n=7) and dogs with atopic dermatitis (lesional skin n=7 and non-lesional skin n=7) were used to quantify seven reference genes (IMP, CG14980, S7, HIRA, GAPDH, RPL13A and SDHA) in canine whole skin. Three different statistical programs (Bestkeeper, GeNorm and Normfinder) were used to assess the stability of the reference genes. The results confirmed that GAPDH is not a stably expressed reference gene in canine skin; this finding may influence interpretation of previous qPCR studies on canine skin using this as a reference gene. RPL13A and CG14980 were found to be the most stably expressed genes in canine whole skin and would be more suitable as reference genes in future studies.     

Determination of MDR1 gene expression for prediction of chemotherapy tolerance and treatment outcome in dogs with lymphoma

The multidrug resistance gene 1(MDR1) expression levels were analysed in 27 dogs with different types of malignant lymphomas receiving a standard chemotherapy protocol. Blood samples were used for MDR1 real‐time PCR expression analysis. Treatment tolerance and outcome were evaluated on a regular basis by clinical examination and client questioning. Dogs developing severe adverse effects under treatment showed significantly lower basal MDR1 gene expression levels when compared with those who tolerated the drugs well. In the longitudinal MDR1 gene expression analysis during treatment, four dogs showed a greater than two‐fold MDR1 up‐regulation, compared to baseline expression. All four of these dogs, but none of the others, showed disease progression. In conclusion, basal and follow‐up MDR1 gene expression levels could be of predictive value for the occurrence of severe adverse drug reactions and/or the development of MDR during chemotherapy for lymphoma in dogs.     

不同氮能比饲粮对妊娠环江香猪脐带血管发育相关基因表达的影响

本试验旨在研究不同氮能比饲粮对妊娠环江香猪脐带血管发育相关基因表达的影响。选用首次妊娠的环江香猪48头,根据体重随机分为2组,每组8个重复(栏),每个重复3头猪。配种后分别饲喂高氮能比饲粮[消化能(DE)为14.73 MJ/kg,粗蛋白质(CP)含量为13.11%,氮能比为0.89]和低氮能比饲粮(DE为12.24 MJ/kg,CP含量为9.77%,氮能比为0.80)。分别于妊娠第45、75和110天每栏取1头母猪,处死屠宰,收集每窝中最大体重、平均体重和最小体重胎猪对应的脐带,利用实时荧光定量PCR方法检测血管发育相关基因——成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)和内皮型一氧化氮合酶(e NOS)的表达量。结果表明:与低氮能比饲粮组相比,高氮能比饲粮显著上调了脐带血管发育相关基因的表达量(P0.05),包括妊娠45 d最大体重胎猪的VEGF和VEGFR2表达量,平均体重胎猪的VEGF表达量;妊娠75 d最大体重胎猪的VEGF、VEGFR2和e NOS表达量,平均体重胎猪的VEGF和e NOS表达量,最小体重胎猪的VEGFR2表达量;妊娠110 d最大体重胎猪的FGF、VEGFR2和e NOS表达量,平均体重胎猪的FGF和VEGFR2表达量,最小体重胎猪的VEGF和e NOS表达量。不同妊娠期相同标准体重、同一妊娠期不同标准体重胎猪的脐带血管发育相关基因的表达量均存在差异。由此可见,高氮能比饲粮可能由于其蛋白质和氨基酸水平较高而显著上调了妊娠环江香猪脐带血管发育相关基因的表达量,不同妊娠期或同一妊娠期不同标准体重胎猪的脐带血管发育相关基因的表达量也存在差异。     

弓形虫不同发育时期棒状体颈部蛋白5基因的表达研究

为探究不同发育时期弓形虫棒状体颈部蛋白5（Toxoplasma gondii rhoptry neck protein 5,TgRON5）基因的表达情况与其毒力的相关性,本试验以Ⅱ型弓形虫PRU虫株作为研究对象,以弓形虫管家基因ACT1作为内参基因,分别对目的基因和内参基因设计特异性引物,通过对各基因建立标准曲线,确定二者扩增效率的一致性后,采用实时荧光定量PCR相对定量法对弓形虫4个不同发育时期（速殖子、缓殖子、未孢子化卵囊及孢子化卵囊）中TgRON5基因的表达情况进行检测与分析。结果显示,TgRON5基因在弓形虫各发育时期均有表达,其中,孢子化卵囊表达水平最高,未孢子化卵囊次之,速殖子较低,缓殖子最低,表明RON5蛋白的合成与分泌与虫体入侵宿主细胞的侵袭力有着密切的关系。本研究结果为阐明TgRON5蛋白参与弓形虫入侵的机理奠定了基础。